Глава 5.

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ВИРУСОВ, КЛЕТОК И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ

Генетика — наука о наследственности прошла сложный путь своего развития; фактические данные и обоснованные гипотезы в ней были, к сожалению, использованы даже для утверждения таких социально-политических доктрин, которые противоречили науч- ным истинам, этике и здравому смыслу (например, попытка обос- нования превосходства одних рас людей над другими; полное отрицание генов как якобы надуманных, "мифических" и несуще- ствующих структур в зародышевых клетках любых организмов; доминирующую зависимость наследственности от условий внеш- ней среды обитания того или иного вида; отрицание внутривидовой борьбы и признание межвидовой в параллели с борьбой классов в человеческом обществе, и т. д.). Подобные грустные страницы в истории генетики канули в вечность и этому помогло выдающееся событие в науке, когда Дж. Уотсон и Ф. Крик в 1953 г. расшифро- вали двойную спираль ДНК и подвели материальную базу подранее упомянутый "мифический" ген — материализация гена. С тех пор прошло более 40 лет, и трудно охватить все области генетической науки, где бы ни были сделаны открытия или которые не получили бы мощного стимула для своего развития, включая современную биотехнологию. Однако на фоне всех достижений в течение последних 20 лет, нельзя забывать о том, что М. Фишер еще в 1868 г. открыл нуклеин, Ф. Гриффит в 1928 г. описал явление трансфор- мации у бактерий, а О. Т. Эйвери, К. М. Мак-Леод и М. Мак-Карти в 1944 г. доказали, что трансформирующим агентом является ДНК; Ж. Ледерберг в 1947 г. открыл процесс конъюгации у Е. соП, а позже было доказано, что спаривание клеток бактерий обусловле- но генетически.

К времени расшифровки ДНК Э. Чаргафф (1950) уже сформу- лировал свои правила, согласно которым: 1) число оснований с аминогруппами в шестой позиции равно числу оснований с кетог- руппами в той же позиции, то есть А (аденин) + Ц (цитозин) = Г (гуанин) + Т (тимин); это единственное правило, приложимое к ДНК и к большинству типов РНК, в которых Т заменен на У (урацил);

2) молярное содержание аденина равно молярному содержа- нию тимина (А=Т или А/Т= 1);

3. молярное содержание гуанина равно молярному содержа- нию цитозина (Г=Ц или Г7Ц= 1);

4. сумма пиримидиновых оснований равна сумме пуриновых оснований, то есть Ц+Т=А+Г (Пир/Пур= 1);

5. у бактерий отношения А/Т и Г/Ц близки единице, тогда как отношение А/Г изменяется в интервале 0,4—2,7. Интервал изме- нения А/Г для растений (1,1—1,7) и животных (1,3—2,2) меньше, чем для ДНК бактерий. По соотношению нуклеотидов выделены АТ-тип ДНК, когда А+Т > Г+Ц, или ГЦ-тип ДНК, когда Г+Ц > А+Т.

Последующие успехи в области генетики нарастали исключи- тельно быстро: в 1956 г. А Корнберг выделил ДНК-полимеразу, в 1961 г. М. Ниренберг предложил подходы и сам участвовал в расшифровке генетического кода, в 1964 г. осуществлен первый синтез полирибонуклеотидов (X. Г. Корана), в 1965 г. В. Арбер открыл ферменты-рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеа- зы, в 1969 г. Дж. Бекуит с сотрудниками выделил из кишечной палочки лактозный оперон, в 1970 г. Г. Темин и Д. Балтимор открыли ревертазу, или обратную транскриптазу, в 1972 г. П. Берг с сотрудниками выполнили первый генно-инженерный экспери- мент — объединили ДНК П-плазмиды (плазмида множественной устойчивости к лекарственным веществам) с ДНК мушки дрозо- филы и размножили рекомбинант в кишечной палочке. В 1975— 1978 гг. ученые овладели методами выделения из хромосомной и плазмидной ДНК любых генов и исследования их структуры (У. Гилберт, Р. Дейвес, Ф. Курильский, П. Ледер, А. Максам, Т. Манниатис, Б. Мах, Ф. Ружон, Ф- Сэнгер, С. Тонегава).

Каждый год удваивается число прочитанных генов у разных организмов, которое собирается в банках данных. Эти банки накопили уже порядка 2,5 • 10⁸ пн суммарного текста, пользование которым стало возможным лишь с привлечением ЭВМ.

В 1976 г. была основана фирма "Генентек" в г. Сан-Франциско (США),* а в 1977 г. в этой фирме был осуществлен синтез челове- ческого соматотропного гормона — соматостатина клетками Е. соН в ферментаторе объемом 8 л.; в 1978 г. там же был получен гормон инсулин при выращивании Е. соИ в глубинных условиях. В начале 80-х годов так же с помощью Е. соЦ были получены эндорфины (эндогенные пептиды мозга с подобным морфину действием). В 1980 г. в компании "Биоген" (США) впервые получили с помощью биосинтеза (продуцент — кишечная палочка) интерферон.

Таким образом, расшифровка строения ДНК стала эпохальным

156

событием не только в генетике, но и в биологии в целом. Общая генетика и общая биология обогатились фундаментальными дан- ными по строению и составу ядерного аппарата, по углублению подходов к пониманию эволюции жизни на Земле, по изменчиво- сти и наследственности организмов и по другим направлениям. Частные генетика и биология (например, микроорганизмов, рас- тений, животных) получили почти неограниченные возможности манипулировать с генетическим материалом, определять механиз- мы и диапазон его контролирующих функций в процессах мета- болизма.

Биологическая технология как пограничная научная дисципли- на с 1972 г. перешла на новый генотехнический уровень (см. главу 1), когда методы генной инженерии были перенесены из лабора- торных условий в производственные — получила развитие реком-^ бинантная АНК-биотехнология. или сокращенно рДНК-биотехно- логия. По существурДНК-биотехнологиябазируетсянаприродных возможностях наследственных структур различных представите- лей живого мира, даже когда приходится вводить чуждую реципи- енту, но воспринимаемую им генетическую информацию. Такая рецепция генетического материала и определяется природными возможностями реципиента.

5.1. Природа и передача генетической информации. Исходя их установленных данных о том, что ДНК, в силу комплементарности нуклеиновых оснований, представляет собой двойную спираль, что в бактериальных клетках эта спираль кольцевидно замкнута и составляет единственную хромосому, что в клетках любых орга- низмов имеются механизмы синтеза и гидролиза ДНК с помощью специфических ферментов, и, наконец, что процессы размножения обусловлены и непосредственно связаны с функцией ДНК микро- организмов или зародышевых клеток макроорганизмов, целесооб- разно расширить представление о ядре и ядерном аппарате клеток, считая первое составной частью второго. В таком случае к ядерному аппарату должны быть отнесены все те структуры, которые обес- печивают его запрограммированные функции — у прокариот: нуклеоид. рапидосомы (у некоторых видов), перегородочные ме- зосомы, рибосомы; у эукариот: ядро, ядрышко, нуклеолемма, по- росомы, центриоли, митотический аппарат, рибосомы.

Биохимическим выражением наследственности является мат- ричный синтез специфического белка согласно уточненному прин- ципу Дж. Бидла и Э. Тейтама "один ген — одна белковая молекула".

157

Матричный синтез подразделяют на ре- пликацию, транс- крипцию и трансля- цию. На уровне транс- крипции (по крайней мере, у прокариот) осуществляется в ос- новном контроль экс- прессии генов, а у эукариот — и на уров- не трансляции.

.При матричном синтезе матрицей вы-

ступает одна из нитей ДНК, "слепок" с кото- рой — комплементар- ная матричная (ин-

формационная) РНК, или мРНК, обеспечивает синтез белковой молекулы в рибосомах с участием транспортных РНК (тРНК) и соответствующих ферментов — полимераз. Участок мРНК, комп- лементарный участку смысловой цепи ДНК, называется транс- криптом.

Показанная на рис. 51 схема синтеза белковой молекулы в действительности значительно сложнее. Вспомним, что среди по- следовательно расположенных генов в хромосоме имеются гены — регуляторы, операторы, структурные, терминаторы, и что каж- дая хромосома представлена одной молекулой ДНК. Поскольку хромосомы в клетках находятся в незамкнутом состоянии, постоль- ку у них имеются 3' и 5' свободные концы, которые отсутствуют в единственной кольцевидно замкнутой хромосоме прокариотиче- ской клетки или организованной вирусной частицы (таблица 17).

Различают следующие формы ДНК по архитектонике двойной спирали: В, А, С, 2 и 5В5. В форме В на шаг спирали (3,4 нм) приходится 10 пн (пар нуклеотидов), располагающихся перпенди- кулярно к оси спирали; форма А является трансформантом формы В при снижении влажности ее ниже 75%; шаг спирали уменьшается до 2,8 нм, на виток приходится уже 11 пн, располагающихся под углом 20° к оси спирали, а длина цепи укорачивается примерно на 25%. Форма С имеет шаг спирали, равный 3,3 нм и на один виток

м

''■■Я

Примечание: кЪ-килооснования (от англ. кйоЬавев).

ее приходится 9 пн. Форма 2 (зигзаг) присуща углеводно-фосфат- ному остову ДНК в участке с чередующимися последовательностя- ми гуанина (Г) и цитозина (Ц). Это левая спираль (все предыдущие формируются в виде правых спиралей) с 12 пн в одном витке. Форма 5В5 (от англ. 51с1е Ъу зМе — бок о бок) лишена взаимозак- рученности цепей в двойную спираль, что важно для биосинтеза ДНК.

Названные выше гены в хромосомной ДНК обладают специ- фическими функциями (средний размер гена оценивают в 1500 пн). Ген-регулятор определяет синтез белка-репрессора, способно- го связываться с оператором (см.) на ДНК или с РНК, предотвращая соответственно транскрипцию или трансляцию. Ген-оператор — участок ДНК, связываясь с которым белок-репрессор предотвра- щает инициацию (начало) транскрипции на прилежащем промо- торе, ответственном за связывание фермента РНК-полимеразы, инициирующей транскрипцию гена. На промоторе гена эукарио- тической клетки имеется специфический локус (участок), в десят- ки—сотни тысяч раз повышающий число посадок РНК-полимера- зы на промотор ближайшего гена. Этот локус называется энхан- сером, или усилителем (от англ. еппапсег — усилитель). Энхансеры тканеспецифичны. Они представляют собой большую разнообраз- ную группу регуляторных элементов клетки. Другими словами это элементы позитивного контроля. К элементам негативного конт- роля относятся сайленсеры (от англ. вНепсег — глушитель), угне- тающие транскрипцию. Энхансеры и сайленсеры обладают только цис-действием, влияя на гены, локализующиеся на той же молекуле

159

З'ОН

ДНК, где располагают- ся названные элемен- ты.

Структурные гены ответственны за син- тез белковых молекул (рис. 52). Ген-термина- тор блокирует транс- крипцию и прерывает синтез белка. К этому гену примыкает тер- минатор (стоп-сигнал), состоящий из опреде- ленной последователь- ности нуклеотидов в ДНК. У Е соН он эф- фективен только в присутствии р-факто- ра белковой природы с ММ 50 кДа, не свя- занного с РНК-пол-

имеразой. В терминации у Е. сои участвует и другой белок, названный к-частицей.

Оперон — это группа сцепления структурных генов, находя- щихся под контролем гена-оператора и гена-регулятора, а также контролирующих элементов, узнаваемых продуктами регулятор- ного гена. На рис. 52 изображена схематичная структура гена прокариотической клетки. В его состав входят участки, располо- женные перед кодирующей последовательностью (лидерная 5'-об- ласть) и после нее (концевая З'-область); синтез мРНК происходит в направлении от 5'-конца к З'-концу. Отсчет нуклеотидов в генах ведут от первого транскрибируемого нуклеотида, обозначаемого как +1 (или 1); отсчет в противоположную сторону начинают с —1. Нд и РЪ на рисунке обозначают консервативные последова- тельности Хогнесса и Прибноу соответственно. Первая из них представляет собою гексамер 5'ТТГАЦАЗ', локализующийся около координаты —35. Последовательность Хогнесса необходима для узнавания промотора РНК-полимеразой. РЪ-последовательность является также гексамером 5'ТАТААТЗ', локализующимся около координаты —10. Эта последовательность необходима для тесного связывания с РНК-полимеразой. За ней закрепилось название

160

"ТАТА-Ьох", или "ТАТА-блок". Ядром последовательности (Шай- на—Далгарно) служит тетрамер 5'АГГАЗ' на мРНК, являющийся местом (сайтом) связывания рибосом. Всего в 5Б=последователь- ности имеется 5—9 нуклеотидов.

В ДНК некоторых прокариот (археобактерии), в ядре и мито- хондриях эукариот кодирующие области прерываются большими некодирующими ДНК-последовательностями (до 5000 пар нуклео- тидов). По предложению У. Гилберта (1978) кодирующие области называют экзонами, или доменами, некодирующие — нитронами. Например, в генах тяжелой Н-цепи иммуноглобулинов (1д) нахо- дится не менее 4 интронов и 5 экзонов, в гене яичного белка (овальбумина)7 интронов и 8 экзонов; из 3,5 биллионов пар нук- леотидов в ДНК гаплоидного генома человека кодирующими явля- ются менее 10%. Прерывистость генов у эукариот — явление обычное, хотя известны гены, в которых подобная прерывистость не обнаружена (в генах интерферона, гистонов).

В интронах отсутствует более или менее заметная гомология между двумя концами их, а на границах с экзонами в разных генах присутствует так называемая каноническая (усредненная) после- довательность нуклеотидов (относительно короткая) — нередко СТ—слева и АС—справа:

КП КП

i -| i 1

аб4с7зсюот100аб2аб8тбз ... 6Ру74—-87 ИСббАшоСю 0 N

I 11 ф , I I

экзон интрон экзон

КП обозначает каноническую последовательность, цифры — проценты случаев обнаружения

основании на границе экзон-ин- ; хишхд5ашашхишадтаиаоо'^^

ТрОН. ^Г |1 ^л

Экзоны во много раз меньше _г—,-.--<-„

(1000 пн) интронов. Интрон пред- ^п \ \ | п \ /' /' ставляет собой транскрибируе- Х_г -^\| _ У

мый (но не кодирующий) участок ^ш !'.,!!

ДНК, который удаляется из со- ^ ^^^^^ става транскрипта при сплайсин- ге (от англ. врпстд — сплетение, Рис. 53. Сплайсинг (процессинг) РНК: 1 сшивание). Сплайсинг протекает — транскрипция, 2 — трансляция, а, б, в ядре, и он заканчивается объе- ^в — экзоны, г, д — интроны,-1 — днк, динением экзонов в зрелую п РНК, ш мРНК, IV Белок. мРНК (рис. 53). Участок ДНК между правым концом интрона и левым концом экзона называется акцепторной точкой сплайсинга. В ДНК митохондрий интроны кодируют синтез отдельных белков,

6 т. 8524 ¹⁶¹

которые сами могут участвовать в последующем вырезании нит- ронов. Некоторые молекулы белков (ферментов) кодируются од- новременно экзонами и интронами, например, матураза (от англ. тайне — созревать). Возможно, что для каждого интрона сущест- вует своя матураза. Интроны митохондриальной ДНК похожи на бактериальные транспозоны и, возможно, матуразы происходят из транспозаз (см.).

Утверждается, что существуют белки, кодируемые ядерными экзонами и интронами (м-белки), которые принимают участие в

образовании и перено- се мРНК через ядер- ную мембрану (П. П. Слонимский, 1980). При этом часть белка, кодируемая интроном, включает преимуще- ственно гидрофобные аминокислоты, вслед- ствие чего охотно ло- кализуется в богатой липидами ядерной мембране и притяги- вает мРНК. Часть м- белка, кодируемая эк- зоном, притягивает но-

вую полипептидную цепь, транслирующуюся с того же экзона. На уровне ядерной мембраны находится ферментный комплекс сплай- синга нитронов. По мере прохождения сплайсинга зрелая мРНК (без интронов)выводится через пору ядерной мембраны (рис. 54).

В процессе дифференцировки эукариотических клеток обна- ружена неоднотипность сплайсинга, а именно то, что в одном случае предстает интроном, в другом может оказаться экзоном, и наоборот. В частности, доказано, что интрон цитохрома Ь - это экзон, кодирующий матуразу. Следовательно, существуют гены, способные кодировать не один белок. Например, один из генов тканевой совместимости кодирует 2 белка; один из прерывистых генов крысы кодирует синтез парат-гормона в паращитовидной железе и нейропептида — в гипофизе. Поэтому нельзя абсолюти- зировать понятие "один ген — одна белковая молекула". В биохи- мической технологии интроны привносят определенные затрудне- ния при экспрессии (проявление, выражение свойств) эукариоти- ческих генов в клетках многих прокариот, лишенных аппарата сплайсинга мРНК.

Некоторые из нуклеотидных фрагментов входят не только в состав интронов, или фланкирующих (от англ. Яапк — бок, сторона, прикрывать с фланга) последовательностей мРНК, но и могут выполнять функции сигнальных последовательностей, узнаваемых белками (промоторы транскрипции, точки начала ре- пликации ДНК, сайты скручивания хромосом и др.). Все эти сигнальные последовательности, повторяющиеся в геноме в виде идентичных или сходных тандемных (от англ. 1апбет — гуськом, цугом) копий, имеют небольшую длину. При разделении ДНК в градиенте плотности хлористого цезия сигнальные последователь- ности (порядка 5%) удается отделять от основной массы ДНК в виде сателлитной ДНК (дополнительный(е) пик(и) при центрифу- гировании). Эти ДНК могут быть тяжелее или легче основной фракции ДНК и могут быть метилированными. Множество тан- демных повторов в сателлитной ДНК придает ей определенную аномальность при центрифугировании (сходство поведения с ос- новной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия). В таких случаях говорят о криптической (от лат. сгурШв — скрытый) сателлитной ДНК.

Установлено, что высокоповторяющиеся последовательности в сателлитных ДНК обычно не транскрибируются. Следует отметить, что сателлитные ДНК локализуются в области центромеры хромо- сомы (выполняет структурную функцию). Предполагается, что сателлитные ДНК произошли от мозаики последовательностей, состоящих из 9 пн в трех повторах:

В начале 80-х годов в геноме человека были А ТСА обнаружены последовательности ДНК, обладаю- СААА А щие свойствами структурного полиморфизма — Т АСТ _{это Т}ак называемые гипервариабельные области (ГВО), обычно содержащие короткие, ГЦ-обога- щенные и тандемно повторенные единицы. ГВО рекомендуются в •качестве маркеров-зондов при картировании генов. Варианты кор-последовательности ГВО гена человеческого миоглобина были названы минисателлитными.

В 1985 г. был предложен метод "генетической дактилоскопии — ДНК" (от греч. йасШоз — палец, всорет — смотреть) в целях оценки эволюции человека по отцовской и материнской линиям (А. Дж. Джеффрис, У. Уилсон, С. Л. Тейн). В последовательностях ДНК отражаются происшедшие в прошлом мутации или, по Ф. Крику, "замороженные события". Это, в частности, поможет кар- тировать варианты последовательностей в локусе минисателлит- ной ДНК. Эволюцию по женской линии удобно картировать по

163

митохондриальной ДНК, так как в сперматозоидах практически нет митохондрий, но ими "начинены" яйцеклетки. Вот почему ДНК клеточного ядра является сочетанием материнской и отцовской ДНК, тогда как ДНК митохондрий передается только яйцеклеткой. Отсюда становится понятным, почему в конце 70-х годов текущего столетия возникла новая научная дисциплина молекулярная ант- ропология.

В ДНК различных организмов содержатся еще так называемые палиндромы (от греч. раКпатоте — перевертыш) — последова- тельности, повторяющиеся в обратном порядке:

Б

В суперспирализованном состоянии длинные палиндромы (10 и более пар оснований) образуют крестообразные структуры, служащие сигналами для узнавания определенных участков ДНК ферментами-метилазами, рестриктазами и регуляторными белка- ми, регулирующими действия генов.

В хромосомных ДНК прокариотических и эукариотических клеток имеются также контролирующие или так называемые "прыгающие" подвижные гены — транспозоны (Тп), впервые открытые Б. Мак-Клинток в 1940 г. у кукурузы. Они находятся на значительном расстоянии от других генов, на которые оказывают влияние. Благодаря мутациям, названным "транспозонными взры- вами", возможно массовое и в известной мере направленное перемещение генетических элементов. Транспозоны способны реплицироваться и внедряться (инсерция) в виде одной из копий в новое место генома (ДНК ядра). У бактерий преобладающая часть транспозонов кодирует фермент транспозазу, катализирующую реакцию встраивания транспозона в ДНК. В последнее время их отождествляют с интронами, рассмотренными выше.

При сравнении последовательности нуклеотидов в хозяйской ДНК до и после встраивания транспозона оказывается, что не- сколько нуклеотидов этой ДНК после встраивания удваиваются — дуплицируются. Эти дупликации ДНК окаймляют транспозон.

164

Причем, для каждого транспозона характерно определенное коли- чество дз/плицированных нуклеотидов. Принято считать, что при встраивании транспозонов хозяйская ДНК перед этим фермента- тивно расщепляется с образованием липких концов, к выступам которых присоединяется транспозон, а оставшиеся бреши затем заполняются нуклеотидными последовательностями, в результате чего и образуются небольшие дупликации.

Следует подчеркнуть, что транспозонов много и они различны (лишь перечень Тп-ов у дрозофилы составит целую книгу). Следо- вательно необходима точная классификция их, и, возможно, в недалеком будущем удастся ее создать.

К настоящему времени принято считать, что механизм транс- позиции заключается в удвоении подвижных элементов и после- дующем встраивании одной из копий транспозона в новое место генома, а другая копия остается в прежнем месте. Вот почему термин "транспозиция" неточен, поскольку транспозон не покида- ет своего первоначального места, или сайта. Более правильно рассматривать транспозицию процессом, в результате которого возрастает число копий транспозона. Во благо сохранения струк- туры генома (консерватизма его) транспозиции происходят очень редко. Так, в среднем, частота их сравнима с частотой спонтанных мутаций, то есть 10"⁵—10"⁷ на поколение, а частота реверсии путем делеций, или выпадений, отмечается еще реже (10"⁶—10"¹⁰).

Обращает на себя внимание тот факт, что Тп сор1а из мушки дрозофилы ведет себя и как транспозон, и как ретровирус (к их числу, кстати сказать, относится вирус иммунодефицита человека — причина СПИД). В та- ких вирусах интеграция ДНК осуществляется способом, сходным с I

транспозицией. Поэтому | , | ,

небеспочвенной стала ■ 1— - I

I 1 .

гипотеза о том, что виру- г* ■ »4

сы — это транспозоны,

приобретшие ДОПОЛНИ- ^ ⁵^ Встраивание транспозона в ДНК-мишень ^ " " (схема): 1 — транспозон. 2 — центральная часть,

тельные функции ИЛИ, з — концевые повторы, 4 — дупликация ДНК-ми- напротив, транспозоны шени.

— это выродившиеся вирусы. Проблема остается открытой. Тем не менее, обнаружены самые короткие транспозоны, кодирующие

белки, которые участвуют только в транспозиции. Сле- довательно ДНК таких транспозонов можно отне- сти к разряду "эгоистиче- ской", работающей лишь на себя, то есть она функцио- нирует во имя собственного размножения.

Схематичное встраива- ние транспозона (после ре- пликации) в ДНК-мишень изображено на рис. 55. Репликация, или самоудвоение присуще ДНК и РНК, то есть в таких случаях происходит перенос генетической информации соответственно от ДНК к ДНК или, например у ряда вирусов, от РНК к РНК. Репликация осуществляется полуконсервативным способом, когда двухспиральная ДНК деспирализуется и каждая нить индуцирует синтез комплементарной себе нити при участии ДНК- или РНК-полимеразы.

Геномы бактерий и фагов реплицируются как единое целое, то есть как организованные единицы репликации, или репликоны. Каждый репликон содержит место (точку) инициации Оп (от англ. опдт — начало) — ориентированное направление репликации, например ОпС у ЕвспепсЫа соИ (рис. 56). В некоторых репликонах содержится около 240—600 пн. В отдельных репликонах сущест- вует два Оп, например, в так называемых челночных векторах, способных реплицироваться в клетках прокариот и эукариот. Инициация репликации осуществляется с помощью специфиче- ских белков.

Репликация ДНК необходима функционирующей клетке для восстановления (репарации), обмена генами между участками хромосом (рекомбинация) и перемещения генов (транспозиции).

В течение однократного деления прокариотической или эука- риотической клетки, независимо от числа хромосом в ней, весь геном ее реплицируется также один раз, и только после завершения репликации может произойти последующее деление. Удвоенный геном подразделяется (сегрегирует) поровну в каждую дочернюю клетку. Единицей сегрегации является хромосома, а единицей репликации — репликон. Кроме точки Оп в репликоне имеется

166

у /

Репликацият одяонаправ- I ленная \

4

т(Репликация I может про- I исходить в 4 обратном направлении',

Репликация ^ ^

двунаправ- \ д |

ленная

Рис. 57. Две репликационные вилки в ДНК: 1 и 3 — нереплицированная ДНК, 2 — репликаци- онный глазок, 4 — стационарная точка начала, 5 — движущаяся репликационная вилка, 6 — две репликационные вилки.

также точка (место) оста- новки репликации 1ег (от лат. 1егттаЦ5 — конечный, пограничный). Единицы сегрегации и репликации в бактериальной хромосоме совпадают, поскольку бак- териальная хромосома со- держит только один репли- кой. В то же время каждая плазмида, если она имеется в бактериальной клетке, представляет собой авто- номную кольцевидную ге- нетическую структуру и является самостоятельным репликоном.

Плазмиды, представленные в бактериальной клетке лишь в одной копии, называются однокопийными, другие плазмиды, пред- ставленные более чем одной копией, называются многокопийны- ми.

В эукариотической клетке содержится большое число репли- конов и единица сегрегации у них включает много единиц репли- кации. Все компоненты аппарата ре- пликации называют реплисомой. Ре- пликация ДНК начинается в стартовой точке, или репликационной вилке, в одном (однонаправленная реплика- ция) или в двух противоположных (двунаправленная репликация) на- правлениях. В последнем случае будет две репликационных вилки (рис. 57). Реплицированная часть ДНК приобре- тает форму "глазка", представляюще- гося 6-структурой.

(Точка

■5'Вытесняемая цепь

Рис. 58. "Катящееся" кольцо мат- ричной цепи.

В случае кольцевой матричной структуры ДНК точка роста одной раз- резанной цепи спирали "скользит" вокруг второй кольцевой матричной цепи. Возникает структура катящегося кольца (рис. 58).

Рост клеток бактерий и репликация ДНК в них тесно связаны между собой.

Цикл клеточного деления на примере Е. соН можно представить двумя временными интервалами, обозначаемыми латинскими бук- вами С и О. Первая из них обозначает фиксированное время, необходимое для репликации всей бактериальной хромосомы (на- пример, 15 мин.), что соответствует скорости движения отдельной

Тачка начала -. 35/0 гКонцевая точкл

30

_(г

_\

_Г"

25

\

20 15

Рис. 59. Цикл деления Е. сои — образование хромосомы со многими вилками в процессе репликации (а — инициация, б — деление, в — терминация); цифры обозначают минуты кле- точного цикла.

репликационнои вилки с присоединени- ем около 50000 пар оснований в 1 мин.; О соответствует промежутку времени (порядка 20 мин.) между завершением репликации ДНК и делением клетки — это как бы накопительный период. Сле- довательно, весь так называемый корот- кий клеточный цикл деления Е соИ ук- ладывается в среднем в 35 минут (рис. 59).

Длинный цикл клеточного деления наблюдается тогда, когда велико время до начала инициации. Для диплоидных клеток эукариот характерно митотиче- ское деление ядра с последующим обра- зованием новых (дочерних) клеток. Этот митотический цикл подразделют на 4 фазы: Сь 5, С2 и М. Фаза С1 обозначает время роста клетки до синтеза ДНК (от англ. дар — пробел); в фазу 3 происходит синтез ДНК (от англ. зуп1пе81з); Сг — вторая фаза роста в период, после синтеза ДНК; М — фаза митоза (от англ. ту1о518). На рис 60 представлена схема цикла эукариотических клеток с обозначением продолжительности фаз в культивируемых линиях дрожжевых клеток БсЫховасспаготусев ротЬе и клеток млекопитающих. На весь цикл деления клеток эукариот усредненно приходится следующая доля времени: на

1 г

Рис. 60. Схема цикла клеточного деления эукариотических клеток: 1 Зсщгозасспаготусев ротЬе, 2 — клетки млекопитающих.

фазу С1 — 30—40%, на фазу 5 — 30—50%, на фазу С? — 10—20 на фазу М — 5—10%.

За время движения репликационных вилок в клетках эукариот присоединяется от 1000 до 3000 пн в 1 минуту — у млекопитающих и до 1000 пн/мин — у растений (здесь не исключается роль пониженных температур для размножения клеток растений).

Синтез комплементарных цепей во время репликации двухни- тевой ДНК у прокариот и эукариот катализируется ферментами, называемыми ДНК-полимеразами. Их известно 3 (ро! I, ро1 II и ро1 III у прокариот; а, Ь и у - у эукариот). Характеристика ДНК-по- лимераз приведена в таблице 18.

Таблица 18. Характеристика прокариотических и эукариотических ДНК- полимераз

ДНК-полиме- раза			Размер, кДа	Состав	Ферментативная активность
из клеток Е. соИ:			109	одна цепь	а) элонгация в направлении 5' -» 3' от 3' - ОН - затравки б) 3' -» 5' - экзонуклеаза в) 5' —» 3' - экзонуклеаза
	I
	II		120	—	см. для I б) 3' -> 5' - экзонуклеаза
	III		250	гетеромуль- тимер	а - в) см. для I
из клеток млекопита- ющих:			110-120	несколько субъединиц	репликативный синтез ядерной ДНК (ядерная ДНК- репликаза) - 80%
		а
		Р	45	1 субъединица	репарация сегментов поврежденной ДНК
		У	60	?	репликативный синтез митохондриальной ДНК - 2-15%

На раскрученной ДНК происходит непрерывный синтез веду- щей цепи в направлении 5' —> 3', тогда как на комплементарной цепи имеет место прерывистая репликация, то есть в направлении

169

5' —> 3' на ней синтезируется серия фрагментов ДНК (фрагменты Оказаки), которые затем соединяются, формируя отстающую цепь (рис. 61). Фрагменты Оказаки содержат примерно 1000—2000

ТЦАГАГТТАЦГ Г АГУЦУЦААУГЦ

Р

Р

^НТ

Рис. 61. Фрагменты Оказаки, присоединенные к РНК — инициатору: а — матричная ДНК, б — комплементарная ДНК, в — РНК—праймер, НТ—входящий нуклеозид- трифосфат.

нуклеиновых оснований, и синтез фрагментов под каталитическим действием ферментов РНК-полимераз, включая праймазу (ММ-60 кДа), инициируется РНК—затравками, каждая из которых по длине соответствует приблизительно 10 основаниям. РНК—затравка уд- линяется под действием ДНК-полимеразы III, катализирующей синтез цепи ДНК. РНК удаляется под действием ферментов экзо- нуклеаз.

В так называемую затравочную реакцию вовлекается комплекс белков — праймосома. Например, праймосомный белок 88В свя- зывается с одноцепочечной ДНК, стабилизируя ее; белок Опа В образует предпраймерную РНК и участвует в передвижении прай- мосомы; белок Опа С действует в комплексе с Опа В; белок Уд сшивает разрывы между фрагментами Оказаки; белок п'-АТФ-аза, белки п и п" образуют предзатравочную РНК, и др.

Предполагают, что праймосома собирается в каком-то одном участке с последующим перемещением по одноцепочечной ДНК к сайтам.тде инициируется синтез затравки. Направление движе- ния праймосомы противоположно направлению синтеза ДНК от- стающей цепи, но синхронно движению репликационной вилки.

По расчетным данным репликация ДНК у прокариот (вместе с

170

раскручиванием молекулы по 10 нуклеотидных пар одномоментно) должна происходить со скоростью 400 ООО оборотов в секунду, что явно превышает реальную скорость репликации. Поэтому было предположено, что должны существовать фиксаторы, включающи- еся в молекулы ДНК у всех организмов. Такие фиксаторы были обнаружены. К ним относятся ферменты — топоизомеразы. От- дельные из них катализируют реакции объединения молекул ДНК в зацепленные кольца — катенаны, топоизомераза II, или гираза, катализирует суперспирализацию ДНК, топоизомераза I способна разрезать одну из цепей суперспирализованной ДНК, при этом цепи раскручиваются и число супервитков уменьшается, после чего этот же фермент устраняет разрыв в нити ДНК.

Двигателем в распределении реплицированных молекул ДНК по дочерним клеткам (по крайней мере - у прокариот) выступает клеточная мембрана, к которой прикрепляется ДНК.

Таким образом, весь катализируемый ферментами процесс репликации ДНК можно подразделить на 3 этапа: инициацию, элонгацию (рост цепи) и терминацию. В процессе инициации происходит разделение нитей ДНК с образованием репликацион- ной вилки, формирование праймосомы и синтез затравочной РНК. Этап роста цепи, или элонгации, реализуется в синтезе ДНК с помощью ДНК-полимераз. Терминация, или окончание синтеза ДНК, происходит благодаря выключению реакции с помощью специфического "стоп-сигнала" от специального кодона (термина- тора) в матричной цепи.

Такие же 3 этапа выделяют в процессах транскрипции и трансляции ДНК.

Транскрипция — это процесс переписывания закодированной в ДНК информации и перенос ее к месту синтеза белка (на рибосомы). Этап инициации при транскрипции заключается во взаимодействии РНК-полимеразы с ДНК-матрицей; элонгация - в ферментативном синтезе мРНК на матрице ДНК; терминация — в остановке синтеза мРНК благодаря "стоп-сигналу" от гена — терминатора.

Трансляция заключается в переводе закодированной в мРНК информации в полипептидную цепь. Организующими центрами процесса трансляции являются рибосомы. При трансляции на этапе инициации происходит активация аминокислот с помощью ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) при использовании энергии АТФ с последующим образованием комплекса инициации, включающего 3 фактора инициации (1Р-1, 1Р-2, 1Р-3 — у прокариот, е1Р-2, е1Р-3, е1Р-5 и др. — у эукариот), мРНК,

гуанозилтрифосфат (ГТФ) и 303(403) — субчастицу рибосомы. Указанный комплекс соединяется с 505(608) — субчастицей рибо- сомы и формирует функциональную 703 (808) рибосому. На этапе элонгации в ходе трансляции осуществляется синтез полипептид- ной цепи функционирующей рибосомой с участием факторов элонгации (ЕР-Ти, ЕР-Тв, ЕР-С — у прокариот; ЕР-1 и ЕР-2 — у. эукариот). Указанные факторы не входят в структуру рибосом, а присоединяются к ним на определенных этапах.

Во время синтеза белка рибосомы движутся вдоль мРНК, последовательно считывая триплеты и поэтапно наращивая по- липептидную цепь. У мРНК, как правило, имеется постоянная рамка считывания — кодон АИС. При элонгации одна мРНК связывается с несколькими рибосомами, образуя функционирую- щий комплекс - полирибосомы, или полисомы. Из указанных трех этапов с наибольшей скоростью протекает элонгация. Терминация процесса трансляции осуществляется стоп-кодоном в мРНК.

Как следует из представленных выше данных РНК занимает место посредника между ДНК и белком. Причем эта центральная функция присуща мРНК, тогда как тРНК и рРНК являются транс- криптами, обладающими активностью как завершенные в постро- ении и функции молекулы. Исключение представляют некоторые РНК — содержащие вирусные геномы, по матрице которых син- тезируется РНК, причем реализация генетической информации может осуществляться по схемам: для одних вирусов, у которых отсутствует транскрипция, РНК —> Белок (вирус полиомиелита и др.), для других, располагающих собственной вирионной РНК — зависимой РНК-полимеразой, или вирионной транскриптазой, РНК -> РНК -> Белок (вирусы гриппа, кори и др.), и, наконец, для третьих — РНК -> ДНК -» РНК -» Белок (ретровирусы, в том числе — ВИЧ, или вирус СПИД).

мРНК, рРНК и тРНК у бактерий синтезируются под каталити- ческим действием одной и той же РНК-полимеразы (ММ-480 кДа). В клетках эукариот обнаружены три ядерные РНК-полимеразы (I, II и III), а также РНК-полимеразы митохондрий и хлоропластов. Установлено, что РНК-полимераза I, находящаяся в ядрышке, отвечает за синтез про-рРНК, из которой впоследствии образуются 285 и 188 рРНК; РНК-полимераза II катализирует реакцию синтеза про-мРНК и только с этим ферментом связано так называемое кэпирование РНК. А. Шаткин в 1976 г. впервые описал характер- ную группировку, присоединяющуюся к 5'-концу фактически всех про-мРНК и мРНК посттранскрипционно. Автор назвал ее КЭПом

172

(от англ. сар — шапка, кепка). КЭП повышает устойчивость про-мРНК и мРНК к действию ряда рибонуклеаз и других гидро- лизующих агентов. Пример КЭПа: 7^шеС5" ррр5' ГЧг^р ...(7'-метил- гуанозил-5'-трифосфорил-5'-нуклеозил-метилрибозил-фосфорил -нуклеотид...); локализация КЭПа и предшествующие ему нуклео- тидные последовательности в ре- комбинантной плазмиде рТК1 показаны на рис. 62. З'-Конец мРНК, как правило, полиадени- лирован.

РНК-полимераза III катали- зирует синтез 55 РНК, всех тРНК, ряда малых РНК, а также часть гяРНК.

Скорость синтеза белков у различных представителей над- царств прокариот и эукариот варьирует в широких пределах. Это зависит от многих внутрен- них и внешних факторов. Тем не менее, у бактерий при 37°С за 1 секунду может включаться в рас- тущую полипептидную цепь от 10 до 20 аминокислот. Подсчита- но, например, что белковая мо- лекула, включающая 300 амино- кислот, синтезируется бактериальной клеткой за 20 секунд.

Скорость синтеза белков в эукариотических клетках заметно ниже (в среднем, за 1 секунду присоединяется 1—2 аминокислоты к растущей цепи полипептида). Здесь следует иметь в виду и тот факт, что для синтеза белка с прерывистого гена, включающего экзоны и интроны, требуется дополнительное время. Ген вначале транскрибируется целиком (со всеми экзонами и интронами) в пре-мРНК, которая затем в ходе сплайсинга освобождается от интронов и превращается в мРНК (см. рис. 53), в которой экзоны соединены последовательно конец в конец. Только после этого образованная мРНК включается в процесс синтеза белка. Следует иметь в виду, что, например, у человека 80—90% ДНК оказывается некодирующей.

Вырезание интронов из пре-мРНК происходит с участием ферментов, распознающих границы интронов. Если это распозна- ние окажется неточным, то соединившиеся экзоны будут кодиро- вать другой белок — произойдет сдвиг рамки считы -

173

1^*- АМР

^г

в а н и я. Свершившуюся поломку в механизме биосинтеза полипептида можно сравнить с типографским браком. Например, в словах "копна сухого сена" сдвинули рамку считывания и пол- учили бессмыслицу — "коп насухо госена" (интервалы между словами засчитываются за одну букву). Механизмы сплайсинга могут быть различными в зависимости от типа генов (ядерных и внеядерных) и классов интронов (рис. 63). С распознаванием механизмов сплайсинга связано выдающееся открытие конца 1982 г., когда Т. Чех с сотрудниками выявил авторестрикцию (самовы- резание) интрона в гене рРНК у одного из видов РгсЛогоа. При этом не требовалось каких-либо ферментов и приложения энергии

извне* Этим доказываются автокаталитические свойства нуклеи- новых кислот, и предложенный Т. Чехом термин "рибозим" не представляется алогичным.

Компартментализация эукариотической клетки служит веским доказательством специального (более высокого, чем у прокариот) разграничения функций и привязки их к определенным структу- рам. Это относится и к белковому синтезу. Мономерные рибосомы, в отличие от полисом, находятся в цитоплазме клетки в свободном состоянии. Полисомы, как правило, располагаются либо цепочкой ближе к ядерной мембране (связанные полисомы) и в тех местах, где мРНК входит в цитоплазму, либо они (так называемые "сво- бодные полисомы") ассоциируются через посредство мРНК с клеточным цитоскелетом (см.). Это обусловлено качеством синте- зируемых белков на полисомах.

В 1980 г. Трифонов и Зусман выяснили, что в геноме человека пары адениновых нуклеотидов встречаются с периодичностью 10,5 на протяжении любой последовательности ДНК, которая взаимо- действует с единицей гистонового ок- тамера и образует нуклеосому. Эта периодичность хорошо коррелирует с периодичностью завитков в В-спирали (см.) молекулы ДНК. Указанная пери- одичность адениновых пар кодирует закручивание спирали ДНК в одном направлении вокруг комплекса гисто- новых октамеров (рис. 64) и этот код был назван "хроматиновым" или "код упаковки хроматина". Высказано предположение, что в структурах бло- ков тандемно повторяющихся после- довательностей потенциал скручива- ния спирали как бы амплифицируется (от англ. атрпйсайоп — обилие). Более того, показано, что и при альтернатив- ных вариантах закручивания спирали (например, левостороннем) обнару- живаются тандем ни с блоки пурино- пиримидиновых оснований. Очевидно блоки тандемных повторов кодируют локус-специфичную упаковку ДНК и структуру хроматина в ядре клеток человека.

Локус-специфичный "код упаковки хроматина" участвует не только в структурной организации хромосом в ядре клетки, но может выступать как "код экспрессии гена", "код репликации" (сайты репликации на протяжении данной повторяющейся после- довательности) и "код рекомбинации".

Суммируя основные представления о структуре и функциях генома акариотических, прокариотических и эукариотических ви- дов, необходимо подчеркнуть следующие его особенности:

1. Геном акариот и прокариот, а также митохондрий и пластид эукариот является компактной совокупностью генов с небольшим содержанием структурных повторов, что характеризует его эко- номичность. Он кольцевидно замкнут (непрерывен), интервалы между генами минимальны. Например, вся генетическая инфор- мация умеренного фага X размещается в кольцевой молекуле ДНК длиной в 50 кЬ, где содержится порядка 40 генов; плазмидная ДНК из 95—97 кЬ включает до 100 генов; замкнутая ДНК Е. соп из 400 кЬ может содержать до 3000 генов (примерно 1500 пн составляют один ген);

2. Генетический аппарат в клетках эукариот организован в форме нескольких линейных хромосом, в которых ДНК прочно связана с белками-гистонами, обеспечивающими упаковку и упо- рядочение ДНК в виде структурных единиц—н уклеосом (учитывая при этом "код упаковки хроматина" и экстраполируя его на клетки большинства эукариот). Так, в гаплоидной клетке Засспагошусез сегелаыае содержится 17 хромосом, в каждой из которых детектировано 1000 кЬ и, следовательно, число генов могло бы достигать в такой клетке 11 000; для 23 хромосом в гаплоидной клетке человека, где в одной хромосоме содержится 125 000 кЬ, число генов должно бы возрасти до 2 млн. Предположительно близкое число генов могло бы оказаться в гаплоидных клетках кукурузы, где имеется 10 хромосом, в клетках кролика с 22 хромосомами, или мыши с 20 хромосомами. Однако, в хромосомах эукариотических организмов содержится генов меньше, чем неко- дирующих участков (спейсеров, или разделителей), и также име- ется масса сходных между собой фрагментов ДНК, повторяющихся десятки-сотни тысяч раз. Вот почему, например, у человека лишь 10 - 20% всей ДНК относится к разряду кодирующей. Но и в этом случае число генов в 23 хромосомах гаплоидной клетки может достигать порядка 200 000.

1. Гены эукариот, нередко располагаясь в хромосомной ДНК рядом, образуют мультигенные семейства, состоящие из небольшого числа родственных последовательностей. Напри- мер, гены, кодирующие рРНК у млекопитающих, обнаруживаются в геноме сотнями своих копий, сгруппированных в зоны, а это свидетельствует об избыточности генетических программ у вы- сших организмов (создание "повышенной прочности").

2. Представители микробного, растительного и животного мира имеют в составе генетического материала одни и те же строитель- ные блоки, то есть их "кодовый словарь" в основном однотипен, или универсален, и функционирует преимущественно в соответ- ствии с центральными постулатом молекулярной генетики, сфор- мулированным Ф. Криком в 1967 г.: генетическая информация переносится по схеме ДНК -» РНК -» Белок (у вирусов может быть несколько видоизменена), но никогда — от белка к РНК.

3. Каждый ген проявляет себя (экспрессируется) путем обра- зования, или биосинтеза мРНК (транскрипция гена) с последую- щим переводом (трансляция) информации в специфическую по- липептидую цепь, фактически являющуюся продуктом гена. Ген и его продукт колинеарны, то есть последовательность кодонов (триплетов) в гене точно соответствует последовательности амино- кислот в белке.

6)' Ген кодирует строение белковой молекулы и регулирует процесс ее синтеза.

В таблице 19 суммированы основные представления о строении и функциях генетического аппарата клеток разного уровня орга- низации.

Зная строение и функцию генов, а также владея методами их выделения и переноса в различные клетки или молекулы нуклеи- новых кислот, можно с достаточной уверенностью подходить к постановке генноинженерных работ.

5.2.КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ;

рДНК-БИОТЕХНОЛОГИЯ

5.2.1. Общая характеристика генетической инженерии. Гене- тическая инженерия — это методы получения рекомбинантных ДНК, объединяющих последовательности разного присхождения. Некоторые ученые трактуют генетическую инженерию "как ис- кусство использования знаний, методов и техники физико-хими- ческой биологии и молекулярной генетики для конструирования

177

организмов с заданными наследственными свойствами" (В. Н. Рыбчин, 1986).

Таблица 19. Основные характеристики генетического аппарата у прокариот и эукариот

Характеристика				Прокариоты	Эукариоты
генов		по строению		непрерывны	прерывны (содержат интроны)
		по стабильности		стабильны	возможны перестройки
		по координации экспрессии		опероны (регулоны) управляются операторами и сайтами связывания регуляторных белков	оперонов нет. В индуцибельных генах имеются регуляторные элементы
про- це- ссов	транскрипции	по числу' РНК-полимераз		одна	три
		по наличию энхансеров		отсутствуют	имеются. Энхансеры тханеспецифичны
		по строению промоторов		типичен единый план строения; наличие двух консервативных последованосгей: ТАТААТ (-10) и ТТГАЦА (-35)	промоторы генов, кодирующих белки, имеют одну консервативную последователь- ность ТАТА (А/Т) А(А/Т) (-30) и богатый ГЦ-участок (-40... - 100)
		по мРНК		колинеарна гену или оперону	первичный транскрипт колинеарен гену. "Зрелая" мРНК образуется в процессе сплайсинга
	| трансляции |	по константе седиментации рибосом		705 (505 и 305)	805 (605 и 405)
		по сайту связывания рибосом		последователь- ность с ядром АГГА	консервативной последователь- ности ке выявлено
		.по ко-1 донам |	инициации	АУГ, редко ГУТ	АУГ
			терминации	УАА, УАГ, УГА	УАА, УАГ, УГА

Очевидно, что под искусством автор понимает умение органи- зовать и методически реализовать генноинженерную задачу — получить рекомбинантную ДНК с последующим включением ее в реципиентную клетку или осуществить перенос целых хромосом от клеток-доноров в клетки-реципиенты.

Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отож- дествляются (А. А. Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия представляет собой один из методов науки биотехнология. В основу генноинженерных методов заложена способность ферментов — рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последо- вательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК. Поэтому методами генетической инженерии добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток,. содер- жащих заданный участок ДНК. Другими словами клонирование ДНК — это получение ее генетически идентичных копий.

Генетическую инженерию подразделяют на генную инжене- рию, геномную инженерию и хромосомную инженерию. Сущ- ность первой состоит в целенаправленном использовании пере- строек естественного генома, осуществляемых и лтго или ш латто, для изменения генетических характеристик известных вирусов и клеток. В качестве примеров генной инженерии ш лтго можно назвать: транслокацию (перемещение) в вирусные геномы некото- рых клеточных генов, придающих вирусам свойства онкогенности; трансдукцию (перенос) клеточных генов от клеток-доноров в клет- ки-реципиенты с помощью фагов, и др. Примером генной инже- нерии т лагго является создание молекулярных химер из фрагмен- тов ДНК разного происхождения, включение их в реципиентные клетки Е. соП, Вас. 511ЫШ5 и др. с последующим культивированием этих организмов в целях получения необходимых белковых про- дуктов (пептидных гормонов, ферментов и т. д.).

Сущность геномной инженерии заключается в целенаправлен- ной глубокой перестройке генома акариот, прокариот или эукари- от, вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии добиваются внесения большого количества дополнительной гене- тической информации и в результате получают гибридный орга- низм, отличающийся от исходного по многим признакам. Гибриды

179

оказываются жизнеспособными лишь в тех случаях, когда они содержат все безусловно необходимые (облигатные) гены, когда у них налажены и взаимно согласованы регуляторные связи между совмещенными генами, и, наконец, когда имеется структурное соответствие между продуктами матричного синтеза (белками).

При геномной инженерии возможно получение половых (сли- яние гамет) или соматических (слияние неполовых клеток) гибри- дов. Половые гибриды получают либо в естественных, либо в искусственных (экспериментальных) условиях. Соматические гиб- риды способны формироваться лишь в искусственных условиях у прокариот и эукариот, то есть у клеточных форм (клеточная инженерия).

Примером естественной (природной) геномной инженерии является рекомбинация геномов вирусов гриппа, относящихся к типу А. На основании антигенных характеристик рибонуклеопро- теинов выделяют вирусы гриппа А, В и С. Изменения антигенных свойств постоянно происходят у вирусов типа А, меньше — у типов В, тогда как вирусы типа С являются антигенно стабильными. К тому же известны штаммы вируса гриппа А, изолируемые от свиней, лошадей, уток, цыплят. Некоторые изоляты вируса от животных антигенно подобны штаммам, циркулирующим среди людей. Поэтому более полно изученными к настоящему времени также оказались вирусы типа А. Их геном состоит из 8 различных однонитевых сегментов РНК с общей молекулярной массой 2— 4- 10³кДа (см. рис. 22а). Большая часть полинуклеотидов, состав- ляющих вирусные РНК-сегменты, содержат уридин на З'-конце. С вирусным геномом ассоциирована РНК-зависимая РНК-полимера- за. Рибонуклеопротеин окружен белковым слоем (М), образующим внутреннюю часть вирусной оболочки. Белок М включает малый протеин с ММ 26 кДа, составляющим 40% от всего белка вирусной частицы. Порядка 20% массы частицы приходится на липидный бислой, который, по-видимому, имеет клеточное происхождение. Гемагглютинин отвечает за агглютинацию эритроцитов вирусом А. Он представляет из себя гликопротеин с ММ 75 кДа. Нейрами- нидаза ответственна за рецепторцо-разрушающую активность ви- руса, обеспечивая ему выход из эритроцита или клетки-"хозяина". Нейраминидаза состоит из четырех полипептидных молекул с ММ порядка 60 кДа, и, наряду с гемагглютинином, обладает антигенной активностью. Их используют для регистрации и объяснения анти- генных изменений вируса. К началу 90-х годов было известно 11 подтипов гемагглютинина (Н1—Н11) и 8 подтипов нейраминидазы

180

(N1—N8) у вирусов А. Поэтому система обозначения вируса гриппа включает название штамма, номера субтипов гемагглютинина и нейраминидазы. Например, вирус гриппа А(свиной) Тайвань /1/70(НЗЫ2). Это значит, что вирус изолирован от свиней на острове Тайвань в 1970 году, содержит гемагглютинин 3(НЗ) и нейраминидазу 2 (N2). Оба антигена (Н и 14) формируются и контролируются генами (РНК-фрагментами) независимо друг от друга. Вследствие сегментарности генома вирус проявляет реком- бинацию с высокой частотой и, как следствие, происходят изме- нения в антигенных свойствах вирусов (прежде всего — по гемагглютинину и нейраминидазе).

В экспериментальных условиях возможно проведение РНК — РНК-гибридизации с последующим определением профилей плав- ления молекул гибридных РНК в присутствии формальдегида.

Известны некоторые вирусы бактерий, объединяющие в себе свойства фагов и плазмид. Их назвали фазмидами. Они могут быть природного и экспериментального (искусственного) происхожде- ния. К природным относятся некоторые умеренные соН-фаги (N15, Р1), к искусственным — фазмида со1 106, способная при 32°С проявлять свойства плазмиды, а при 37°С индуцирует лизис реци- пиентных клеток.

Благодаря высокой степени генетической гомологии Е. соП, ЗашюпеЦа врр. и 5Ыде11а врр. можно получать хромосомные гиб- риды между ними:

Доноры ДНК (хромосомы) Реципиенты ДНК (хромосомы)

Е. соЦ Различные штаммы Е. соИ

8Ыде11а врр. ЗашюпеИа врр.

ЗашюпеЦа 1урттитшт Различные виды и штаммы

ЗашюпеИа врр.

ЗЫде11а йехпеп Е. соП, 8а1топе11а гурЫ и др.

В этих целях чаще прибегают к методу конъюгации бактерий. Однако следует иметь в виду, что виды с небольшой генетической гомологией (тем более — при отсутствии ее ) слабо конъюгируют или не конъюгируют совсем и обмена генами между ними прак- тически не наблюдается. Здесь перспективным оказывается метод слияния протопластов, ныне широко используемый в работе с прокариотами и эукариотами.

Клеточные стенки обычно у молодых клеток частично или тотально лизируют с помощью гидролитических ферментов. Воз- никающие протопласты затем подвергаются слиянию в среде с полиэтиленгликолем и соответствующими стабилизаторами про- топластов, либо используют электрическое или температурное воздействие в целях деполяризации мембраны. Таким образом можно создавать межвидовые и, даже, межродовые гетерокарио- тические гибриды. Другими словами, таким путем удается совме- щать в одной клетке геномы клеток (организмов) с половой несов- местимостью. Например, удается слить протопласты клеток мор- кови и ячменя, кукурузы и сои, дурмана и красавки, картофеля и томата (рошанэ), некоторых бактерий и растений, мыши и моркови, мыши и человека. Однако в большинстве случаев такие гибридные клетки не развиваются в полноценные организмы. К тому же стабильность (жизнеспособность) гибридов находится в обратно- пропорциональной зависимости от эволюционной отдаленности гибридизуемых видов, то есть эволюционно далекие виды менее жизнеспособны в гибридном состоянии, чем близкородственные виды. Жизнеспособные гибриды сохраняют большую часть генома одного из слившихся партнеров. Поэтому соматическая гибриди- зация практически реализуется пока на ограниченном числе видов и родов. Так, используя протопласты из листьев петунии дикого типа одного вида и "альбиносные" протопласты суспензионных культур другого вида, удалось сконструировать амфидиплоидные (от греч. атй— с обеих сторон, алр1оо8 — двойной, е1сю8 - вид), или аллотетраплоидные соматические гибриды с 28 хромосомами, способные трансформироваться в цветущие растения:

а) вид Репина рагосШ (2п= 14)

б) вид РеШша пуЬпйа (2п= 14) •

в) вид РеШша тГ1а!а (2п = 14)

Соматические гибриды: 1) Р.рагосШ х Р.ЬуЪпсЛа (4п = 28) 2) Р.рагосШ х Р.тГ1а1а (4п = 28).

К. Келер и Ц. Милыптейн в 1975 г. смогли впервые получить соматические гибриды клеток млекопитающих — гибридо- м ы, продуцирующие так называемые моноклональ- ные антитела. В иммунном организме антитела образуются плазматическими клетками, возникающими в результате диффе- ренциации В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию. В-лимфоциты — высоко специализированные клетки, их в орга- низме порядка 10⁷ клонов и каждый клон синтезирует антитела

только одной специфичности — моноклональные антитела (вари- антов антител может быть также 10⁷⁾. Если антиген содержит несколько специфических (детерминантных) групп, то антитела образуются против каждой детерминанты. В-лимфоциты не удает- ся поддерживать в культуре.

Если В-лимфоцит перерождается и трансформируется т лтго в злокачественную опухоль, то такая опухоль — миелома синтезирует большое количество антител, специфичность которых неизвестна. Однако возникают и такие варианты миеломных клеток, в которых отсутствует экспрессия генов в отношении синтеза тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Миеломные клетки могут поддерживаться в культуре неопределенно долго. Совместив способность миелом к длительному культивированию в условиях ш лагго и способность В-клеток продуцировать моно- клональные антитела, Келер и Милыптейн получили гибрид, сек- ретирующий моноклональные антитела. Для этих целей они ис- пользовали мышиные клетки миеломы и нормальные В-клетки селезенки мыши, иммунизированной заданным антигеном (см. специальную часть). Подобные гибридомы широко используются теперь для получения различного рода моноклональных антител, применяемых в диагностических, лечебных и других целях.

Необходимо иметь в виду, что, в отличие от половой гибриди- зации, соматическая гибридизация эукариотических клеток завер- шается объединением под одной мембраной не только ядерных геномов двух (или более) особей, но и генов цитоплазмы (митохон- дриальных, хлоропластных, емкостью в 1000—2000 генов), что может отразиться на функциональной активности гибрида. У межвидовых гибридов часть хромосом может утрачиваться за счет элиминации, которая оказывается видоспецифичной. Так в гибри- дах протопластов клеток "мышь х человек" и "человек х комар" элиминируются хромосомы человека и комара соответственно. При морфологическом различии хромосом такие гибриды удобны для картирования генов. Напомним, что в соматических клетках мыши содержится 20 пар хромосом, в клетках человека 23 пары хромосом и три пары — в диплоидных клетках комара.

Таким образом, на практике стремятся осуществлять сомати- ческую гибридизацию для заметного расширения рамок скрещи- вания, для включения (переноса) внеядерных генов и их функций в гибридное потомство и для локализации генов в хромосомах.

В случае переноса изолированных хромосом от клетки-донора

183

одного организма в клетку-реципиент другого организма говорят о хромосомной инженерии. О. Мак Брайд и X. Озер впервые в 1973 г. осуществили такой перенос хромосом (в стадии метафазы) китайского хомячка в клетки мыши.

Хромосомная инженерия — ветвь генетической инженерии. Объектами ее являются хромосомы клеток прокариот и эукариот. Донорами хромосом могут быть различные суспензионные и суб- страт-зависимые клеточные линии. Из клеток прокариот хромосо- му (ДНК) выделяют из супернатанта после центрифугирования дезинтеграта или лизата клеток (протопластов). Клетки эукариот блокируют на стадии мейоза, хромосомы выделяют, применяя "гипотонический шок" и гомогенизацию с последующей очисткой их дифференциальным центрифугированием. Хромосомы осажда- ют на поверхности реципиентных клеток хлоридом кальция и через несколько часов клетки обрабатывают реагентом — "перфорато- ром" (например, глицерином). Реципиентные клетки могут содер- жать донорный материал в широком диапазоне (встроенным в геном, изолированно).

Благодаря хромосомной инженерии стали возможными пол- учение высокомолекулярных БАБ, присущих человеку, лечение наследственных заболеваний, селекция пород домашних живо- тных и различных видов растений.

Естественное или искусственное скрещивание растений и жи- вотных, когда происходит оплодотворение женской гаметы муж- ской, по сути своей касается переноса и слияния хромосом с последующим возникновением жизнеспособных гибридов. Меж- видовое скрещивание как правило сопровождается худшими ре- зультатами — получаемые гибриды обладают сниженной плодови- тостью или могут быть совершенно бесплодными.

Целые наборы хромосом от разных видов могут соединяться вместе и в результате возникают аллополиплоидные формы (от греч. а11о8 — другой). Можно соединять и неполные хромосомные наборы. Так, при скрещивании 42-хромосомной пшеницы с пше- нично-ржаным амфидиплоидом, содержащим 56 хромосом, возни- кает гибрид с 49 хромосомами, у которого 42 хромосомы принад- лежат пшенице и 7 хромосом принадлежит ржи.

При искусственном скрещивании растений или животных стремятся получать в потомстве комбинацию различных ценных родительских признаков.

Теоретически любые клетки могут быть использованы либо в качестве донора хромосом, либо в качестве реципиента их, хотя

ш

на практике стремятся иметь подходящие реципиентные линии клеток, акцептирующие чужеродную ДНК с повышенной актив- ностью, например, клетки карциномы мочевого пузыря человека (линия ЕЛ).

В процессе выделения хромосом из клеток на стадии митоза эксперименты проводят при пониженных температурах ( + 4^СС), используя пластиковые пипетки во избежание деструкции хромо- сом. Перед механическим разрушением клеток их суспендируют (10⁷ клеток/мл) в гипотоническом растворе, а затем центрифуги- руют при 2500 д на холоду (примерно 25 мин. при 4°С). Выход хромосом составляет около 10% от всех хромосом клеток-доноров. Очищенные хромосомы должны быть использованы в опытах по переносу в реципиентные клетки (трансфекция) немедленно.

Хромосомы можно выделять из клеток, блокированных в ме- тафазе, различными способами, в том числе с помощью щадящих поверхностно-активных веществ, например, стероидного сапони- на-гликозида дигитонина, представляющего собой пентагликозид дигитогенина. Олигосахаридная часть присоединяется через гид- роксил в позиции СЗ агликона. Она включает 1 остаток ксилозы и по 2 остатка галактозы и глюкозы.

ОН

Таким образом, соподчиненность генной, геномной и хромо- сомной инженерии можно представить в виде схемы: ^^Генетическая инженерия

генная инженерия геномная инженерия хромосомная инженерия

половая соматическая гибриди- гибридизация зация (клеточная инженерия)

Такое подразделение генетической инженерии и терминология

185

достаточно условны, поскольку, в конечном итоге, результаты манипуляций с рекомбинантной ДНК получают на клеточных культурах. Поэтому при выделении двух уровней биотехнологии — молекулярный и клеточный (включая к л е т о ч- но-инженерный) следует иметь в виду, что первый относится к получению и клонированию рекомбинантной ДНК, второй — к выращиванию вирусов, клеток и тканей (клеточно-инженерный — к протопластированию и гибридизации протопластов), хотя, как уже было сказано, все уровни можно свести к одному — клеточ- ному.

V^VчЛЛЛА^ЛЛ/V'А А А А АмРНК

ревертаза, или обратная транскриптаза; нуклеозидтрифосфаты; олигодезокситимидин (ЙТ)

ЧАА/Ч/ЧА/ЧА/\^ЧА^А А А А А мРНК

II II II II II

, Т Т Т Т Т комплементарная цепь

денатурация

ДНК=полимераза I

_С

(фрагмент Кленова) + дезоксинуклеозидтри- фосфат (сШТФ)

А А А А А

II II II II II ДНК с одноцепочечной ————— Т Т Т Т Т петлей

нуклеаза 81 из Азрег^Шиз огугае А А А А А

двуцепочечная компле- кт Т Т Т Т ^{ментарная} Д^НК<^КД^НК>

II II II II II * т т т т т

цццщщц-

терминальная трансфераза, сЩТФ

АААААЦЦЦЦЦЦЦФК™

II II II II II ДМКс

>агмент го- мополи- мерными последо- ватель- ностями <Щ

Рис. 65. Схема получения из мРНК фрагмента ДНК, пригодного для клонирования.

5.2.2. рДНК-биотехнология. Практическое использование ре- комбинантных ДНК различного происхождения составляет основу так называемой "рекомбинантной ДНК-биотехнологии", или со- кращенно рДНК-биотехнологии. Теоретически все 50—200 тысяч структурных генов человека доступны экспериментальному ана- лизу, хотя это еще не было бы проникновением в природу человека в целом. Тем не менее, с помощью рДНК-биотехнологии открыва- ются невиданные доселе перспективы производства различных веществ для народного хозяйства.

рДНК-биотехнологию подразделяют на следующие этапы: по- лучение чужеродной ДНК, разрезание полученной ДНК на фраг- менты и их очистка, включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду и получение рекомбинантной ДНК, или рДНК, введение рДНК в пермиссивные клетки и клонирование генов, амплификация и экспрессия рДНК.

Получение чужеродной ДНК. Чужеродную ДНК можно по- лучить с помощью химического или ферментативного синтеза, либо из любого организма или из вирусов с последующим опре- делением ее первичной структуры. Если ДНК выделяют из клеток эукариот, то для клонирования, амплификации и экспрессии не нужны интроны. Поэтому в таких случаях используют мРНК, образующуюся в процессе сплайсинга (рис. 65).

Как видно из рис. 65,терминальная трансфераза катализирует реакцию присоединения гомополимерных последовательностей дезоксицитидина. Таким образом создаются предпосылки для по- следующего клонирования, в частности, используя плазмидный вектор (см.) РВК322, несущий гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. После расщепления рестриктазой (см.) Рех 1 (из Ргстйепоа агиагШ) эта плазмида имеет гомополимерные последо- вательности йГ:

Р&11

—Ц—Т—Г—Ц—А—Г —Г—А—Ц—Г—Т—Ц—

Г

Рб! 1

За счет этого вектор можно использовать для встраивания полученного фрагмента ДНК с гомополимерными последователь- ностями йЦ.

Для изоляции неповрежденных генов из ДНК можно исполь- зовать ультразвук или гидродинамическое дробление ДНК в соот- ветствии с нижеследующей последовательностью этапов.

В соответствии с особенностями структуры полученного фраг-

187

мента его включение в рСоН Е1 будет обеспечиваться связыванием типа поли-йА—сГТ.

ДНК из Е.соИ

^гидродинамическое дробление (или ультразвук)

фрагменты ДНК |5' — рестриктаза фага X

дополнительная специфическая фрагментация

• ал ^

| терминальная трансфераза, <1АТФ

ДНК.пригодная для включе- ния вплазмидный вектор, ЙА | например, СоИ Е1

Н₂М— С_|гт~(СН₂)₂-5*-|сн7|^/

_сО

Разрезание ДНК на фрагменты. Любая нативная ДНК может быть "измельчена" с помощью ферментов эндонуклеаз, среди которых особое место занимает рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы). Биологическая роль их, например, в клетках про- кариот заключается В активный метил

С ООН

он он

гидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетки извне. Собст- венная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой рестрик- тазами, что обусловле- но наличием фермен- тов, называемых моди- фикационными мети- лазами, узнающими одинаковые с рестрик- тазами сайты. Назван- ные метилазы катализируют реакции метилирования А или Ц в немногих специфических сайтах в хромосомах, в результате чего метилированная ДНК оказывается нечувствительной к атаке ре- стриктазами. Переносчиком метильных групп выступает 5-адено- зил-Ь-метионин (БАМ).

В настоящее время известно свыше 500 рестриктаз и для многих из них определены узнаваемые последовательности. Значительное число рестриктаз производится в качестве конечных продуктов биотехнологии, например, такими компаниями как 51дта (США),

188

РЬагтасла (Швеция), Зегуа (Германия) и др. Эти ферменты способ- ны узнавать специфические места (с а й т ы) и расщеплять нуклеотидные последовательности в ДНК, индуцируя формирова- ние тупых или липких концов.

Рестриктазы вначале подразделяли на 3 группы в зависимости от длины узнаваемой последовательности:

I— узнают тетрануклеотиды, например А1и I из АгШгоЬас^ег ш1еив,

2. — узнают пентануклеотиды, например Есо Ш1 из Е. соН,

3. — узнают гексануклеотиды, например Есо Я1 из Е. сои; А1и I катализирует расщепление последовательности АГ^- ЦТ

с образованием тупых концов во фрагменте ДНК, ЕсоЯН и ЕсоЯ1 расщепляют последовательности^-— ЦЦ(АУТ) ГГ и Г*—— ААТТЦ соответственно с образованием липких концов во фрагментах ДНК.

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с учетом ЯМ5-системы, в которой ЯМБ — белки рестрикции, мети- лирования (модификации) и посадки соответственно. К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы Я2М25); ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — Я5 и М5. Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине. Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеука- занных трех групп, преимущественно используются на практике.

Рестриктазы Ш класса (например из фага Р1, системы 2Я М5) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы. Отдель- ные из них, например, не узнают сайтов посадки. Их редко используют на практике.

По предложению X. Смита и Д. Натанса (1973) номенклатура рестриктаз строится по следующему принципу: название фер- мента складывается из букв и цифр: первая буква принадлежит родовому названию источника рестриктазы, две другие буквы относятся к названию вида источника; в некоторых случаях дополнительно указы- вают штамм или серовар; далее следуют р^. _бе взаимодействие Есо обозначения ЯМ-системы (не всегда) и ну- К1 с днк: а — вид сверху, б мерация фермента (таблица 20). — вид сбоку.

Из таблицы видно, что число узнаваемых рестриктазами нук- леотидных последовательностей варьирует от 4 до 13 (преимуще- ственно 4—6). На рис. 66 показано взаимодействие Есо Я1 с ДНК.

189

В зависимости от источника ДНК число расщепляющихся

сайтов в ней будет неодинаковым. Например, действию рестрик-

ционных эндонуклеаз подвергаются ДНК фага Я (инфицирует Е.

соИ К — 12), аденовируса 2 и вируса 5У — 40; в этом случае число

расщепляющихся сайтов соответственно будет следующим: для

А1и1 - более 50, более 50, 32; для ВатН1 — 5,3,1; для ВаП — 15,17,0;

для Нтй III — 6, 11, 6; для МЬо I — 50,50,6 и т. д. Т а б л и ц а 20. Характеристика некоторых рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз)

Наименование фермента	Источник получения	Сайт узнавания в последовательности ДНК
АаШ	Асе1оЬас1ег асеи	5^/ - ГАЦГТ/Ц - 3^/
Асе I	Ас1пе1оЬас1ег са1соасеиси5	5^/ - ГТ/(Д Ц) (Г, Т) - АЦ - З^7
А1и I	Аг}пгоЬас1ег 1и1еив	5^/ - АГ/ЦТ - з'
Ауа I	АпаЬаепа уапаЬШв	5^/ - Ц/РуЦГРиГ - 3^/
АVа II	^11 п	5^у - Г/Г(А, Т) ЦЦ - У
Ва1 I	ВгелдЬас1епит аМсшт	5' - ТГГ/ЦЦА - з'
Ват Н1	Вас. атуюихщеГааепз Н	5^/ - Г/ГАТЦЦ - 3^/
Вал II	Вас. апеигтогуисиБ	5^у - ГРиГЦРу/Ц - 3^/
Вс1 I	Вас. саМогуисиБ	5^/ - Т/ГАТЦА - 3'
Вд1 I	Вас. дюЫдп	5^/ - Г1ЩЫтН/ЫГТЦ - 3^/
Вд1 II	— " — " —	5^у - А/ГАТЦТ - 3^/
Вв1 ЕП	Вас. Б1еагоШегторЫ1иБ ЕТ	5' - Г/ГШАЦЦ - 3'
С1а I	Сагуорпапоп 1а1шп ^	5^7 - АТ/ЦГАТ - 3^/
Врп I (должно быть согласно принятой номенклатуры 5рп1)	В1р1ососсиБ рпеитошае (51гер1ососсиз рпеитошае)	5^/ - Г^А/ТЦ - 3'
Ога1	Решососсик гасНорЫшБ	5' - ТТТ/ААА - 3^/
Есо Е1 (рекомбинант)	Е. соЦ, несущая плазмиду гиперпродукции Есо К1	5^/ - Г/ААТТЦ - 3'
Есо И	Е. соП КУ13	5^/ - Г/ААТТЦ - 3^х
Есо КУ	Е. сои	5^/ - ГАТ/АТЦ - 3^/

Расщепление сайтов может происходить симметрично (см. А1и I, Ва11, Брп 1 и др.) с образованием тупых концов в ДНК и асимметрично (Аа1 II, Асе I, Ага I, II, Ват Н1 и др.) с образованием липких концов:

Нтс II I

-ЦТАГГЦАГЦТГГ АЦГТ-

ДНК

-ГАТЦЦГТЦГАЦЦТГЦА-_ Нтс II

-ЦТАГГЦАГ I ■ * " Г Г * Г

|-Г АТЦЦГТЦ,

ЦТГ ГАЦГТ- [ГАЦЦТГЦА-

фрагменты ДНК с тупыми концами Нтс. III

• ГТЦГТААГЦТТЦЦГТГ--

• ЦАГЦАТТЦГААГГЦАЦ- Ншс! III

ДНК

- ГТЦГТА

|— ЦАГЦАТТЦГА |

АГЦТТЦЦГТГ- , АГГЦАЦ-

фрагаенты ДНК с липкими концами

Рестриктазы расщепляют ДНК примерно через 250 нуклеоти- дов, исходя из формулы 4" (4 — нуклеотиды — А, Г, Т, Ц; п — число повторов сайтов в ДНК).

Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделя- ют с помощью электрофореза в гелях (агарозном, полиакриламид- ном — ПААГ), из которых их экстрагируют, вырезая соответству- ющие участки геля; эти участки геля, например агарозного, рас- плавляют в пробирках при 68°С и ДНК экстрагируют фенолом, затем концентрируют изобутанолом, переосаждают этанолом и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов. При не-

192

обходимости можно дополнительно провести препаративный гель- электрофорез. Из 160 мкг ДНК нематоды СаепогаЬМШз е1едапз удается получать 2-4 мкг какого-либо одного фрагмента.

Рестрикты (особенно — с липкими концами) могут быть сшиты с помощью ДНК-лигаз. При необходимости липкие концы отжи- гают (отжиг— это специфическая реассоциация комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул):

- -5'-Т Ц-ТАГ-А-3'- • + •• З'-А Г-АТ-Ц Т-5' ^отжиг )

_{5-_Т * Ц • Т А • Г ■ А - 3'-}

■З'-А -Г-А-ТЦ.Т-5'- Т

реассоциант с пробелами между ТиЦ в обеих нитях ДНК

В пробелах между нуклеотидами отсутствуют фосфодиэфир- ные связи, которые могут быть воссозданы с помощью ферментов лигаз, катализирующих реакции синтеза за счет З'-гидроксильной и б'-фосфатной групп

нуклеиновое |

но—Р—он

эе

СИ_г д основание

нуклеиновое 2.0^ основание

он он 1Г

о он

■ о

I

СН₂ о,

нуклеиновое основание

_"Р¹

О ОН

I

он—р=о

А

| , нуклеиновое

С Н 2 о основание

7 т. 8524 193

Таким путем восстанавливаются ковалентные связи в пробелах: ''' 5'—Т—Ц—Т—А—Г—А—3'*"'

'"' Ъ'—А—Г—А—Т—Ц—Т—5^/'''

Для сшивания фрагментов ДНК используют также линке- ры и адаптеры. Линкер (от англ. 1гпк — соединять) — это синтетический, короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содер- жащий сайты узнавания для ряда рестриктаз; он может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью какой-либо рестриктазы, в процессе реконструирования рДНК. Например, линкер Есо Ш представляет собой й⁵'(ГГААТТЦЦ)³'.

Адаптер — это линкер, содержащий больше, чем один сайт узнавания рестриктазой, и обеспечивающий получение фрагмен- тов от действия одной рестрикционной эндонуклеазы для включе- ния в сайт другой рестриктазы, то есть адаптор предназначен для объединения фрагментов с несовместимыми концами. Пример адаптера Есо К1 к Зта I: (ААТТЦ1Д1ДГГГ). Тупые концы ДНК, образованные после рестрикции, могут относительно легко сши- ваться под действием ДНК-лигазы фага Т4.

Метод клонирования широко используют для выделения инди- видуальных генов прямо из генетического материала, располагая при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зон- дами. Эти последние взаимодействуют только с определенными последовательностями и гибриды их с генами регистрируются радиоавтографией на рентгеновских пленках. Пример анализа по Саузерну (по англ. Боихпегп-ЫоШпд — промокание по Саузерну) показан на рис. 67. Аналогичный подход применим и для анализа РНК (метод Нозерн* -блотинга).

* — Здесь использована игра слов 5оиШет и МогШет, то есть южный и север- ный, хотя в первом из них отражена фамилия ученого.

В генетической инженерии следует различать копийную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК, и векторы, несущие клоны геномной или хромосомной ДНК. При клонировании всего генома ("шотган-эксперимент", от англ. 8по1дип — дробовик) его разделяют с помощью рестриктазы, узнающей короткую (4 пн) последовательность нуклеотидов. Раз- рушение проводят в таких условиях, чтобы осуществлялась час-

Р ис. 67. Схема выделения фраг- ментов ДНК из смеси рестриктов ДНК по Саузерну: I — расщепление геномной ДНК на случайные фраг- менты с помощью рестриктазы (Р), 2 — электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле, 3 — недифференци- рованное пятно ДНК, 4 — тепловая денатурация ДНК с образованием од- ноцепочечных фрагментов и перенос их на нитроцеллюлозный фильтр для фиксации (ЫоШпд), 5 — гибридиза- ция с радиоактивным зондом, 6 — 6 гибридные последовательности, вы- явленные с помощью радиоавтогра- фии, 7 — выделение фрагментов из агарозного геля для исследования.

тичная рестрикция ДНК. Образующиеся при этом фрагменты будут разной длины, но каждый из них заканчивается одной и той же последовательностью. Наличие во фрагменте липкого конца делает его удобным для клонирования. Разделенные фрагменты всего генома встраивают затем в клонирующий вектор с образо- ванием набора химер, который может храниться в течение неог- раниченного времени. Такой набор клонированных фрагментов ДНК называют библиотекой генома. С помощью нового (оригинального) зонда библиотека может быть сразу же использо- вана для поиска специфического фрагмента.

Включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду

На латинском языке уес!ог значит везущий, несущий; в мате- матике вектор — это прямолинейный отрезок, которому придано определенное направление. Понятие "вектор" в молекулярной биологии объединяет сущность данных выше двух определений и название "Вектор для клонирования" введено М. Томасом в 1974 г. для ДНК, способной переносить в клетку — реципиент чужерод- ную ДНК любого происхождения. Вектор — самый важный ком- понент процесса клонирования. Он должен удовлетворять следу- ющим требованиям: 1) относительная легкость накопления и вы- деления его в достаточном количестве,

2. он должен содержать генетические маркеры для отбора последующих трансформантов,

3. наличие в векторных ДНК нескольких сайтов узнавания различными рестриктазами в целях получения для клонирования серии разных молекул ДНК.

Следовательно, векторы — это молекулы ДНК, обеспечиваю- щие амплификацию фрагмента (образование дополнительных ко- пий его) в растущей популяции клеток соответствующего вида организма.

Для клонирования ДНК например в клетках Е. соП можно использовать два класса векторов — плазмиды и фаги. Из числа ДНК-плазмид для практических целей рекомендованы и имеются на рынке следующие: Со1 Е1 из Е. соИ штамм С600, Со1 Е1 Атр из Е. соИ штамм КК.245, резистентный к антибиотику ампициллину; рВК322 из Е. соИ штамм КШ, резистентный к ампициллину и тетрациклину; рВК.325 из Е. соИ штамм НВ101, резистентный к ампициллину, тетрациклину и хлорамфениколу (левомицетину); рис-плазмиды (рИС8, р11С9, рИС18, рИС19) из Е соН штамм КЫ1, резистентный к ампициллину и дефектный по В-галактозидазе; рЦВ110 из Вас. виЫШв штамм ВБ170, резистентный к канамицину; рУАС-клонирующие векторы, впервые предложенные в 1987 г. (Д. Т. Бурке, Ф. Г. Карл, М. В. Олсон) — рУАСЗ, рУАС4, рУАС5. Они представляют собой дрожжевую (от англ. уеа$1), искусственную (А, от англ. агийсхаЦ хромосомную (С, от англ. сЬготовоте) кло- нирующую систему для клонирования больших (50-100 кЬ в длину) фрагментов ДНК; Тьплазмиды (от англ. Тшпог шйисшд — вызы- вающие опухоль) из АдгоЬас1епт 1ите1ас1еп8 (рТ! — Вб-806) штамм А277, утилизирующий октопин, и рТ1 — С58 из А. ШтеГаоепз штамм С58, утилизирующий нопалин.

н₂м-с=ын I

ын-(сн₂)-сн-соон

Ж-СН-СООН

I

сн₃

октопин

(синтезируйся из аргинине и пирувата)

ноос-сн-мн-сн-соон

I I

(СН^ <СН₂)₃

I I

соон мн

I

мн₂-с=ж

нопалин

Октопин и нопалин, равно как и агропин, относятся к группе

о

II с

/ \

н₂м-со-(а-у₂-сн о

ЫН СН-(СНОН)-сн,он

\ / ³

с

о п и н о в — низкомолекулярньгх веществ, синтезируемых клетками злокачественной опухоли двудольных растений — ко- рончатого галла. В этой связи различают опухолевые клетки агропинного, нопалинового и октопинового типов.

Из бактериофагов используют ДНК-содержащие колифаги Т2, Т4, Т5, Т7, фаги Я, М13тр8, М13тр9, М13тр18, М13тр19, фХ174; из ДНК вирусов — 5У40 и аденовирус 2.

Векторные системы можно конструировать из ДНК, несущих маркер(-ы), с последующим включением их, например, в клетки эукариот, в том числе — млекопитающих.

В качестве иллюстраций векторных систем приводим рис. 68а, на котором изображены плазмиды Со1 Е1, рВЯ322, вирус 5У40 и челночный вектор.

Вирусы растений — как векторы обычно мало пригодны из-за своей патогенности для растительных организмов и неспособности встраиваться в хромосомы хозяйской эукариотической клетки. В настоящее время наметились подходы к изучению и оценке трех векторных систем: двухцепочечной ДНК вируса мозаики цветной капусты, одноцепочечной РНК вируса погремковости табака, од- ноцепочечной ДНК вируса золотистой мозаики фасоли. Из них лишь первая оставляет надежды на дальнейшее продвижение этой системы в сторону практической реализации пока в лабораторных условиях. Не исключается возможность объединения ДНК вируса мозаики цветной капусты с Т-ДНК "П-плазмиды из АдгоЬас1епшп и расширить круг растений — реципиентов такой векторной системы.

Дж. Коллинс и Б. Хон в 1978 г. впервые ввели в практику так называемый космидный вектор, или сов-вектор, то есть комбини- рованную векторную систему "плазмида-ДНК фага лямбда". Дан- ный вектор способен акцептировать до 40-50 тыс. пн. При этом совмещаются плазмидные репликаторы и сов-сайты фага л- в одном

197

геноме. Космидам присущи свойства фагов и плазмид, то есть способности упаковывать свою ДНК в головке фагов и автономно реплицироваться. Свойства фагов и плазмид объединяют в себе фазмиды, к которым можно отнести и космиды.

Включение фрагмента чужеродной ДНК в вектор осуществля- ют по следующей схеме (рис. 686). Многие плазмиды несут транс- позоны.

Рис. 68а, б. а — плазмиды: I — Со1 Е1; II — рВК322; III — вирус 5У40; IV — челночный вектор для кишечной палочки и клеток обезьяны (1 — оп-сайт 5У40; 2

— промотор 5У40; 3 — вероятная сигнальная последовательность; 4 — последова- тельность, кодирующая гамма-интерферон; 5 — фрагмент кДНК; 6 — оп-сайт рВК322, 7 — ген устойчивости к ампициллину;

б — включение чужеродной ДНК в плазмидный вектор (схема): 1 — вектор, 2

— ген, 3 •— рестрикты, образовавшиеся под влиянием рестриктазы Есо И, 4-гиб- ридная (химерная) ДНК, Л-ДНК-лигаза.

Клонирование рДНК

Для клонирования рДНК используют так называемые пермиссивные клетки (от англ. рептйБвюп — разрешение). Клон — это большое число молекул или клеток, идентичных

198

исходной родительской молекуле или клетке. К числу пермиссив- ных клеток для включения в них рДНК относятся такие, в которых:

1) не разрушаются чужеродные ДНК или РНК собственными ферментами — нуклеазами,

2) срабатывает механизм репликации вектора,

3) проявляется выраженная активность промотора и/или тер- минатора транскрипции рДНК,

4. отмечается полный сплайсинг мРНК,

5. наблюдается эффективная трансляция мРНК,

6) нет выраженной активности пептидогидролаз, катализиру- ющих реакции гидролиза экспрессируемых чужеродных белков.

Излюбленными объектами в генной инженерии являются клет- ки Е. соп, Вас. виЫШз, БассЬаготусев сегеу1в1ае и некоторые другие. Е. соН — грамотрицательные, перитрихальные, прямые палочки (1,1-1,5x2,0-6 мкм — живые, или 0,4-0,7x1,0-3,0 мкм — высушенные и окрашенные); факультативный анаэроб, хорошо растет на про- стых питательных средах при 37°С, содержание Г+Ц в ДНК 50-51 мол% (по температуре плавления и плавучей плотности). Некото- рые серовары Е. соИ патогенны для человека (01, 02, 06, 08, 09, ОН, 015, 026, 055, 078, 0111, 0124, 0144, 0148 и др.). Е. сон чувствительна к включению векторов.

Вас. БиЫШБ — почвенные, спорообразующие, грамположитель- ные, непатогенные, прямые, перитрихальные палочки (0,7-0,8 х 2,0-3,0 мкм), хорошо растет на простых питательных средах при разных температурах (минимальная 5-20°С, максимальная 45-55°С), содержание Г+Ц в ДНК от 32 до 62 мол%; обладает высокой частотой трансформации (4%), с кольцевой хромосомой, на которой известно более 2000 локусов; содержит сайт-специфические нук- леазы, чувствительна к включению векторов.

Басспагошусев сегелавгае — аскомицетные, одноклеточные, сап- рофитные дрожжи (группа низших грибов), широко используемые в микробной биотехнологии для получения разных биологически активных веществ (БАВ). Вегетативные клетки этого вида однокле- точные, почкующиеся, круглые или, чаще, овальные, размером 2,5-11x2,5-30 мкм, хорошо растут на средах Сабуро, с пивным неохмеленным суслом и других при температуре 26°С; содержание Г+Ц в ядерной ДНК колеблется в средних пределах от 48 до 63 мол%; в отличие от бактерий они генетически более стабильны, не подвергаются фаголизису, способны гликозилировать собствен- ные белки (продуцируемые эукариотическими клетками белки, как

правило, функционально активны в форме гликопротеинов), их геном лишен оперонов, обладают тремя классами РНК-полимераз, и т.д. Другими словами — сахаромицетные дрожжи являются типичными эукариотами, поэтому в них лучше клонировать гены растений и животных. У 8. сегелтаае имеется 17 хромосом, на которых картировано свыше 600 генов. Для клонирования чуже- родных ДНК в дрожжевых клетках нередко используют челночные векторы, имеющие оп-сайты бактериальных и дрожжевых плаз- мид, а поэтому способные самостоятельно реплицироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. На рис. 68 схематично изображен челночный вектор иммунного интерферона (ИЧР-у),. который реплицируется в клетках обезьяны и Е. соЦ. В этом векторе содержится фрагмент из 342 пн, который включает оп-сайт и промотор из вируса 5У-40; данный фрагмент связан с фрагментом кДНК, включающим кодирующую последовательность пре-1ЫР-у, и с фрагментом рВК.322, содержащим ген резистентности к ампи- циллину и оп-сайт репликации рВЯ322.

У дрожжей выявлены 3 вида циклически замкнутых плазмид двух- и трехмикронная, митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК. Первые две относятся к разряду "эгоистических" критических, поскольку биологическое значение их остается скрытым, неясным. Лишенные селективных маркеров они представляют ценность в качестве векторов только после включения в них соответствующих хромосомных генов дрожжей, функционирующих как в дрожже- вых, так и в бактериальных (Е. соН) клетках. К таким генам относятся те из них, которые отвечают за биосинтез таких фер- ментных белков, как аргининсукцинатлиаза, аспартат-транскарба- милаза, галактокиназа, дигидрооротатдегидрогеназа, триптофан- синтаза и др.

Известно 5 типов дрожжевых векторов, образующих У-группу (от англ. Уеав15 — дрожжи): У1р, УЕр, УКр, УСр, УЬр. Первые из них (УТр) представляют собой интегративные плазмиды, в которых только один ген принадлежит дрожжевой ДНК, остальные гены относятся к бактериальным. У1р не способны реплицироваться в клетках 5. сегеламае, но осуществляют их трансформацию, интег- рируясь в хромосому через рекомбинацию.

Векторы УЕр — эписомалъные плазмиды, сконструированные на основе двухмикронной плазмиды. Частота трансформации 5. сегеу181ае этими векторами на три порядка выше, чем в случае использования УТр, но, к сожалению, получаемые трансформанты мало стабильны.

Векторы УКр — репликативные плазмиды, включающие хро- мосомные репликаторные последовательности, именуемые агз-по- следовательностями (от англ. аиимютошгу герлсагшд ведиепсе — автономно реплицирующаяся последовательность). Трансформан- ты дрожжей, получаемые с помощью УКр, нестабильны.

Векторы УСр в виде кольцевых мини-хромосом содержат цен- тромеры дрожжевых хромосом и репликаторы агз1 и агз 2. Они стабильны при митозе и мейозе, и наиболее перспективны для клонирования генов.

Векторы УЬр — линейные мини-хромосомы, конструируемые на базе УСр. Для этого вводят специфические, шпилечные по форме, нуклеотидные последовательности на концах хромосом (теломеры) в кольцевые плазмиды УСр с последующей линеариза- цией плазмид.

Плазмиды и фаги обеспечивают перенос чужеродной ДНК в качестве инертной части генома, поэтому их называют еще кло- нирующими векторами. В биологической технологии выгодны мультикопийные плазмиды (10-20 на клетку). Если же плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации, когда прекращается размножение бактерий, то они (плазмиды) накапливаются числом до 1000 на клетку — в результате больше образуется целевого продукта. В отличие от хромосомы репликация плазмиды в пермиссивной клетке может происходить при останов- ке синтеза белка, Вот почему, например, при добавлении левоми- цетина к культуральной жидкости сопровождается заметным воз- растанием числа копий плазмиды (увеличение степени клониро- вания).

Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются различными методами: трансформации, инфекции, микроинъек- ций. При естественной трансформации рДНК может проходить через интактную клеточную стенку Вас. зиЫШв, 51гер1ососсиз рпеитошае, некоторых штаммов Е. соН с ингибированной систе- мой деградации ДНК, и др.

В 1970 г. М. Мандель и А. Хига предложили метод обработки бактерий хлористым кальцием на холоду в целях трансформации ДНК фага в клетки Е. соИ. Этот метод используется и теперь. Этапы его примерно следующие:

1) выращивание культуры в питательной среде при оптималь- ной температуре в течение суток с последующим разведением примерно в 50 раз свежим питательным бульоном, выращиванием

до Абоо=0,2 (показатель плотности) и охлаждение во льду;

2. центрифугирование суспензии при 3000 д 10 мин, темпера- туре 4°С и разведение осадка клеток в 0,1 М СаС12, охлажденного во льду, с последующим центрифугированием при тех же условиях;

3. ресуспендирование осадка в минимальном количестве (на- пример, в 1 мл) охлажденного во льду 0,1 М растворе СаСЛг, хранение до использования при 4°С. Это и будут пермессивные компетентные клетки, готовые претерпевать трансформацию; если такие клетки, ресуспендированные в 0,1 М СаСк, 30% глицерине заморозить при -70°С, то их можно хранить в течение нескольких месяцев;

4. добавление плазмидной ДНК к компетентным клеткам (при- мерно 0,1 мкг ДНК в 0,2 мл суспензии клеток), выдерживание во льду 1 час;

5) тепловой шок смеси при 42° С 5 мин.;

.6) разбавление пробы в 10 раз питательным бульоном, инкуба- ция 1 час на качалке при 37"С; за это время, например, признак резистентности к какому-либо антибиотику успевает экспресси- роваться;

7) посев клеток в серии разведений на чашки Петри с пита- тельным агаром, содержащим соответствующий(-ие) антиби- отик (-и), выдерживание в течение суток при оптимальной темпе- ратуре;

8) изоляция нужной колонии и размножение клона.

рДНК можно ввести в клетки млекопитающих путем слияния протопластов, например Е. соН, содержащих рДНК, с культивиру- емыми эукариотическими клетками в присутствии полиэтиленгли- коля, или ПЭГ, способствующего слиянию протопластов.

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последова- тельностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией. Альтернативный метод — использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая клетка инфицируется — (заражается) вирусом. В качестве векторов при этом чаще используют литические вирусы типа вируса полиомы и ЗУ40, а также челночные векторы, сконструи- рованные на основе ретровирусов и пагшлломавирусов.

На растительных объектах можно выполнить генно-инженер- ные эксперименты, используя методы трансформации и инфици- рования (см. рис. 141).

Метод микроинъекцйи используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные мик- роиглы (рис 69). Этот метод впервые продемонстрировали Дж. Е. Мерц и Дж. Б. Гердон в 1977 г. на ооцитах лягушек Хепорие.

з

Рис. 69. Микроинъекция в ядро ооцита (1 — ооцит, 2 — пигментиро- ванная половина, 3 -— микропипет- ка, 4 — ядро ооцита, 5 — часть нейлоновой сетки для чашки Петри).

■ 141 ^С1ПИ^1Л ..... ..X., .

////// I

рДНК можно переносить в пермиссивные компетентные клет- ки с помощью липосом, приготавливаемых из смеси фосфатидил- серина и холестерина (1:1). Например, удается ввести ген (3-лакта- мазы из плазмиды рВК.322 в отрицательно заряженные липосомы при обработке их ультразвуком. Последующая инкубация "озву- ченных" липосом с клетками различных культур сопровождается приобретением В-лактамазной активности у этих клеток. На плот- ной питательной среде клетки, несущие рДНК, размножаются и огромное потомство их (при этом все клетки тождественны) назы- ваются клоном. Сумму всех клонов, в которую входят почти все кДНК, соответствующие множеству разных мРНК, образуемых клеткой, называют "библиотекой кДНК".

Амплификация и экспрессия генов

Амплификация — это образование дополнительных копий хромосомных последовательностей. Обычно в биотехнологии при- меняют малые плазмиды длиной около 3 мкм в разомкнутом состоянии. Такие плазмиды не передаются при конъюгации, например, прокариотических клеток. Эти плазмиды называют нетрансмиссибельными. Однако они могут быть переданы методом трансформации. В результате амплификации на одну клетку нередко приходится 10-30 копий нетрансмиссибель- ных плазмид, что существенно повышает клеточную продуктив- ность применительно к целевому продукту (белку). Схематично амплификация представлена на рис. 70.

Рис. 70. Амплификация нетрансмиссибельной плазмиды в реципиентной про- кариотической клетке (схема): 1 — клетка-донор (а — нуклеотид, б — нетрансмис- сибельная плазмида), 2 — клетка-реципиент, 3 — лизис, 4 — обработка раствором кальция хлорида на холоду (или протопластирование, голодание, обработка ионами лития), 5 — клетка реципиент с "разрыхленной" клеточной стенкой, 6 - трансформация, 7 - клетка-реципиент с нереконструированной клеточной стенкой, содержащая плазмиду, 8 - реконструкция клеточной стенки, 9 - клетка-реципиент с реконструированной клеточной стенкой, содержащая плазмиду, 10 - амплифи- кация плазмиды, 11 - плазмиды (25), образовавшиеся в реципиентной клетке в результате амплификации.

Множественные (аплифицированные в миллион раз) копии определенных фрагментов ДНК получают т уИго с помощью широко используемой в настоящее время полимеразной цепной реакции, или ПЦР. Ее впервые описали в 1985 г. Р. К. Сейки, С. Шарф, Ф. Фалуна, К. Б. Муллис, Г. Т. Хорн, X. А. Эрлих и Н. Арнхейм. ПЦР высоко специфична и чувствительна, с ее помощью можно обнаружить, размножить и исследовать даже единичную копию гена в исходном материале. В течение трех часов обычно протекает 30 циклов,амплификации.

Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК. Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 основа- ний, представляющие собой концевые последовательности инте- ресующего нас фрагмента ДНК. Используя комплементарные к этим участкам олигомеры—праймеры, запускают амплификацию. Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК, а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, от- жига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера). Тепловая денатурация сопровождается расплетением двойной спи- рали ДНК. При снижении температуры имеет место отжиг олиго- нуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных праймеров со своими комплементарными последовательностями. Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой

в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, и в результате достраивается новая комплементарная цепь ДНК.

При повторных циклах тепловой денатурации, отжига и синтеза образовавшиеся новые нити ДНК выступают в качестве шаблонов (матриц) для праймеров, что вызывает экспоненциальное нараста- ние участка ДНК, ограниченного праймерами, входящими в состав этих фрагментов.

К завершению 20-30 циклов амплификации фрагменты ДНК представлены с избытком в сравнении с остальной геномной ДНК со свободными концами и образовавшейся в первом цикле ампли- фикации (рис. 71-1).

Практически эффективность каждого цикла амплификации составляет 20-50% от теоретически возможной (2²⁰ > 10⁶ при 100%-й эффективности). Следовательно, можно получить возрастание ко- личества специфической последовательности кратное миллиону.

В случаях амплификации геномной ДНК из клеток (тканей) позвоночных животных иногда происходит накопление фрагмен- тов неясного происхождения. Тогда проводят серию дополнитель- ных амплификации, применяя другой набор олигонуклеотидных праймеров — "пев1ес1 рпгпегз" (от англ. пев1 — гнездо, гнездиться, рптег — начальный, основной). В этой связи и метод называют певчей оНдо" (от греч. оЦдов — малый). В данном методе продукт первичной ПЦР используется в качестве матрицы в последующих циклах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имею- щими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифи- цированного фрагмента. При этом получается множество укоро- ченных (по сравнению с исходным) фрагментов индивидуальной последовательности ДНК, которые затем подвергаются необходи- мому анализу.

Таким образом, под названием ПЦР понимают основной цикл денатурации, отжига и синтеза фрагментов ДНК в присутствии ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и прайме- ров. Процесс по существу является цепным, так как продукты данной реакции служат матрицей для последующих реакций.

На первых этапах использовали в ПЦР так называемые "кле- новские фрагменты" ДНК-полимеразы I Е. соЦ (названы по фами- лии ученого — X. Кленова), которые оказались термолабильными, и после каждого цикла денатурации необходимо было добавлять новую порцию фермента. Кроме того, при пониженной темпера- туре отжига снижалась специфичность амплификации.

С выделением термостабильных ДНК-полимераз, в частности, из бактерий Тлептшв адиайеив (Тад-полимераза)и Ругососсив

205

сЗ Ь =

□ = □оопос □□гллсюО

| Цикл 1

Цикл 2

а

б

в г

3'

5"

_I

5' 3'

I

Циклы 3-25

_ГгН1

а=

■

НШ2 мм 2

в

(0.5 рМ)

30 1^

0.5 рМ Р5 ДНК 5-10 рМ 55 ДНК

IV

3'<

II

Рис. 71. Схема полимеразной цепной реакции (ПЦР): I — в классическом исполнении (а—ДНК-мишень, б — праймер в ПЦР, в — новая ДНК, г — направление амплификации, дс — денатурация и синтез); II — заякоренная ПЦР (1 — мРНК, 2 — синтез кДНК, 3 — наращивание полидезоксигуанозинового конца, 4 — приго- товление заякоренного полидезоксицитидинового праймера и синтез второй нити ДНК, 5 —добавление специфического праймера, амплификация при использовании обоих праймеров, 6 — концевой праймер, 7,8 — якорный праймер); III — инверти- рованная ПЦР (1 — кор с известной нуклеотидной последовательностью, 2 — место действия рестриктазы, 3 — "переваривание", 4 — циклизация, 5 — рестрикция в пределах кора, , 6 — добавление праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов и Та^-полимеразы, 7 — амплифицированная область, фланкирующая кор); IV — асимметричная ПЦР (А — праймер в избытке, 50 пикмолей -рМ; В — лимитирован- ный праймер — 0,5 рМ; ц — циклы, <к — двухнитевая ДНК, 88 — однонитевая ДНК).

\тоевп (Р\то-ДНК-полимераза), существенно возросла эффектив- ность ПЦР. Тад-полимераза сохраняет активность после тепловой денатурации ДНК и не возникает необходимости заменять фер-

мент после каждого цикла. Температурный оптимум реакции составляет 70-75^сС, что значительно повышает специфичность, количественный выход и возможную длину копий амплифициру- ющихся фрагментов ДНК.

На рис. 71-1 полностью показаны лишь два первых цикла. Начиная с третьего цикла, не отражена судьба исходной ДНК и продуктов достройки, синтезированных на ее цепях. Длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются в арифметической прогрессии, тогда как короткие фрагменты, ог- раниченные на концах праймерами и впервые появляющиеся в конце третьего цикла амплификации, накапливаются в геометри- ческой прогрессии.

Недостатки ПЦР: возможное загрязнение при взятии образцов материала для анализа, для каждой пары праймеров требуются индивидуальные условия реакции, ПЦР опирается только на точ- ную информацию о секвенировании последовательностей.

Однако преимущества ПЦР несомненны и практические воз- можности ее огромны. Затравочным материалом для ПЦР можно использовать мРНК. Тогда с помощью обратной транскриптазы синтезируют кДНК, которую затем используют в качестве матрицы для амплификации. В случае применения одного известного прай- мера, второй праймер будет искусственным, представляющим собой якорную последовательность, присоединенную к гомополи- мерному "хвосту". Такой подход называют якорнойПЦР (рис. 71-П). Известна еще инвертированнаяПЦР, когда пара праймеров отжигается с известной последовательностью, но ори- ентируется таким образом, что синтез идет в противоположном направлении через зону с неизвестной последовательностью (рис. 71-Ш).

В 1988 г. описана асимметрическаяПЦР, в которой происходит амплификация однонитевой ДНК (рис. 71-IV).

В 1987 г. фирмой Регкап-Е1тег Сегив (США) разработана авто- матизированная приборная техника для ПЦР, которая благотворно сказалась на генетических исследованиях. В 1991 г. этойже фирмой предложена вторая генерация ПЦР-технологии с использованием амплификатора 9600 (Сеп Атр РСР. 5ув1ет 9600), благодаря кото- рой удалось достичь новых порогов чувствительности и продук- тивности ПЦР (таблица 21).

Фирма "Ока" (г. Пущино, Московская область) предлагает собственный оригинальный амплификатор высокого качества, по стоимости более дешевый, чем зарубежные аналоги.

20/

Функциональная активность генов проявляется в периоды транскрипции и трансляции и называется экспрессией генов. Степень сродства РНК-полимеразы к промотору оперона обусловливает эффективность транскрипции, а стабильность мРНК и ее способность связываться с рибосомами обусловливает эффективность трансляции.

Экспрессия прокариотических генов преимущественно зави- сит от выбора промотора в клонируемых генах тех же или близ- кородственных видов. Чем отдаленнее геномы прокариотических клеток друг от друга, тем система "транскрипции-трансляции" генов срабатывает хуже или вообще не срабатывает. Вот почему здесь важными оказались векторы.

Экспрессия эукариотических генов в прокариотических клет- ках не реализуется или реализуется с большим трудом. В ядерных генах эукариот имеются интроны, а у бактерий нет системы сплайсинга, поэтому образующиеся чужеродные конечные про- дукты в бактериальных клетках, как правило, неактивны. Однако использование векторных систем (в том числе "челночных") и ПЦР позволило успешно решать проблемы, связанные с созданием рДНК их клонированием и экспрессией в различных реципиент- ных клетках (прокариотических и эукариотических).

Экспрессия генов сопровождается, как правило, выработкой белковых молекул. Поэтому важно использовать такие клетки,

208

несущие рДНК, которые секретировали бы белок во внешнюю (культуральную) среду. Если этого не происходит, то для получения целевого продукта приходится разрушать (дезинтегрировать) клет- ки и уже из "экстракта"—дезинтеграта выделять соответствующий белок. Е. соЦ, выступая на первых порах в качестве монопольной "рабочей лошадки" биотехнологии, оказалась затем менее пригод- ной, чем, например, Вас. БиЫШз, Р. аегидтова, 5. сегела81ае и другие виды, в отличие от которых Е. соИ почти совсем не секретирует белки. Лишь недавно с помощью ВКР-векторов удалось преодолеть барьерную функцию оболочки Е. соН и трансформировать ее в секретирующую клетку (от авт. Вас1епост Р.е1еазе Рго1ет).

В настоящее время, на основании экспрессии соответствующих генов в рДНК удалось внедрить в производство штаммы бактерий и дрожжей, продуцирующие инсулин, соматотропин, интерферо- ны, интерлейкины и т. д. Получены штаммы — суперпродуценты некоторых веществ; выведены бактерии, способные очищать ка- менный уголь от серы и превращать его в жидкое и газообразное топливо. Применительно к фитобиотехнологии удалось создать растения повышенной кормовой и питательной ценности, с воз- росшей активностью фотосинтеза и азотофиксации, резистентные к некоторым микробам — фитопатогенам и др.

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности_;с соматотропином, или гормоном роста) оказались важ- ными для животноводства (возрастание привесов животных, лак- тации). Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс- генных животных. Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изуча- ются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме. Схема получения, например, трансгенных мышей введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо приведена на рис. 72.

С получением трансгенных животных открываются перспек- тивы развертывания заманчивых исследований на рубеже XX и XXI вв. Уже сегодня имеется информация о том, что в Эдинбурге (Великобритания) есть стадо овец, несущих гены человека, инду- цирующие выработку факторов свертываемости крови (борьба с гемофилией у человека благодаря, например, использованию в

209

линия СВА/1

неполовозрелая производитель х половозрелая

линия РАККЕ5

вазэктомияхо \ ⁴

стерильный самец

гиперовуляция х.

естественное

спаривание

псевдобеременная реципиентная самка

коллекция преимплантированных эмбрионов

оплодотворенное одноклеточное яйцо мышь-кормилица

пересадка в яйцевод

|микроинъекции|

I

выделение и очистка ДНК рождение

естественным путем

выделение ДНК из тканей хвоста ^—

кесарево и вскармливание

анализ выделенной ДНК

идентификация трансгенных мышеи

скрещивание анализ экспрессии генов

Рис. 72 Схема получения трансгенных мышей.

пищу овечьего молока, где содержались бы такие факторы); удалось ввести ген гормона роста крупнорогатых животных в геном клеток поросят, заставили расти их быстрее и с меньшим количеством жира. Однако подобные результаты, очевидно, будут сопряжены и с неудачами. Необходимы кропотливые исследования во всех направлениях генетической инженерии, чтобы добиться успехов в практическом воплощении наиболее приемлемых результатов в биологическую технологию.

В связи с экспрессией генов большое значение приобретает "белковая инженерия", дорожку которой проторила генетическая инженерия, первая вытекает из второй и, следовательно, белковая инженерия также является методом науки "Биологическая техно- логия". Целевые установки здесь сводятся к изучению и понима- нию главного звена в структуре ферментов (почему они функци- онируют так, а не иначе?), к возможности научиться видоизменять природные белки или, того больше, уметь их заново проектировать, к выяснению причин и механизмов изменения фенотипа под влиянием генотипа.

Природные белки имеют свою молекулярную архитектонику — то это вытянутые, то специфически изогнутые или скрученные структуры. Поэтому в научной литературе, посвященной белковой инженерии, можно встретить выражение "архитектурный дизайн", кода говорят о конструировании молекул белков с заданной архи- тектурой по заведомо и специально подобранным аминокислотным текстам. Белковая инженерия в любом проявлении будет базиро- ваться в основном на продуктах экспрессии естественных и ре- комбинантных генов.

Таким образом, последовательность этапов клонирования и экспрессии гена может протекать в следующей очередности:

1. сортинг хромосом (может быть автоматизированным) и получение ДНК (или только выделение ДНК, например, из прока- риотических клеток);

2. введение ДНК в вектор (плазмидный);

3. трансформация (трансфекция, инфекция, инъекция);

4. обнаружение и накопление клона (клонирование) клеток;

5. выделение рДНК (плазмиды);

6. определение нуклеотидной последовательности в клониро- ванном фрагменте рДНК (может быть автоматизировано);

1. конструирование и построение плазмиды для экспрессии ее функций;

7. трансформация;

9) обнаружение и накопление клона;

10) выделение плазмиды;

11) проверка нуклеотидной последовательности в рДНК (может быть автомтизировано);

12) трансформация;

13) вырагцивание культуры на предмет получения экспресси- руемого белка;

14) выделение белка.

Каковы же место и роль рДНК-биотехнологии в человеческом обществе?

На фоне растущих народонаселения на планете Земля и эко- логических бед место и роль рДНК-биотехнологии определяются потребностью людей в пищевых продуктах и, прежде всего, в белках, в различных лекарствах; в исправлении многочисленных наследственных заболеваний. В общенаучном плане важными являются исследования: а) процессов переноса генетической ин- формации между видами и расшифровки механизмов функциони- рования клеток;

б) путей и методов создания новых существ — химер и новых организмов, возможно — монстров;

в) эволюции различных существ, включая человека (при допу- щении альтернативной оценки всего живого как вечной материи, подвергающейся изменчивости в пространстве и времени).

5.3. Изменчивость организмов и ее значение в биотехнологии. С каждым годом взаимоотношения различных организмов с окру- жающей средой все более осложняются—растет народонаселение Земли и неуклонно истощаются ее ресурсы. Уже сегодня количе- ство веществ, загрязняющих биосферу, трудно поддается учету или, в ряде случаев, не поддается совсем. По имеющимся данным первое место среди загрязнителей природы занимают пестициды (от лат. ревив — зараза, саейо — убиваю), второе — тяжелые металлы. С 1985 по 1990 год химическая промышленность произ- водила ежегодно не менее 250 млн. тонн продукции, из которых до 30% поступало в окружающую среду.

Несмотря на резкое отрицательное отношение людей к атом- ным электростанциям, не просматривается альтернативы термо- ядерной энергии, которая вместе с генной инженерией могут надолго обеспечить выживание человечества на нашей планете. С другой стороны, возрастание в обществе роли ядерных изотопов влекут за собой увеличение числа нежелательных мутаций (от лат. пшьаге — превращаться) в соматических и половых клетках. Все

212

это не может не отразиться на изменчивости организмов, включая и те из них, которые используются в биотехнологии.

Под изменчивостью понимают возникновение организмов с новыми свойствами (признаками) среди существующего разнооб- разия живых организмов. Из трех типов изменчивости — моди- фикации, длительные модификации, мутации — наибольшее зна- чение для биотехнологии имеют мутации. Индуцированные мутан- ты теперь широко используются в производстве антибиотиков, аминокислот, ферментов и других продуктов.

Длительные модификации присущи только клеточным формам из надцарств прокариот и эукариот, но не акариот. При этом генотип клеток остается неизменным, а измененный фенотип, проявляющийся в формировании какого-либо устойчивого мета- болического цикла, кажущегося независимым от внешних условий, выступает мерилом автономности внутриклеточной среды. При многократных пересевах происходит как бы разбавление цитоп- лазмы в ряду последующих поколений клеток и исходные метабо- литы материнской клетки достигают ниже порогового предела, когда указанный выше метаболический цикл исчезает. В других случаях такой же эффект наблюдается при создании окружающих условий, не поддерживающих один из типов метаболизма и клетки из состояния длительной модификации возвращаются в исходное с присущей виду комбинацией признаков (фенотип). Таким обра- зом, при возникающих или исчезающих модификациях наблюда- ются массовые однонаправленные изменения клеток однородного генотипа, находящихся в среде обитания.

Особенности генотипа определяют фенотипические проявле- ния организма в заданных условиях. Поэтому и адаптацию можно определить как приспособление наследственно компетентной клет- ки (культуры, организма) к конкретным условиям существования.

При мутациях изменяется генотип, или наследственная консти- туция клетки (организма). Мутации могут быть неконтролируемы- ми (спонтанными) и контролируемыми (индуцированными). Пер- вые происходят с частотой 1 • 10"⁵ — 1 • 10"⁷ на одну генерацию для разных организмов; это значит, что за одну генерацию ненаправ- ленно изменяется одна клетка из 100 ООО или из 10^б клеток. Частота индуцированных мутаций возрастает в десятки-тысячи раз.

Факторы, вызывающие мутации, относят к разряду физиче- ских, химических или биологических, и называют мутагенами. Мутагены по действию подразделяют на два класса — прямого (на нуклеиновые кислоты) и непрямого, или опосредованного дейст-

213

вении из клеточной воды свободных радикалов, вступающих в реакции с кислородом клеточных структур (образование переки- сей), с органическими молекулами или взаимодействующих между собой. Происходит окисление или передача энергии молекулам ДНК (РНК). Свободно-радикальные процессы могут завершиться дезаминированием и дегидроксилированием оснований, разрывом г4-гликозидных связей между основаниями и пентозой, деструк- цией пиримидинов, окислением пентозы, высвобождением пиро- фосфата. Вот почему различные излучения могут индуцировать самые разнообразные мутации. Так, например, одновременный разрыв сестринских хроматид у традесканции составил (по числу разрывов на 100 клеток/г) 0,99 — для нейтронов (1л + О); 2,1 — для а-частиц (родон) и 3,02 — для тепловых нейтронов; 0,27; 0,26 и 0,44 — для рентгеновских лучей с X 0,015нм, 0,15нм и 0,41 нм соответственно. Соотношения УФЛ и ионизирующих излучений приведены в таблице 22.

Ежегодно в мире синтезируется не менее 250 тысяч новых химических веществ, многие из которых (особенно — при круп- номасштабном производстве) попадают в окружающую среду. Подсчитано, что примерно 10% человечества подвергается дейст- вию потенциально мутагенных и токсичных химических соедине- ний.

Становление и развитие работ по химическому мутагенезу

связано с исследованиями отечественных генетиков: В. В. Сахарова (1933), М. Е. Лобашова (1934), И. А. Рапопорта (1938), а также зарубежных ученых: Ш. Ауэрбах (1940), Вестергаард (1959), Мандел и Гринберг (1960) и др. В 1966 г. И. А. Рапопорт предложил термин "супермутагены" для веществ, обладающих исключительно высо- кой мутагенностью и заметно не влияющих при этом на жизне- способность клеток и организмов.

К химическим мутагенам относят: ингибиторы синтеза нукле- иновых кислот (НК), аналоги азотистых оснований, алкилирующие соединения, окислители, восстановители, свободные радикалы, акридиновые красители, некоторые антибиотики (таблица 23).

Как видно из таблицы 23 среди ингибиторов синтеза предше- ственников НК имеются антиметаболиты (азогуанидин, 5-аминоу- рацил, 6-меркаптопурин, 5-фтордезоксиуридин). Нуклеозиды, со- держащиеся в клетках или добавляемые извне, играют роль анти- мутагенов, снижающих мутагенный эффект названных веществ.

5амУ ^ Г-

На примере 5-аминоурацила — аналога урацила можно показать путь возникновения 50% потомков после двух циклов репликации му- тировавшей клетки под действием мутагена. 5-Аминоурацил по хими- ческому строению близок к тимину и поэтому легко комплексируется о аденином. Кето-форма 5-аминоу- рацила более стабильна, чем его энольная форма, однако последняя образуется и существует какое-то время, в течение которого он мо- жет спариваться с гуанином — это так называемая ошибка включе- ния. Тогда очевидно, что вместо пары Г-Ц появится пара А-Т или

_{Гк м г г г} А-5аминоУ (А-амУ). Аналогичная ситуация мо-

•мУ

II

И амУ

^Т II А

||| ||| жет складываться при использовании 5-брому- рацила (5-БУ) и прибавка в числе мутантов будет однократной. Мишень действия этого мутагена — фермент рибонуклеотидредукта- за. Мутации подобного рода происходят с не- большой частотой, поскольку они всецело за- висят от времени существования аналога нук- леинового основания в энольной форме (а

время это, как прави- ло, небольшое).

Смещение в комп- лементарности пар, или ошибка реплика- ции может происхо- дить по другой схеме:

т

Мутация здесь сохраняется до конца репликации ДНК, содер- жащей 5амУ (или БУ) и общее число мутаций возрастает с ростом числа циклов репликаций.

Подобный мутагенный эффект оказыва- ДО^^Чг^л ют и другие аналоги НК, например 6-мер- | II у капто- или 6-аминопурин. Мутагенное дей- ])^ / ствие 2-аминопурина проявляется на бакте- НлМ^^М N риях и бактериофагах, хотя в норме он * I имеется в цианофагах. Будучи аналогом азо-

2 -аммнопурни ^ тистых оснований нуклеиновых кислот, 2- аминопурин (Ал) индуцирует ошибку вклю- чения. В обоих случаях произош- ли МутаЦИИ ТИПа ТраНЗИЦИЙ (СМ.). ошибка включения а ошибка репликации

Ап может вызывать также и му- \ * ==

тации типа трансверзий (см.), хо- тя и редко. Для всех аналогов азотистых оснований характер- ны прямые и обратные мутации типа простых замен, например А=Т на Г = Ц или Ц = Г на Т=А (обратные мутации здесь Г = Ц заменяется на А=Т и А=Т — на Г=Ц).

Азасерин относится к двум подгруппам (см. таблицу 23). Его мутагенный эффект связывают с нарушением биосинтеза пуринов <3е полю и с радиомиметическими свойствами (от греч. гштков имитирующий).

Афлатоксин В1 вызывает сдвиг рамки считывания ДНК. Это можно показать на следующем примере:

ТГГГАТГЦ

ТГГГТАТТЦ АЦЦЦЦТАЦГ

АЦЦЦТАЦГ

ТГГГГГАТГЦ АЦ ЦЦЦТАЦГ

- выпадение одного Г

-добавление одного Г

Супермутагены часто приводят к мутациям, возникающих на пути 2. Кофеин в больших дозах оказывает прямой мутагенный эффект, вызывая разрывы хромосом, например в клетках дрозо-

220

филы, человека и других эукариот. В меньших концентрациях он действует как синергист с радиацией, ингибируя репарирующие ферменты.

В основе алкилирования НК лежат такие реакции как депури- низация с разрывом сахарно-фосфатной цепи в ДНК; взаимодей- ствие алкилирующих агентов с адениловой, цитидиловой и тими- диловой кислотами с последующей утратой способности алкили- рованных А, Ц и Т спариваться с комплементарными основаниями; взаимодействие с фосфатными группами НК; взаимодействие двух функциональных групп алкилирующего агента с нуклеофильными группами НК. Так, например, в случае удаления .гуанина из ДНК под влиянием какого-либо алкилирующего агента могут обнару- житься различные варианты изменений: восстановление исходной пары Г = Ц, ее выпадение, перекрестная замена Г = Ц на Т = А или на Ц = Г, простая замена Г = Ц на А = Т.

Супермутагены, вызывающие до 24% летальных мутаций, в основном относят к группе алкилирующих агентов. Эту группу подразделяют на следующие подгруппы:

1. Металлорганические соединения К-Ме, где К— органический радикал; например метилированная ртуть;

2. Галоидные алкилы (Алк) — (пН2п+1)К, где К — фтор, хлор, бром, йод; например, 1,2-дихлорэтан, 1,2-дибромэтан, 1,3-дихлорп- ропан;

3. Производные этилена (СН2=СН-В., где К. — двуокись азота, двуокись серы и др.); например, акрилоилэтиленимин;

4. Альдегиды (К-СОН, где К=Н, СН2-СН- и др.); например, формальдегид, акролеин;

5. Уретаны (НгИСООАлк); например, этил-уретан;

6. Диазоадканы (Алк = N ⁺ = 1Ч-); например, диазоуксусный эфир, диазометан, 1,4-бисдиазоацетилбутан;

7. Нитрозозамещенные соединения ( / ¹

где К1-Н, Алк, а Кг-Алк, остаток уретана, мочевины, гуанидина); например, нитрозометилуретан, нитрозогуанидин, нитрозоалкил- мочевины; Алк—о ^°

8. Диалкилсульфаты у⁸^*

_{Алк О О}

например, диметил- и диэтилсульфаты;

9. Алкилалкансульфонаты (эфиры сульфоно- д_лк_₀ О вых кислот с общей формулой, например, метил- метансульфонат и этилмеметансульфонат); 'г*

Алк О

10. Эфиры фосфорной и фосфористой кислот

АПК О. ^АлК 0^

Алк-0-^Р=0 ^Р—О—Алк

Апк—О АПК—О

11. Р -Хлорэтилсульфиды (иприты) с общей формулой и их азотистые аналоги, где К=Н, Алк и др.;

С1—Алк.

С1—Алк.

N—К К*Н,Апк

С1—Алк

С1—АПК

12. Эпоксиды, У\. ^{ГАе к=н}> ^и АР-.:

Сн₂—СН—К К=Н.Апк например, этиленок-

сид,

13

или окись этилена; Лактоны ^СН2)П~^—С=0 например,

14. Этиленимины

_{Л .}

сн₂—сн—и

\ / Р-пропиолактон;

, где К-Алк, Н и др.;

15. Производные фурана, например аф- латоксин В1, хлорбензфуран и др.

16. Прочие.

Указанные соединения относят к разря- ду реактогенных, способных передавать свои радикалы азотистым основаниям в НК и взаимодействовать с остатками фосфор- ной кислоты.

По числу активных групп алкилирующие соединения делят на моно- , би- и полифункциональные. Моно- функциональными, например, являются диметилсульфат, этилени- мин, этилметансульфонат и др., бифункциональными — Р-хлорэ- тилсульфиды и их азотистые аналоги, полифункциональными —

222

дихлордиэтил-, метилдихлордиэтиламины, эфиры фосфорной и фосфористой кислот.

Нитросоединения (нитраты, нитриты, нитрозосоединения, окислы азота и др.) проявляют мутагенную активность на про- и эукариотах. Нитрозосоединения могут образоваться из аминосое- динений и нитритов в кислой среде желудка млекопитающих.

Под действием алкилирующих агентов возникают аддукты (от лат. айсгисгиз — приведенный, притянутый): 7-алкилгуанин (наи- более часто), 3-метиладенин, 0-6-метилгуанин, 0-4-алкилтимин и др. Малые дозы алкилирующих агентов индуцируют фермент метилтрансферазу, "принимающую на себя" алкильные группы. Клетки в этих случаях выживают. Данный фермент отсутствует у дрожжей, но есть у людей.

замены пс происходит

замена АТ на ГЦ

Еще в 50-е годы был изучен механизм мутагенного действия азотистой кислоты, проявляющийся в окислительном дезаминиро- вании нуклеиновых оснований, то есть в замене аминогрупп на гидроксил или кислород. Тогда аденин трансформируется в гипо- ксантин (Гкс), гуанин в ксантин (Кс), цитозин в урацил. Первый спаривается с цитозином, что приводит к замене А = Т'на Г = Ц, ксантин сохраняет способность спариваться (как и гуанин) с цитозином, что сопровождается заменой Г = Ц на А=Т.

Ошибки при спаривании оснований происходят путем транзи- ции или трансверсии. В первом случае один пурин заменяется другим пурином, один пиримидин — другим пиримидином. Во втором случае пурин замещается пиримидином или наоборот — пиримидин замещается пурином. Под влиянием г4-метил-г>1-нитро- г4-нитрозогуанидина больше возникает транзиций, чем трансвер- сий.

Мутагенный эффект гидроксиламина обусловлен его взаимо- действием с цитозином, тогда как гидразин разрывает кольца урацила и цитозина.

Метаболическая активность различных организмов может со- провождаться образованием перекисей, которые в определенных случаях могут быть мутагенами. Более того, перекиси выступают как бы связующим звеном между химическим и физическим мутагенезом (в частности, лучевым), учитывая факт их образования во время облучения клеток или тканей. При этом перекиси оказы- ваются мутагенами первого порядка, а например, калия цианид — мутагеном второго порядка. Это связано с тем, что КСЫ блокирует фермент каталазу (антимутаген) и, как следствие, клетка лишается защиты против мутагенного действия Н2О2.

~1—I—I—I—1—Г А Т Ц А Г Т

Т А АОТ Ц А

_] I I 1 [ 1_

-Р-Г-,—г-г-т- И II III II III II

А Т 1п8 А Г Т ^-^"^ Т А 1пз' Т Ц А

л I л I I 1_

II II II III II Вставки 1пз=1пз'

А Т А Г Т

Т А АО Т Ц А

I I I 1_

Т А Т Ц А

^ 1_4и 1 I

Выпадение 1пз — АО

Производные акридина (акридиновый оранжевый — АО, проф- лавин) и некоторые производные изохинолина (бромистый этидий) вызывают удлинение нитей ДНК (растяжение) на 1-2 нуклеотида, что приводит в итоге к выпадению или вставке мононуклеотида (прямые мутации).

Некоторые антибиотики — как мутагены обладают различными механизмами дейст- вия. Так, например, митомицин С подобен алкилирующим агентам. Он расщепляет двойную спираль ДНК за счет образования перекрестных связей. Антибиотики из груп- пы актиномицинов (в частности, актиноми- цин Д или дактиномицин), являющиеся ди- олигопептидилактиномицинами, ингибируют ДНК-зависимый синтез РНК.

Они специфически взаимо- действуют лишь со спирализо- ванными полидезоксирибонук- леотидами, содержащими гуанин (при этом существенна роль 2- аминогруппы пуринов в образо- вании водородной связи с хино- идным кислородом хромофора

НН

8 т. 8524

225

актиномицина). Они располагаются в малой бороздке нативной ДНК, мешая функционированию РНК-полимеразе.

Гликопептидные антибиотики блеомицины ингибируют синтез ДНК и клеточный митоз.

Аминогликозидные антибиотики (гигромицин В, стрептомицин) являются непрямыми мутагенами. Они нарушают белковый синтез благодаря взаимодействию с 30 5 субъединицами бактериальных рибосом и предотвращению связывания отдельных тРНК. При этом неправильно считываются пиримидиновые основания.

. Ряд алкалоидов высших растений (из родов Непоггоршт — гелиотроповых, Зепесю — крестовниковых и др.) и синтетических лекарственных веществ (изониазид, хлорпромазид, нитрофураны и др.) могут обладать мутагенным действием.

К биологическим мутагенам относят вирусы (фаги), живые вакцины, некоторые биотоксины, образуемые грибами, протозоа и гельминтами. Так, изменения в хромосомах вызывают цитоме- галовирус, вирус простого герпеса, герпетиформный вирус, вирус Сендай, вирус саркомы Роуса и др. Из грибных токсинов — мутагенов ранее был назван афлатоксин Вь Можно назвать еще треморген, образуемый рядом аспергиллов и др.

Фагоустойчивые мутанты актиномицетов и лактобактерий пред- ставляют интерес для соответствующих производств, например, антибиотиков и молочнокислых продуктов.

Мутагены различных классов (физические, химические, биоло- гические) используют в работе с биообъектами. При этом стремят- ся получить штаммы либо с какими-то маркерными признаками, важными для расшифровки механизмов мутагенеза, либо штаммы

— суперпродуценты БАВ, существенно увеличивающие выход конечного продукта в сравнении с контролем.

При целенаправленном получении мутантов необходим их от- бор, или селекция, значение которой исключительно велико в выведении различных пород животных, многих сортов злаковых, декоративных и многих других растений, в получении микробов

— суперпродуцентов БАВ (ряда антибиотиков, аминокислот, вита- минов и других субстанций). Для сравнения можно указать на успехи с селекцией мутантов пеницилла, исходный штамм которо- го, выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной жидкости.- Тяготы второй мировой войны 1939-1945 гг. вынудили ученых вернуться к этому виду гриба и заняться генетико-селек- ционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивиро-

226

вания РешсШшт спгуводепит, был выделен штамм № 1951 с ативностью 100 ЕД/мл. Его колония и стала родоначальницей всех производственных штаммов в различных странах мира. Используя селекцию и комбинированное воздействие различными мутагена- ми (преимущественно — УФЛ и алкилирующие агенты), уже в начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, обра- зующий пенициллин в количестве 5 ООО ЕД и более в 1 мл культуральной жидкости. В настоящее время используются штам- мы, продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл среды.

Следует различать понятия "селекция" и "интродукция" (от лат. 1п1гос1исио — введение). При селекции используют методы выве- дения новых форм организмов, отличающихся по свойствам от исходных родительских организмов. При интродукции выделяют из естественных (природных) и искусственных (производствен- ных) условий существующие организмы, наиболее пригодные для практических целей. В успехах селекции велика роль контролиру- емого мутагенеза, тогда как успехи интродукции опираются на генофонд, заведомо присущий организму. Селекция и интродукция животных и растений возникли раньше генетики. Основные под- ходы при этом концентрировались преимущественно на скрещи- вании организмов и отборе возникающего потомства.

Применительно к микробам сформировалось четыре подхода, используемых в селекционной работе:

1. отбор естественных штаммов, обладающих ценными призна- ками, проявляющимися в конкретных условиях их существования (этот подход во многом аналогичен интродукции высших эукариот); при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее при- способленная форма вытесняет исходную в популяции. В анализе таких популяций полезны флуктуационный тест (от лат. ДисШаИо — колебание) и метод отпечатков. С помощью первого доказывают спонтанность мутаций по маркерному признаку (от англ. тагк — знак, метка), с помощью второго отбирают нужные колонии, вырастающие на селективной среде. Этот первый подход опира- ется на естественный ход событий у микроорганизмов в изменен- ных условиях (естественный отбор);

2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными для человека признаками, возникшими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для микроба и поэтому трудно создать условия выращивания культуры,

227

в которых относительно легко удавалось бы выделять нужные варианты. При этом необходимо проверять большое число клонов и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным или небольшим;

3. ступенчатая селекция — эффективный метод искусственного отбора форм с применением мутагенов (см. ранее приведенный в этом разделе пример с продуцентом пенициллина). С помощью мутагенов увеличивают изменчивость тест-культур, а среди послед- них отбирают наиболее перспективные; такой подход, как правило, использ\ ют многократно (ступенчато), добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активность, продуктив- ность и др.);

4. гибридизация — как метод выведения полезных форм мик- роорганизмов. Здесь имеется аналогия с методом скрещивания у высших эукариот. О гибридизации см. в этой главе ранее.

Микроорганизмы, как и высшие организмы, способны соби- рать и перераспределять уже имеющуюся информацию между родственными, но генотипически неоднородными клетками. Это происходит при трансформации, трансдукции и конъюгации у бактерий, при половой и соматической гибридизации у растений и животных. Яркий пример здесь с гибридомами, продуцирующи- ми моноклональные антитела (см.).

'г!