1. миеломные клетки — миеломные клетки,

2. миеломные клетки — В-лимфоциты,

3. миеломные клетки — любые клетки селезенки,

4. клетки селезенки — клетки селезенки.

5. На селективной среде погибают партнеры первой системы; четвертая пара клеток не растет в культуре, поскольку оба партнера не пролиферирующие. Гибридные клетки третьей пары немного- численны и слабо растут, они вскоре погибают (к тому же они отличаются по морфологии вырастающих колоний от второй пары клеток). Гибридные клетки второй системы быстро растут при потере хромосом у непролиферирующего партнера (В-лимфоци- ты). Поэтому формируются две группы гибридом — секретирую- щие и несекретирующие 1д. Первые медленно растут и поэтому возникает проблема — не потерять их в последующих операциях.

   Таким образом, особенности гибридизации заключаются в том, что неслившиеся клетки селезенки лишены способности к длитель- ному культивированию (они исчезают), тогда как миеломные клетки, напротив, за счет своих потенций к росту могут вытеснить гибридные клетки. Чтобы этого не произошло, используют селек- тивные среды. Так, отбирают миеломного родителя с генетическим дефектом по ГГФРТ, не использующего экзогенный гипоксантин

   соон

   Аминоптерин (4-аминофопиевая кислота)

   для синтеза пуринов. Клетки селезенки не обладают таким гене- тическим дефектом и поэтому миеломные клетки, не синтезирую- щие нуклеотиды, через определенноевремя исчезают из культуры. Гибридомы остаются единственными делящимися клетками. Тогда через сутки инкубации 50% объема среды заменяют на среду, содержащую 10"⁴ М гщтоксантина, 10"⁵ М аминоптерина и 4 • 10"⁵ М тимидина (среда ГАТ). Среду сменяют каждые сутки в течение двух дней, а затем — один раз через 48 часов. Примерно через 2 недели гибридомы начинают активно расти. Необходимо следить, чтобы не было слишком густого роста — признак развития поли- клональной популяции; негустая суспензия клеток обеспечивает рост моноклональных гибридом (выживаемость клеток при этом невысокая).

   В течение 10—14 дней дефектные клетки элиминируются. Миеломные клетки, устойчивые к бромдезоксиуридину, дефектны по тимидинкиназе (ТК), а устойчивые к 8-азогуанину, не содержат ГГФРТ (ГГФРТ). Эти клетки не располагают обходными путями синтеза пуринов или пиримидинов, но способны синтезировать

I—соон

^н2>2

основания для ДНК и РНК, используя путь, блокируемый аминоп- терином (а, б).

Углеводы

+ Аминокислоты

8=Азогуанин

Основной путь

Аминопте— риновый блок

Нуклеотиды » ДНК

-| ГТФРТ

"Г

тк

Исходная опухолевая клетка

(ГГФРТ⁺,ТК⁺)

Мутантные опухолевые клетки

(ГТФРТ", ТК")

ГТФРТ, ТК Вспомогательный путь

Основания + Нуклеозиды

Мутанты (ГГФРТ-,ТК")

5=Бромдезокси— уридин

(б)

Схема получения мутантных опухолевых клеток

Основной и вспомогательный пути синтеза нуклеотидов у

гибридных клеток

На селективной среде ГАТ клетки ТК^- и ГТФРТ^- не растут и погибают; на ней растут природные клетки миеломы, но они выживают недолго (несколько суток). Лишь гибридные клетки выживают на среде ГАТ при условии наличия у них генов, коди- рующих ТК и ГТФРТ (в Х-хромосоме). Схема получения гибридомы показана на странице 577.

При наличии гибридов производят смену среды Дальбекко (без аминоптерина) в течение последующих 14 дней и, наконец, добав- ляют минимальную модифицированную среду Дальбекко. После этого следует скрининг (от англ. зсгееп — решето, просеивать) гибридных клеток по образованию антител, используя серологи- ческие реакции, радиоиммунный, иммунофлуоресцентный или иммуноферментный анализ. Более чувствительный из них радио- иммунный метод.

Только часть клеток оказывается продуцентами 1д. Положи- тельные гибриды сразу же клонируют и реклонируют во избежа- ние реверсии, или возврата к неактивному состоянию.

Из разных способов клонирования наиболее широкое распро- странение получил метод предельных разведений, когда стремятся получить одну гибридомную клетку на ячейку платы с вероятно- стью в 63%, что следует из распределения Пуассона: 1(0) = еЛ где ДО) — число ячеек без роста, л. — среднее число клонов на ячейку, е" — основание натурального логарифма; при Л.-1 значение Г(0)

равно 0,37, то есть гибридомные клетки, посеянные с эффективной концентрацией одна клетка на ячейку, не вырастут в 37 ячейках из 100. Фактически вероятностный процент роста гибридомных клеток будет ниже, поскольку не все из них дают растущие клоны. Вот почему на практике высевают их с разными концентрациями. Оценку растущего клона в ячейке проводят визуально.

Миеломные клетки ХбЗ—Ад8 Приготовление суспензии

(селезеночных клеток подсчет | подсчет центрифугирование в растворе Эрла (200 д) 10 минут

10 клеток I 10" клеток

Объединение клеток, центрифугирование (200 д) 10 минут

+ ■ к 1 мл осадка I ГЛЕ=гемагтлюткнирующая

1000 ГАЕ вируса Сендай I единица

ресуспендирование

₁

20 минут на льду с периодическим встряхиванием

₁

30 минут при 37*С с периодическим встряхиванием

_I

Двухкратное отмывание в среде Дальбекко

₁

Ресуспендирование в 50 мл той же среды

_I

Распределение суспензии в лунки планшет (по 1 мл в 48 лунок) 1

Нл -дующий день добавление среды Дальбекко, содержащей ГАТ I

Смена питательной среды в течение 14 дней (каждый второй или третий день), удаление 0,5 объема + 0,5 объема свежей среды

₁

. Да •* гибриды ■ » нет

В последние годы отбор гибридом для клонирования проводят с использованием автоматизированного оборудования. На после- дующем этапе получают массовую культуру гибридомных клеток:

1. в культуре ткани — предпочтительный способ, так как 1д выделяют с большей чистотой;

2. в ферментаторах — суспензионная культура;

3. в организме сингенных животных (мыши, крысы). Накоп- ленные МкАТ (10—200 мгк/мл среды) выделяют с помощью выса- ливания аммония сульфатом до 95% чистоты, а, при необходимости, подвергают очистке (рис. 163).

Рис. 163. Схема получе- ния моноклональных анти- тел с помощью гибридом- ной техники: АС — агент слияния клеток, 1 —В-клет- ки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура мие- ломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибри- домы. 5 — селекция и кло- нирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —■ введение гибридом, об- разующих моноклональ- ные антитела, в организм сингенной мыши. 8 — клет- ки гибридомы, образую- щие моноклональные анти- тела, культивируемые в ви- де культуры ткани, 9 — вы- ращивание гибридомных клеток, образующих моно- клональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — им- муноглобулины в культу- ральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асци- тической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 —стандарти- зация 1д-ов, 12 — лиофили- зация 1д-ов.

Перевод гибридных клеток в большие объемы среды при крупномасштабном культивировании всегда сопряжен с большими трудностями, так как не каждый их клон выживает в таких условиях. Поэтому на практике стремятся делать разбавление "маточных" клеток постепенно, вначале 1:2—1:3, а затем и более, используя специальные культиваторы (рис. 164).

/ л/ «да*! ■ '.

Для выращивания гибридом в суспензионных культурах важны бессывороточные среды, посколь- ку это улучшает процесс культи- вирования в больших емкостях, снижает примерно в 500 раз бел- ковые примеси и заметно сказы- вается на снижении стоимости це- левого продукта. Фирма 51дта (США) выпустила в продажу та- кую среду (в сухом/жидком виде) под названием НуЪгу-Мах, не со- держащую сыворотки и белков (5РРР-5ешт Ргее, РгсЛет Ргее). 5РРР-среда включает аминокис- лоты, витамины, нуклеотидные предшественники, глюкозу, липи- ■-жки'^ман' ■уд.г* ды, прогестерон, неорганические щ ^» V ц яЯ^^^В ^{соли и}микроэлементы. Подобная

_'С- ¹

клеток Ъю1есшмс8,

среда рекомендована для слияния, клонирования, выращивания гиб- ридомных и миеломных клеток, а также для поддержания на соот- ветствующем уровне продукции антител. Всего в среде содержится 82 ингредиента (22 аминокисло- Рис. 164. Культиватор гибридомных ты, 12 витаминов, 27 неорганиче- (общий вид) фирмы 1ВР _{ских веществ й} 21 другое соеди- нение).

11.5.3. Применение моноклональных антител. Практическое использование МкАТ исключительно многообразное—в медицине и ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так, например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими-

579

либо характерными особенностями, по которым можно было бы их отличить от других клеток. К тому же в костном мозге на них приходится где-то порядка 0,05% от всех клеток.

Стволовая клетка и сывороточный белок а-фетопротеин, от- крытый Г. И. Абелевым, впервые появляются в желточном мешке эмбриона. Спустя некоторое время стволовые клетки переселяют- ся в печень эмбриона и там же интенсивно синтезируется сыво- роточный а-фетопротеин. В желточном мешке и печени протекает активное кроветворение. Позже синтез этого белка прекращается, а стволовая клетка перемещается в костный мозг, где и происходит кроветворение в течение всей последующей жизни"Ърганизма.

Используя МкАТ против поверхностного СО-белка стволовых клеток, ученые из США и Германии близко подошли к выделению таких клеток, массовое получение которых могло бы быть реша- ющим в терапии лучевой болезни, талассемии, тяжелых осложне- ний при иммунодефицитах, лейкемии и других заболеваний. На способности стволовых клеток к переселению основывается спо- соб лечения лучевой болезни внутривенным введением стериль- ного костного мозга.

Неоценимый вклад внесен в оценку СО-рецепторов клеток с помощью МкАТ. Это позволяет глубже понять механизмы клеточ- ных взаимодействий в целях направленного вмешательства для их коррекции при патологических состояниях.

Непреходяще значение МкАТ в диагностике, в том числе — при использовании иммуноферментного анализа в различных его вариантах, включая метку коллоидного золота. Например, чтобы локализовать тироксин-секретирующие клетки в образце ткани

щитовидной железы, эту ткань инкубируют с мыши- ным моноклональным анти- тироксином. Затем на обра- зец наносят конъюгат "анти- 1д-золото", специфичный к 1д-антитироксину. Фиксиру- ясь на моноклональном ан- тителе, конъюгат становится прекрасной меткой, выявля- емой в световом биологиче- Рис. 165. Схема взаимодействия конъюгата _ском микроскопе ПО крас- "анти-1а-золото" с моноклональным антителом _ .

-антитироксин" (2). заякоренным на срезе ткани ^нои «краске ЗОЛОта (рис. щитовидной железы (1). 165).

580

Очень важно использование МкАТ для прицельной доставки например цитостатиков в злокачественные клетки на предмет их деструкции и, как следствие, для лечения соответствующего боль- ного с опухолевым процессом.

При диагностике, например СПИД, на покрытой монОклональ- ными антителами ячейке выявляется концентрация антигенного белка р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) порядка 1,0—1,56 пикограмма в течение 1,5—3 часов; при цитомегалови- русной инфекции МкАТ типа Е-13 используют для выявления позднего антигена спустя 72 часа после заражения; важен вклад МкАТ в диагностику герпеса, краснухи, токсоплазмоза, различных бактериальных и грибковых инфекций, и т. д. В настоящее время около 30 компаний в мире производят МкАТ в виде диагностиче- ских наборов, а 13 компаний разработали оборудование или тех- нологические процессы, относящиеся к МкАТ; теперь на рынке имеются такие антитела против классов и подклассов иммуногло- булинов человека, отдельных белков человека и животных, гормо- нов и лекарств, и многие другие. Например, в 1991 г. американская компания "Сепюсог" выпустила в продажу новое моноклональное лекарство "Центоксин" для лечения сепсиса, вызванного грамот- рицательными бактериями.

Ныне издают книги и журналы, посвященные МкАТ, и уже это одно является веским доводом в пользу огромной роли их в фундаментальных и прикладных исследованиях самого широкого профиля.

11.6. Трансгенные животные. Включение чужеродных после- довательностей ДНК или трансгенов в геном макроорганизма — реципиента с последующей устойчивой их наследуемостью в ряду поколений обеспечивает получение так называемых трансгенных животных. Следовательно, процесс трансгенеза по своему меха- низму относится к генетической инженерии и, в частности, к генной и клеточной инженерии.

Доказано, что трансгены нередко экспрессируются, вызывая те или иные структуры и функциональные изменения вплоть до изменения "программы" развития организма. Подобного рода экс- перименты сулят заметный прогресс в области фундаментальных и прикладных разработок. К разряду фундаментальных относят: анализ различных отклонений в экспрессии нормальных и мути- ровавших генов, включая онкогены; осуществление направленного мутагенеза за счет введения в макроорганизм экспрессирующих

специальных "конструкций", предназначенных определенным ге- нам и т. д.

К разряду прикладных исследований можно отнести, например, получение быстро растущих трансгенных свиней, выведение трансгенных овец, образующих и накапливающих в молочных железах некоторые факторы свертываемости крови человека и др.

Для получения трансгенных животных, в частности — мышей, можно воспользоваться такими методами, как микроинъекции ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо, заражение предим- плантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, и, наконец, применение эмбриональных стволовых Е5- или ЕК-кле- ток.

Быстрота выполнения и надежность метода микроинъекций сделали его наиболее популярным среди специалистов-экспери- ментаторов. Используют различных линейных мышей, обеспечен- ных всем необходимым при хорошем их содержании в условиях вивария (животника). Обычно в опыт по микроинъекции берут не менее 20 гибридных самцов-производителей первого поколения (Р1) в возрасте 8—12 месяцев, когда они характеризуются хорошей производительностью. При слабой или низкой активности самцов к подсаживаемым самкам их заменяют. Донорами оплодотворен- ных яйцеклеток выступают не менее 10 неполовозрелых (12—14 г) гибридных самок первого поколения (Р1), подвергшихся супер- овуляции и спариванию с гибридными самцами Р1. Оплодотворен- ные одноклеточные яйца выделяют из операционно вскрытых яйцеводов самок-доноров спустя 12 часов после их спаривания с самцами-производителями. Выделенные яйца помещают в культу- ру на срок от 3 до 36 часов. От 10 самок можно получить 250 яиц, пригодных для микроинъекций.

Оплодотворенные яйцеклетки поддерживают на среде М16 в микрокапельной культуре в С0₂-инкубаторе тканей при 37°С и с 5% диоксида углерода. Все другие манипуляции с яйцеклетками вне инкубатора проводят в НЕРЕ5-забуференной среде М2 (НЕРЕ5 — это М-2-гидроксиэтилпиперазин — М'-2-этансульфоновая кис- лота). Компонентный состав сред (кроме НЕРЕ5) почти тождест- венен. Различие касается натрия бикарбоната, фенолового крас- ного, натрия пирувата и кальция хлорида дигидрата, доля которых в среде М16 больше, чем в среде М2. Остальные ингредиенты представлены КСЪ, ЫаСЪ, КН₂Р0₄, МдЗО 4 • 7Н₂0, натрия лактатом, глюкозой, пенициллином, стрептомицином, бычьим сывороточным альбумином (БСА), внесенными в бидистиллированную воду.

582

Изолированные оперативным вмешательством яйцеклетки из яйцеводов выдерживают в атмосфере 5% С0₂ при 37°С до микро- инъекции в них клонированных ДНК любого размера в количестве 1—2 нл 0,0001—0,0005% раствора ДНК с помощью микроманипу- лятора.

Для трансплантации оплодотворенных яйцеклеток, в которые была инъецирована экзогенная ДНК, используют "суррогатных" матерей — псевдобеременных реципиентных самок (12 часов ров1 соНит), вынашивающих такие яйцеклетки.

В целях получения псевдобеременных мышей половозрелые самки Р-1 (19—20 г) в стадии эструса (течки, овуляции) спаривают со стерильными самцами, у которых операционно блокированы семявыносящие протоки. Наилучшие результаты получают с сам- цами линии Рагкев, обладающих высокой половой активностью. Обычно используют 20—30 таких самцов, которых спаривают через день с названными выше самками (получают в среднем 5 псевдобеременных самок в день). Псевдобеременные самки при- годны для пересадки донорских оплодотворенных яйцеклеток.

Отбирают яйцеклетки, переживших микроинъекцию ДНК, и вводят их в специальную микропипетку, с помощью которой привносят в яйцевод псевдобеременной мыши оплодотворенную яйцеклетку с включенной в нее клонированной ДНК. Часть пере- саженных яиц погибает, а часть продолжает нормально развивать- ся. После этого естественным путем (или с помощью кесарева сечения) получают трансгенное потомство, идентифицируемое с помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геном- ной ДНК, изолированной из хвоста (отрезают кончик хвоста длиной примерно 1 см).

При гомологии трансгена с каким-либо участком генома мыши используют блот-гибризацию, если же гомология незначительна или она отсутствует совсем, то ограничиваются дот-блот- или слот-блот-анализом (от анг. Ыох — пятно, ЫоШпд — промокание, йог — точка, б1о! — прорез, паз). В первом случае, когда трансген идентичен эндогенному гену, он все равно окружен другими нуклеотидными последовательностями. Поэтому, используя ре- стриктазы, удается доказать локализацию трансгена в иных ре- стрикционных фрагментах. Во втором случае, когда трансген негомологичен геному мыши, то он ограничен другими сайтами рестрикции, и здесь удобен дот-блот- или слот-блот-анализ в качестве экпсресс-метода. Фрагменты анализируемой геномной ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах выявляют при экспозиции с рентгеновской пленкой.

Трансгенные линии животных получают после скрещивания первичных трансгенных экземпляров.

Изложенные события по получению трансгенных мышей схе- матично представлены на рис. 72.

Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом получения трансгенных животных (в частности, мышей) является заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные гены; ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис- сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственная копия ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым обра- зом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способ- ны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экс- прессии клонированных генов заметно повышается вследствие того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипци- онные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей (МГУ) или от вирусов птиц (АГ/У).

Геном ретровирусов функционирует по схеме:

РНК обратная транскриптаза _{? днк > рнк > Белок}

Каждая вирусная частица содержит две копии одноцепочечного РНК-генома, а после проникновения в пермиссивную клетку этот геном переводится в линейную двухнитевую ДНК под влиянием вирусного фермента — обратной транскриптазы. Чтобы интегри- роваться в клеточный геном клетки-мишени, линейная ДНК про- никает в ядро, где приобретает кольцевидную форму. Интегриро- ванная линейная ДНК-копия ретровирусного генома (провирус) имеет на обоих концах длинные нуклеотидные повторы — 1ТК (от англ. 1опд гепгйпе гереахх). 5ТТР. несет промотор, с которого начинается транскрипция генов интегрированного провируса; 3' ЬТЯ-сайт полиаденилирования, где происходит терминация РНК- транскриптов (см. рис. 23).

Существует ряд векторов на основе ретровирусного генома. В простейших случаях удаляют структурные гены и на их место встраивают один или больше рестрикционных сайтов в целях

584

клонирования. Из семейства векторов МЬУ известны: рМХ1112, рМХ1122, рМХ262 и др.

Ретровирусный вектор может включить лишь около 10000 пн. Имея в руках готовый вирусный вектор, им можно инфицировать подходящие клетки-мишени, например, фибробласты, экспресси- рующие соответствующие поверхностные рецепторы.

Чтобы заразить рекомбинантным ретровирусом эмбриональ- ные клетки, в культуральную емкость с инфицированными фиб- робластами, продуцирующими рекомбинантный вирус, помещают восьмиклеточную морулу (группа бластомер, возникшая после равномерного дробления оплодотворенного яйца), освобожденную от яйцевой оболочки. Морула инфицируется и после достижения стадии бластоцисты ее вводят в матку псевдобеременной матери. Часть бластоцист может погибнуть, а часть нормально развивается и в соответствующие сроки трансформируется в трансгенное потомство, которое затем подвергается тщательному генетическо- му анализу и может использоваться для выведения трансгенных линий.

Бластоцисты стали родоначальницами плюрипотентных эмбри- ональных стволовых клеток типов Е5 и ЕК. Показано, что, напри- мер, Е5-клетки доступны культивированию т лагго и после каких- либо манипуляций (например, после введения клонированных генов путем инфекции или трансфекции) можно инъецировать их в бластоцисту и вернуть в живой макроорганизм. Е5-клетки коло- низируют эмбрион и составляют с ним единое целое, хотя коло- низация ими зародышевого пути по разным причинам удается не всегда. Последующие этапы работы с трансгенными животными во многом сходны с. ранее описанными. Таким образом, все три метода получения трансгенных животных можно представить в виде следующей схемы по Д. Мерфи и Дж. Хенсону 1987 г. (см. рис. 166).

С конца XIX века и до середины текущего столетия были разработаны методы пересадки эмбрионов от различных живо- тных с последующим рождением полноценного потомства (клеточ- ная инженерия). Следовательно, получение популяции, состоящей из генетически идентичных особей (клонирование), возможно не только с помощью рассмотренных выше трех способов (микро- инъекций ДНК, вирусная инфекция и пересадка Е5- и ЕК-клеток), но и с помощью пересадки эмбрионов, которая может быть

585

осуществлена на раз- личных представителях царства Аштапа, напри- мер, на кроликах, козах, коровах, мышах, овцах, свиньях и др. Так, для получения элитного ста- да коров в сравнительно короткий временной ин- тервал (с учетом естест- венного процесса от за- чатия до отела) отобран- ной родоначальнице вводят фолликулостиму- лирующий гормон

<*•»■»» (ФСГ). В ответ на ФСГ

Рис. 166. Схема получения трансгенных живо- ^ее организм выбрасы- тных методом микроинъекции днк в оплодотворен- вает 10 15 яйцеклеток ную одноклеточную яйцеклетку: 1 - яйцеклетка, 2 - вместо одной в норме, микроинъекция днк, 3 - трансфекция днк, 4 - р_{се э}ти яйцеклетки оп- пересадка ядра, 5 - пересадка клетки в бластоцисту. _ _

лодотворяются. Через

4—5 дней, когда сформировавшиеся 32-клеточные эмбрионы (око- ло 0,2 мм в диаметре) еще не прикрепились к стенкам матки и свободно плавают в ней, их вымывают, определяют полноценность и вводят микрошприцем непородистым коровам, находящимся в воспроизводительном цикле благодаря предварительному введе- нию им простагландинов. Коровы-реципиенты эмбрионов вына- шивают и рожают элитных телят в нормальные сроки.

Таким путем удается получить от одной элитной коровы в среднем 5 элитных телят за 15 месяцев. В этот срок с интервалом в 2—3 месяца у нее дважды забирают яйцеклетки и один раз она разрешается собственным теленком. На этом пути открываются заманчивые перспективы, связанные с возможностями оплодотво- рения яйцеклеток т унго, а также длительным хранением эмбри- онов в замороженном состоянии. Тогда в целях экономии можно продавать такие эмбрионы в соответствующие агрохозяйства.

С учетом религиозных воззрений, гражданских законода- тельств и этики в ряде стран решаются проблемы искусственного осеменения женских яйцеклеток зародышевыми клетками от муж-

586

чин. Лишь только во Франции на начало 1992 г. родилось свыше 10000 детей от женщин-доноров.

11.7.Иммуномодуляторы. Иммуномодуляция (от лат. Ш1тиш1ав — избавление, освобождение, тойшагю — мерность, размерен- ность) — термин интегративный, объединяющий представления о каком-либо целенаправленном вмешательстве в работу иммунной системы, функционирующей в условиях нормы и патологии. Со- ставными частями иммуномодуляции являются: иммуностимуля- ция и иммунодепрессия (иммуносупрессия), т. е. иммунокоррек- ция. При иммуностимуляции. происходит активизация иммунной системы, при иммунодепрессии (иммуносупрессии) — ее частич- ное угнетение; следовательно иммунокоррекция сопровождается выравниванием деятельности иммунной системы. Индивидуаль- ные вещества или средства, применяемые в качестве иммуномо- дуляторов, соответственно подразделяют на иммуностимуляторы и иммуносупрессоры (иммунодепрессанты).

Все иммуномодуляторы условно можно еще подразделить на специфические и неспецифические. Первые из них выступают преимущественно специфическими антигенами, индуцирующими антителообразование, вторые, влияя на иммунную систему, выра- женно или совсем не являются антигенноактивными. Неспецифи- ческие иммуномодуляторы бывают двух типов: .

а) действующих при нормально функционирующей иммунной системе (вакцина ВСС, СогупеЪасгегшт рагушп),

б) максимально действующих на супрессированную иммунную систему (левамизол, препараты тимуса, интерфероны); они мало активны или совсем неактивны, когда их вводят пациентам с нормальной иммуной системой.

Все иммуномодуляторы используют в качестве средств лечения соответствующих заболеваний, связанных с дефектами иммуной системы, или иммунодефицитами.

11.7.1. Иммуностимуляторы. Иммуностимуляторы повышают устойчивость организма к инфекционным заболеваниям, активи- зируют иммунитет у онкологических больных, получающих цито- статики, радиоактивное облучение. Их подразделяют на природные и синтетические. К природным относят иммуноглобулин-у (1д-у), являющийся также средством заместительной терапии; препараты из зобной железы крупного рогатого скота (тактивин, тималин, тимопоэтин и др.), интерфероны (см.), фактор переноса, или лейкоцитарный трансфер-фактор (ЛТФ), специфические опухоле- вые вакцины, иммунную РНК (И-РНК), натрия нуклеинат, проди-

587

гиозан, сальмозан, грибные гликаны, апатогенный штамм Мусооас1егшгп 1иЬегси1о518 (вакцина ВСС) и другие вакцинные штаммы различных микроорганизмов, анатоксины.

Синтетическими иммуностимуляторами неспецифического действия являются батилол, йзопринозин, левамизрл, "хлоридйн и некоторые другие. Поскольку эти вещества представляют собой продукты органического синтеза, то они не рассматриваются в настоящей книге.

•' Иммунный гамма-глобулин (1дС) продукт матричного син- теза, являющийся гликопротеином и способный проникать через плаценту. Его получают в очищенном и концентрированном видах из донорской, плацентарной и абортной крови человека в виде 10% или 16%* раствора. Препарат изготавливают из смеси большого числа сывороток крови взрослых людей, ранее болевших, напри- мер, гриппом, корью и другими инфекционными заболеваниями, или получавших вакцины в качестве профилактических средств. Поэтому так называемый нормальный глобулин может содержать 1д-ы против возбудителей дифтерии, кори, оспы и других заболе- ваний. .

Специфические гипер-1д-ы изготавливают из крови специально - иммунизированных людей, например, против бешенства, клеще- вого энцефалита, стафилококковых инфекций, столбняка и др.

Основной метод выделения иммуноглобулинов является их фракционированное осаждение этанолом (по Е. Дж. Кону, 1945— 1946) на холоду при строгом контроле рН и ионной силы раствора. На процесс разделения белков сыворотки Крови влияют следую- щие основные факторы: концентрация белка, диэлектрическая постоянная раствора, концентрация этанола, изоэлектрическая точка, рН, ионная силараствора, температура.

Необходимо иметь'в виду, тот факт, что в сыворотке крови содержатся различные белки (альбумины — 57—65%, сс-глобулины — 13%, Р-глобулины — 12,5%, у-глобулины.— 11.-19%). В. случае сильного разбавления растворов белков^увёличйвается диссоциа- ция молекул (закон Действующих масс) преимущественно благо- даря внутреннему электростатическому- отталкиванию, и -тогда белки труднее осаждадется; при высокой концещраций белкдв.,в растворе больше возможностей для ценообразования с последую- щей денатурацией белковых молекул. Денатурация-также возра- стает, если создаются реальные условия для формирования моно- молекулярной белковой пленки на границе раздела фаз, например, "жидкость—воздух" (учитывать свойства ПАВ у белков).

588

Способность белковых растворов увеличивать или уменьшать диссоциацию находящихся в них солей, характеризуется диэлек- трической постоянной таких растворов (О); чем выше полярность молекул, тем больше О; для растворов неполярных соединений величины V низкие. Существует обратнопропорциональная зави- симость между- V и силами электростатического притяжения и отталкивания молекул — возрастание О сопровождается стабили- зацией молекул, снижение V — их притяжением и агрегацией. Напомним, что О для воды при 20°С равна — 80—82, дл5 этанола — 24, то есть в 3,5 раза меньше,.поэтому этиловый спирт исполь- зуют в качестве фракционирующего агента белковых молекул. К тому же он дегидратирует эти молекулы. -у,.

В изоэлектрической точке (р1) при данном рН, когда число положительных зарядов белковых молекул равно общему числу их отрицательных зарядов, белок становится наименее растворимым, й он легче выпадает в осадок. О белковых растворов изменяется в зависимости от"их рН и достигает максимума в изоэлектрической точке.

Ионная сила раствора (ц) выступает мерой интенсивности электрического поля, создаваемого в растворе каждым ионом; ц равна полусумме произведений молярности каждого иона (т) на квадрат его валентности (г²):

- р * А ^ т.12 ² . Изменяя р., достигают более эффективного

осаждения белков. - .

Температура — важный фактор для сохранения белков в нативном состоянии. При их фракционировании стремятся под- держивать температуру ниже 0^СС, при которой снижаются раство- римость белковых молекул и рост случайно попавших в раствор микроёов-контаминантов.* * ■ ■ "

Известны дваЪпособа производствсЛдО камерный.и внека- мерный (последний применяют при крупносерийном производстве препарата; он предложен Г. Я. Розенбергом в 1959 г.). Общая схема внекамерного способа фракционирования 1дС представлен ниже.

Фракционирование, например, донорской крови включает с§- парирование'форменйых элементов^ бгделениетфибр&а^получёц⁵¹ ную сыворотку очищают от остатков фибриногена; балластных белков, а затем ее передают на последующие ступени выделения 1дС. Полученный иммуноглобулин растворяют и подвергают сте- рилизующей фильтрации.

В целях улучшения качества продукта указанный выше метод неоднократно модифицировали.

Сыворотка »

I—стадия предвари— тельного осаждения

этанол, 8% рН 7,2-7,3 Г=-3*С центрифугирование

►осадок в отходы

супернатант

II—стадия первого осаждения

этанол, 26% рН 7,1-7,2 **=-8* - 10'С

► Осадок (альбумин, а-глобулин, часть р-глобулина)

центрифугирование супернатанта

в последующую утилизацию

осадок общих глобулинов в центрифуге растворяют в изотоническом растворе натрия хлорида

III — стадия второго осаждения

этанол, 17% рН 4,95-5,15 ацетатный буфер ц=0,02;х*=-5*С

Осадок р-глобулин, часть о- и у-глобулинов

возможна + фильтрация

центрифугат /фильтрат/

на дополнитель- ное фракциони- рование

IV—стадия третьего осаждения

этанол, 26% натрия бикарбонат рН 7.2-7,3 ц=0,05;Г=-8-10"С центрифугирование

К иммуноглобулинам, получаемым из крови человека, относят- ся 1д-ы: антирабический, нормальный, противогриппозный, проти- востафилококковый, противостолбнячный, противоэнцефалитный (титрованный на антитела к вирусу клещевого энцефалита); из

590

крови животных получают 1д-ы, или сыворотки, содержащие 1д-ы: антирабический, противоботулиновые, противогангренозные, про- тиводифтерийный, противолептоспирозный, против клещевого эн- цефалита, противосибиреязвенный, против столбняка.

Антитоксины — обычно это препараты лечебно-профилакти- ческого действия, изготавливаемые из сывороток крови лошадей, иммунизированных соответствующими анатоксинами (см. также главу 9). Схема получения антитоксинов в общем виде может быть сведена к следующим этапам:

Выращивание токсигенных бактерий (ботулинических, дифтерийных, столб- нячных или других) на благоприятной для токсинообразования жидкой питательной среде

Мембранная фильтрация

Иммунизация лошадей по принятой схеме

Фильтрат с содержанием токсичного белка 0,2 — 2% обрабатывают водным раствором формальдегида 0.3- 5%,39-40'С.рН 7.0, в течение 21 — 35 суток

Приготовление конечного продукта		Выделение антитоксического 1д

Обезвреживание токсина возможно с помощью других деток- сикаторов (3-пропиолактон, протеазы или окислители и пр.).

В некоторых случаях отделение форменных элементов крови осуществляют одноактно с дефибринированием крови. При этом фибриновый сгусток включает в себя эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. Однако при работе с большими объемами крови названный одноактный процесс сопровождается частичным гемо- лизом эритроцитов, что осложняет последующую очистку антиток- сина.

На практике получают от гипериммунизированных соответст- вующими анатоксинами лошадей лечебные или лечебно-профи- лактические антитоксические сыворотки: противоботулиновые ти- пов А и В (в жидком виде), концентрированные жидкие противо- гангренозные очищенные (моно- и поливалентные), противодиф- терийную и противостолбнячную.

Очищенный сорбированный на алюминия гидроксиде столб- нячный анатоксин применяют для ревакцинации людей, являю- щихся затем донорами специфического 1д. Схема его выделения аналогична той, которая описана ранее для 1дС. Выпускают про- тивостолбнячный 1д в жидком виде в ампулах.

Кроме 1д-ов другие белковые фракции сыворотки крови обла- дают важными биологическими функциями и поэтому могут быть выделены в очищенном виде для последующего использования в практическом здравоохранении и медицине в целом.

Препараты из зобной железы. К ним относят тактйвин, тима- лин, тимопозтин и некоторые другие, получаемые методами экст- ракции и последующей очистки из зобной железы (С1ап<Ш5 Шутив) крупного рогатого скота, поступающего на мясокомбинаты для убоя и последующей комплексной переработки. Зобную железу относят к центральным органам иммуной системы. В ней проходят специальную обработку будущие тимоциты, приобретающие соот- ветствующие функции. (Т-хелперы, Т-супрессоры, Т-киллеры). В этой железе содержатся гормоноподобные субстанции, которые и составляют основу иммуностимулирующих веществ. Одна из схем получения иммуностимуляторов из С1. Шутив представлена на странице.

Фактор переноса, или лейкоцитарный трансфер-фактор (ЛТФ)

— это составная часть диализата экстракта лейкоцитов, ответст- венная за пассивный перенос реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) от сенсибилизированных лиц-доноров к несенсибилизированным реципиентам. Впервые открыт К. Ланд- штейнером и М. Чейзом в 1942 г. в лейкоцитах морской свинки. ЛТФ является медиатором клеточного компонента иммунной сис- темы и его можно причислить к лимфокинам; вырабатывается нормальными лимфоидными клетками. Кроме индукции кожных реакций (ГЗТ) он тормозит миграцию клеток и вызывает транс- формацию лимфоцитов. ЛТФ не является антителом, не обладает иммуногенностью и не проявляет свойств трансплантационного антигена. Он устойчив к ДНК-азе, РНК-азе и трипсину, но термо- лабилен (инактивируется при 56°С в течение 30 мин.). В составе

592

ЛТФ обнаружены полипептиды и олигонуклеотиды, ММ менее 10 кДа, хорошо растворим в воде.

Ткань зобной железы

Соотношение ткань/среда 1:5-1:10

Гомогенизация в 3 М КС1 в ФСБ с последующим выдерживанием при 4*С 12-16 ч.

Центрифугирование (20—40 тыс. д 1—2 ч.)

1

Диализ супернатанта против водопроводной воды

(примерно Зч.), затем против ФСБ (1 сутки)

Концентрирование до 1/10 объема

1

Осадок лиофильно высушивают и хранят

при »* ниже (ГС (предпочтительнее при -25'С)

Выделение иммуностимулирующих средств ("суммарный препарат") из ткани зобной железы крупного рогатого скота (ФСБ — фосфатно-солевой буфер)

Под влиянием ЛТФ отрицательная ГЗТ переходит в положи- тельную. Такой эффект одной дозы фактора переноса продолжа- ется до 6 месяцев. В настоящее время за одну дозу ЛТФ принято его количество, получаемое из 10⁸'⁹ лимфоцитов. ЛТФ можно применять в больших дозах в течение нескольких месяцев при иммунодефицитах.

Схема получения фактора переноса заключается в следующем. От здоровых доноров с выраженной реакцией ГЗТ на соответст- вующий антиген отбирают кровь в асептических условиях. Кровь собирают в стерильные емкости, куда добавляют антикоагулянт гепарин и 6% раствор декстрана 250 в 0,15 М натрия хлорида (из расчета 500 МЕ гепарина и 10 мл декстрана на каждые 100 мл крови). Емкость закрывают, несколько раз встряхивают и термо-

593

статируют при 37°С. Осаждение эритроцитов по времени не должно продолжаться более часа. Надосадочную жидкость цент- рифугируют в асептичных условиях (1500 д 10 минут), плазму осторожно сливают (декантируют). Остающийся осадок включает эритроциты, на поверхности которых располагается слой лейко- цитов (1 мл осевших лейкоцитов соответствует примерно 10⁹ клеток, что достаточно для получения 1—10 доз ЛТФ). Из числа белых клеток этого слоя 70% приходится на лимфоциты. На осадок осторожно наслаивают 0,15 М стерильный раствор натрия хлорида, приготовленный на апирогенной воде (0,5 мл на 100 мл крови), и осторожно отсасывают лейкоциты в виде суспензии в изотониче- ском растворе НаС1. Полученную суспензию замораживают смесью сухого льда с этанолом и размораживают при 37°С деся- тикратно (до полного разрушения лейкоцитов). В полученный вязкий раствор добавляют ДНК-азу и катионы магния для гидро- лиза ДНК при 37°С (эта процедура возможна в процессе замора- живания и оттаивания, поскольку ДНК-аза стабильна в таких условиях). Деполимеризованный экстракт лейкоцитов диализуют против дистиллированной воды (на 1 л экстракта берут 50 мл дистиллированной воды) в течение суток при + 4°С, после чего его подвергают фильтрующей стерилизации через мембранный фильтр и лиофильно высушивают.

Полученный диализат экстракта лейкоцитов растворяют в сте- рильном фосфатно-солевом буфере с рН 7,4 (0,01 М фосфатный буфер +8,5 г/л НаСГ-.} в соотношении 1:20 и асептично подают на хроматографическую колонку, заполненную сефадексом С-25, ра- нее законсервированную 0,2% натрия азидом и промытую тем же ФСБ, разведенным в 20 раз.

Хроматографию проводят в указанном выше стерильном бу- фере со скоростью до 90 мл/час. Собирают активные фракции (восстановление способности лимфоцитов к розеткообразованию трипсинизированных эритроцитов барана в присутствии фактора переноса) — это и есть ЛТФ.

ЛТФ не рекомендуют применять при кандидозах кожи и сли- зистых оболочек, кокцидиоидозе, лепре, туберкулезе и остеоген- ной саркоме.

Специфические опухолевые вакцины, а таже иммунная РНК (И = РНК) еще не вышли за пределы лабораторий, поэтому их крупномасштабное производство пока не освоено.

594

Продигиозан, сальмозан, вакцинный штамм микобактерий и грибные иммуностимуляторы (гликаны, нуклеинат натрия) рас- смотрены в главе 9.

11.7.2. Иммунодепрессоры (иммуносупрессоры). Среди имму- нодепрессоров известны синтетические вещества (азатиоприн, меркаптопурин, преднизон, циклофосфамид и пр.), отдельные антибиотики (блеомицин, циклоспорин А, см. главу 9), а также зообиотехнологические продукты — антилимфоцитарный имму- ноглобулин, анти-г!г1о(0)1д человека и лимфоцитарные кейлоны. Антилимфоцитарный 1С получают из сыворотки крови животных по схеме, близкой к описанной выше для выделения 1дС (см. 11.7.1). При этом иммунизирующим агентом (антигеном) являются чело- веческие лейкоциты.

При выделении суммарных иммуноглобулинов можно исполь- зовать два подхода. Один из них базируется на высаливании 1д-ов насыщенным раствором аммония сульфата (3,9 М при 0°С или 4,06 М при 20°С) с последующей хроматографией растворенного осадка антилимфоцитарного 1д в подходящем буфере (например, фосфат- ном — 0,01 М с рН 6,5). Хроматографию проводят на ионообмен- никах — ДЭАЭ-сефадексе или ДЭАЭ-целлюлозе.

Поскольку антилимфоцитарный 1д содержит разные 1д-ы со сходными характеристиками, то их можно разделить, изменяя ионную силу элюента.

В производственных условиях получают в среднем 5,5—6,0 г 1дС из 1 л иммунной сыворотки в пересчете на сухое вещество. Более высокого выхода 1д удается достигнуть согласно другому методу — с помощью 2-этокси-6,9-диаминоакридинлактата, или риванола (Дж. Хорейси, 1952). Выход 1дС при этом составляет в среднем 60—65%.

Реакция взаимодействия риванола(катион) с белками протекает при незначительном сдвиге рН от изоэлектрической точки, то есть при малом отрицательном заряде белковой молекулы, а образую- щийся риванольно-белковый комплекс слабо растворим в воде — он растворим при рН 5,0.

В слабо щелочной среде риванол не образует комплексов с 1дС, на чем и основана очистка 1дС:

1дС можно выделять прямо из иммунной сыворотки, добавляя к ней 0.75% раствор риванола в соотношении примерно 1:2.

Анти-Ю1₀(В)-иммуноглобулин человека приобрел важное зна- чение в профилактике гемолитической болезни у новорожденных.

595

осадок в отходы.

1дС — "сырец" (см. стадию первого осаждения на с. 590) разводят в 10 раз изотоническим раствором ЫаС1, дово- дят рН до 6,6—6,9

+ 0.2% раствор

риванола Г=-10-15'С

I

Центрифугирование

к супернатанту + 26% этанол, рН 6,9-7,5 1"=-10-1ГС

осадок 1дС (растворение, стерили- зующая фильтрация, лиофилБНое высушивание)

С его помощью удается предотвращать развитие так называемой резус-сенсибилизации примерно у 7%. перрородящих резус-отри- цательных /Кп{—}/ женщин, если вводить им в послеродовом периоде этот 1д.

Иммуносупрессивное действие анти-г1поО-1д проявляется после внутримышечного введения препарата в течение первых 2—3 суток после родов первородящим нёсенсибилизированным к КЪоф) изо- антигену резусотрицат'ельным женщинам, которые родили Кп( + ) ребенка, совместимого с матерью по группе крови системы АВО. Доза вводимого анти-Шго(Г>Нд составляет200—250 мкг.

■ Исходным материалом для получения анти-Ш1₀(О)-1д является сыворотка или плазма крови, содержащая неполные анти-Ецо(О)- антителав высоком«титре; сыворотка Кп(-)лиЦ, сенсибилизирован* ных к О-изоантигену во время предшествующих 'беременностей.' КЬ(-т-) плодом или в результате переливания РЛ( + ) крови. Однако "более-стабильные и высококачественные препараты получают в случае использования сыворотки или плазмы крови от специально иммунизированных доноров (например, Ел-отрицательных жен- щин недетор^эдйогр вд'зраста).' ~ '' "*"] '.' * ^

Очищенный* анти-Епо(0)-Тд вьтделяютТпринцйииаТ^но тем же методом, который описан для донорского 1д.

Все препараты 1д-ов контролируют на стерильность, безвред- ность, апирогенность, содержание в них 1дС должно быть не менее 90% общего -белка. - - .--_»..

596

11.8. Коллекционные центры клеточных культур, их роль в сохранении генофонда животных организмов. По данным, опуб- ликованным в научной литературе, за последние 400 лет с лица Земли исчезли 130 видов птиц и млекопитающих, из них 100 видов , — за последнее столетие.В Красную Книгу бывшего СССР внесено 92 вида и подвида млекопитающих, 80 — птиц, 35 — рептилий, 9

— амфибий, 9 — рыб, 209 — насекомых, 2 — ракообразных, 11 — червей, всего — 1Ц6 видов. С уменьшением численности видов уменьшается генетическое разнообразие. Генофонд вида (уникаль- ный набор его генов) во всей полноте представлен лишь в некото- рой совокупности особей, которую надо беречь и сохранять. Для сохранения естественных экосистем с их генофондом необходимо заповедать не менее 30% поверхности земли (сегодня заповедники составляют всего около 2%).

Сохранение генофондов различных видов животных возможно в зоопарках, питомниках, на фермах, где они содержатся и раз- множаются в неволе. Другой путь — это консервация геномов половых или соматических клеток тех видов, численность которых упала ниже критической, необходимой для их выживания (ниже 500 особей для позвоночных и 50000 — для беспозвоночных). Следует иметь в виду, что с безвозвратной утратой не только вида животных (как и-друщх организмов), но даже отдельной особи может быть навсегда'пот'еряна какая-то часть генов, вносящая разнообразие в генетические характеристики представителей это- го вида. Таким образом, благодаря консервации геномов можно решать следующие задачи по сохранению:

1. разнообразия видов животных,

2. генетического стандарта видов, для которых'отмечен выра- женный дрейфцёнов, ... „ ,

3. _г лабораторных животных с наследственными аномалиями, экстраполируя результаты, например, на других животных, и людей с-соответствующими наследственными заболеваниям (от лат. ехгга

— сверх, вне, дополнительный; ро1ап5 иичяолярный),

4. сниженного числа "животных, содержащихся в неволе, не опасаясь инбридинга (от англ.. щЬтеейщд'-^- врожденный, природ- 'ный^'и прибегнув^при этом к искусственному осеменению ранее«|,* законсервированной спермой или к обеспечению развития ранее' замороженных зародышей,

5. особо ценных пород сельскохозяйственных животных, а 'также аборигенных пород* (от лат. аЬ опдте — от начала, т, е.

коренные), важных для селекционной работы.

597

Обычно для консервации используют зародышевые клетки (сперматозоиды и яйцеклетки), а также сами зародыши; в редких случаях прибегают к консервации соматических клеток (например, в целях сохранения последнего представителя исчезающего на земле вида).

Известны 3 типа консервации: физиологическая, криоконсер- вация и создание банка генов. К физиологической консервации относят анабиоз в естественных условиях, диапаузу — временную остановку развития зародышей в половых путях самок у представителей копытных, сумчатых, хищных и других млекопитающих животных (до нескольких месяцев), и, наконец, сохранение спермиев в половых путях самок, например у муравьев — до 15 лет, у летучих мышей — 5—7 месяцев.

Криоконсервация основана на глубоком замораживании био- объектов (клеток, тканей и органов). Организмы, выдерживающие сильное обезвоживание, оказались наиболее устойчивыми при консервации (некоторые протозоа в стадии цист, нематоды и др.). О сущности этого метода, в том числе — об использовании криопротекторов см. главу 10.

В настоящее время разработаны методы криоконсервации сперматозоидов, гонад, лимфоцитов и других соматических клеток, зародышей. Полагают, что сохранение клеток при — 196°С обес- печит их жизнеспособность в течение многих десятков лет. Этот срок можно было бы растянуть до вечности, если бы не спонтанные мутации от воздействия естественной радиоактивности.

Лиофилизация — как вариант криоконсервации не имеет су- щественного значения в сохранении животных клеток. Он более значим для микроорганизмов.

В настоящее время, благодаря достижениям в области генети- ческой инженерии, в различных странах созданы и создаются банки генов, приобретающие непреходящее значение для поддер- жания, изучения строения и функциональной активности генома животных организмов. В России большое внимание этой проблеме уделяется в учреждениях РАН и, в том числе, в институтах цитологии (г. Санкт-Петербург), молекулярной биологии (г. Мос- ква), цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (г. Ново- сибирск), МГУ им. М. В. Ломоносова и др.

ЛИТЕРАТУРА

Акименко В. К. Альтернативные оксид азы микроорганизмов. М., Наука, 1989.

Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. Под ред. Д. Г. Звягинцева. МГУ, 1983.

Бациллы. Генетика и биотехнология. Под ред. К. Харвуда. М., Мир, 1992.

Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М., Мир, 1989.

Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология, М-, ВО Агропромиздат, 1990.

Биологические мембраны. Методы. Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза, М., Мир., 1990.

Биотехнология в 8-ми томах. Под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Уч. пособие для вузов. М., Высшая школа, 1987—1988.

Биотехнология клеток животных. В 2-х томах. Под ред. Р. Е. Спиера и Дж. Гриффитса. М., ВО Агропромиздат, 1989.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988.

Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X. Смита. М., ВО Агропромиздат, 1987.

Варфоломеев С. Д., Калюжный С. В. Биотехнология. Кинети- ческие основы микробиологических процессов. М., Высшая школа, ■1990.

Виестур У. Э., Шмите И. А., Жилевич А. В. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига, Зинат- не, 1987.

Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. М., МГУ, 1989. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М.

Теория и практика иммуноферментного анализа. М., Высшая школа, 1991.

Блинов Н. П. Химическая микробиология. М., Высшая школа, 1989.

Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.

Иммунологические методы. Под. ред. Г. Фримеля. М., Медици- на, 1987.

Иммунология. Под ред. У. Пола в 3-х томах. М., Мир, 1989. Каратыгин И. В. Коэволюция грибов и растений. Санкт-Петер- бургский Гидрометеоиздат. С.-Пбг. 1993.

Коваль Э. 3., Сидоренко Л. П. Микодеструкторы промышлен- ных материалов. Киев, Наукова Думка, 1989.

Кузник Э. 3., Васильев Н. В., Цыбиков Н. Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М., Ме- дицина, 1989.

Ленинджер А. Основы биохимии в 3-х томах. М., Мир, 1985. Лиепиньш Г. К., Дунцэ М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. Рига, Зинатне, 1986. Лыоин Б. Гены. М., Мир, 1988.

Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Сб. научн. трудов под ред. С. Г. Инге-Вечтомова. Л., Наука, 1986.

Муромцев Г. С, Бутенко Р. Г., Тихоненко Т. И., Прокофьев М.

И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., ВО Агропро- миздат, 1990.

Перспективы биохимических исследований. Под ред. Дж. Туза и С. Прентиса, М., Мир, 1987.

Петров Р. В. Иммунология. М., Медицина, 1987.

Промышленная микробиология. Под общей ред. Н. С. Егорова. М., Высшая школа, 1989.

Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии. Минск, Вы- шэйшая школа, 1986.

Сассон А. Биотехнология. Свершения и надежды. М., Мир., 1987.

Седых Н. В., Кристапсонс М. Ш. Контроль качества в биотех- нологии. Рига, Зинатне, 1990.

Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосибирск, Наука, 1986.

БЛИНОВ Николай Петрович Основы биотехнологии

Зав. редакцией Г. Н. Левина. Технический редактор В. С. Просекова. Корректор С С Кухарева. лицензия ЛР № 020297 от 27. 11.91.

Сдано в набор 10.02.94 г. Подписано к печати 10.09.95 г. формат 60x84 1/16, бумага офсетная. Гарнитура Бал- тика. Печать офсетная. Усл. печ. лист 34,88 уч. изд. лист 35,53. Тираж 10000. Заказ 8254 Издательская фирма "Наука" 119034, Санкт-Петербург. Менделеевская линия, 1. Белгород, облтипография, ул. Б. Хмельницкого. 111а.

Перечень исправлений, внесенных в книгу-учебник "Основы биотехнологии"

Стр.

Строка

Напечатано

Следует читать

/между проп. буквами 70 а-нуклеотид

фотолиаза+Ьп лактобактерии Р-галактозидата (ДС) здгсь декстрансахароза 7 и 8 снизу читать выше схемы 14 снизу (У е/з)

подпись к формуле Яокагспа

2 абз. 1 и 2 сверку читать ниже схемы

27 37

58 58 65

73 80 80 86 107

115

115

141

159

168

190-

191

204

215

234

234

268

369

389

392

434

506

511

549

550 551 553 554 554 557 563 564 569 569 578 589 592

подпись к рис. 1 подпись к рис. 5

рис. 10, С 4 снизу формула витамина В12

9 снизу на рис. 19 3 снизу 13 сверху подпись к рис. 31

3 кол. табл. 20 подпись к рис. 7 сверху схема схема

3 абз. 2 снизу схема

подпись к рис. 36 7 сверху табл. 15, 8 снизу табл. 17, 4 снизу подпись к рис. 59

2. абз. 5 сверху

3. абз. и подпись к формуле

I и 2 абз.

подпись к формуле подпись к рис. 158

4. абз. 1 сверху

5. снизу табл. 56

6. сверху

II снизу в табл. 58 на рис. 162 подпись к рис. 162 на рис. 163

7 снизу

4 абз. 1 снизу мендсикуты боковые-2, промежуточные-3 СД

аикислст

5,6-диметилбензимида-

золрибокуклеотид

и

АБ

вибриона

траксономических

визикул

БИЗИКуЛЫ

ксилота ЕвеЬехгсЫа Цикл деления Е

галла с большими

форобол

форобол

КАР

ФРБ

ТИРа

фороболов

рН2

меойза

трансплантантов

Га

У

18

1§0 представлен странице мендосикуты боковые-3, промежутпчные-2 СП

аминокислот

5,6-диметилбензимида-

золрибонуклеатад

или

В

вириона

таксономических

7—гладкий

эндшлазматический

ретикулум

везикул

везикулы

кислота

ЕвепепсЫа

Цикл подразделяют

/

а-нуклеоид

фотолиаза+гп)

лактобактерии

Р-галактозидаза

(ДС здесь

декстрансахараза

(V р/8)

ЫосагсЦа

галла присуща клеткам с большими

форбол

форбол

РАГ

ФРФ

ТОТа

форбмюв

рН2

мейоза

трансплантатов V

1#ас

Ь^С представлена странице 593

1Явление, обратное плазмолизу.

2ламинин получают из базальной мембраны мышиной саркомы Епд1еЬге№- Но1т-5\*агт;

3трансферрин — плазменный белок теплокровных животных и человека, содержащий железо. Фетуин — белок из сыворотки плода теленка, содержащий около 0,2% свободной 1Ч-ацетилнейраминовой кислоты.

539

4ламинин получают из базальной мембраны мышиной саркомы Епд1еЬге№- Но1т-5\*агт;