Часть IV. Специальные биотехнологии

• Во второй части учебника изложены основные представления о биотехнологии, базирующейся на использовании биообъектов микробного, растительного и животного происхождения. В срав- нительном плане можно подчеркнуть следующие особенности таких биотехнологий: во-первых, имеется много аналогий при реализации биотехнологических процессов, в которых биообъекты используются на молекулярном и клеточном уровнях; во-вторых, только некоторые виды биотехнологий, осуществляемые с приме- нением клеток, могут быть подведены под рубрику "технологий на организменном уровне" (микробная биотехнология); в-третьих, лишь при использовании в биотехнологии микроскопических ор- ганизмов необходимо специальное аппаратурное оформление про- цессов, тогда как в случаях выращивания макроорганизмов (рас- тений и животных) в естественных, или природных условиях этого делать не требуется, и, следовательно, посевы и сборы урожаев, выращивание сельскохозяйственных животных в целях получения

373

молока, мяса, кож, шерсти и пр. не относится к новым и новейшим биотехнологическим процессам в таком понимании предмета, по- скольку здесь выпадает ведущее звено, связанное с управляемым культивированием биообъекта, например, в ферментаторах или в других аппаратах. Однако третья особенность не является универ- сальной. В частности, к истинной биотехнологии тесно примыкает технология выращивания некоторых растений на основе метода гидропоники. Тем не менее, особенности каждой группы биотех- нологических процессов сохраняются и поэтому есть все основа- ния рассматривать их в качестве самостоятельных. К ним относят микробную биотехнологию, фитобиотехнологию и зообиотехно- логию, то есть главным критерием подразделения биотехнологий являются биообъекты. Микроорганизмы в этом смысле занимают первенствующее положение (сравнить число реализованных на практике микробиологических и других производств по объему выпускаемой продукции).

Существующие ветви биотехнологических субдисциплин (им- мунобиотехнология, инженерная энзимология), применительно к конкретным производствам, рассмотрены в соответствующих гла- вах второй части учебника. Например, генно-инженерные проти- вовирусные вакцины включены в главу "Микробная биотехноло- гия", тогда как вирусные вакцины, получаемые на культивируемых клетках и тканях животных организмов, приведены в главе "Зоо- биотехнология". Биохимические процессы на основе инженерной энзимологии рассмотрены на примерах ферментов преимущест- венно микробного происхождения, поэтому и этот раздел включен в главу 9.

Глава 9.

МИКРОБИОТЕХНОЛОГИЯ

Микробиотехнология, или микробная биотехнология базиру- ется на интегрированном использовании микробиологии, биохи- мии и инженерных наук. с целью реализации потенциальных способностей микроорганизмов в технике и промышленном про- изводстве. По сути своей микробиотехнология тождественна про- мышленной (технической) микробиологии. Ее объектами являются микробы-вирусы (включая вироиды и фаги), бактерии, грибы, лишайники, протозоа (см. главу 2). В ряде случаев биообъектами являются первичные метаболиты микробного происхождения — ферменты, каталитическая активность которых лежит в основе инженерной энзимологии.

В сравнении с растительными и животными клетками микробы размножаются, как правило, быстрее и, следовательно, у них быстрее протекают все метаболические (обменные) процессы. Относительные преимущества большинства микробов как биообъ- ектов следующие:

1) большая "простота" организации генома,

2. достаточно легкая приспособляемость (лабильность) к среде обитания в естественных и искусственных условиях,

3. выраженные скорости протекания ферментативных реакций и нарастания клеточной массы в единицу времени.

Первое преимущество обеспечивает микробным клеткам луч- шие возможности для изменения и перестроек наследственного материала, например, включение в него чужеродной генетической информации, привнесение в клетки или, напротив, элиминация из них плазмид, и пр.

Второе преимущество, связанное с лабильностью микробов, можно показать на примере бактерий и грибов. Так, применитель- но к температуре микробы подразделяют на психрофилы, мезо- филы и термофилы (от греч. рекЬпа — холод тевоа — средний, 1егте — теплота, Шео — люблю) со следующими оптимумами показателей для них: ниже 20°С, 20—45°С и выше 45°С соответст- венно. Однако указанные интервалы, как правило, перекрываются. Например, психрофильный вид ХапШотопаз рпапгшсо1а может расти при температуре от 0°С до + 40°С, мезофильный 1.ас1оЪасШи8 1асив — от + 20°С до + 50°С, термофильный Вас. соадшапз — от + 20°С до + 65*С. Поэтому выделили дополнительные подгруппы: облигатные психрофилы, факультативные психрофилы, стено- термофилы и эвритермофилы. Первые из них не растут при температуре выше +20^оС, для вторых верхний температурный предел превышает + 20°С, третьи не растут при температуре ниже + 37"С, четвертые растут при температуре ниже+37°С.

Кроме стенотермофилов и эвритермофилов целесообразно вы- делить еще одну подгруппу термофильных микроорганизмов под названием супертермофилов, для которых температурный опти- мум составляет 105°С, то есть выше точки кипения воды (100°С). К числу таких микробов относят бактерии родов Ругоспсиит и Ругососсив. Так для Ругососсив Гигювив, изолированного из подвод- ного гидротермального излияния около средиземноморского ост- рова Вулкано, кардинальные точки температуры (ттшшт, оритит, тахппит) составляют 60°С, 105°С, 110°С. Среди супер- термофилов отдельные представители являются или могут быть

375

источником термостабильной ДНК-полимеразы, активной к тому же при высоких давлениях (рис. 124).

Рис.* 124. Скорость роста или другой физиологиче- ской функции микроорга- низмов (Ушах) в процентах от максимального значения для данных условий: 1 — психрофилы, 2 — мезофи-- лы, 3 — термофилы, 4 — супертермофилы.

Среди грибов имеются психрофилы и мезофилы, реже — . эвритермофилы (от греч. еипв —. широкий), но до .сих пор не описаны грибы — стено- и супертермофилы. Например, аспоро- генные" дрожжи СапгИйа включают виды, способные расти при температуре- в диапазоне от —10°С до +37"С; диморфный гриб * АйгеоЪазгйшт риПшапв растет при температуре от 16°С до 30°С. Грибы-сапрофиты — продуценты БАВ выращивают в производст- венных условиях обычно при 24—26°С

• Клетки микроорганизмов проявляют также лабильность к из- менению в среде концентрации водородных ионов. Давно известна следующая закономерность — бактерии более выраженно прояв- ляют свою физиологическую активность в средах при значениях рН выше 7,0, тогда как грибы — при рН ниже 7,0. Однако это не значит, что" отдельные микробы не будут расти и размножаться при существенных отклонениях рН. Так, молочнокислые бактерии в процессе размножения закисляют среду до рН 3,0 и ниже; некоторые представители дрожжей рода СапсИйа на питательных средах с рН 8,0—10,0 способны накапливать биомассу клеток достаточно эффективно после заметной пролонгации 1ад- и 1од- фаз. В это время происходит не только адаптация к среде обитания, но и постепенное закисление.

Диморфный дрожжеподобный гриб АигеоЪаяспит ри11и1ап8 хорошо развивается при рН 6,0—6,5, но продуцирует экзогликан — аубазидан более выраженно при рН 3,0—3,5.

Образование ряда вторичных метаболитов нитчатыми грибами имеет место на грани между стационарной и летальной фазами, когда происходит защелачивание сред. Так, РетсШшт поШит лучше растет при рН 4,5, тогда как продукция пенициллина более выражена при рН 7,5.

Третье преимущество микробов, связанное с большими скоро- стями ферментативных реакций, можно показать на примерах размножения отдельных видов различных микроорганизмов. Так, удвоение числа клеток Ё.соН й Вас. виЬгШв на благоприятных питательных средах наблюдается, в среднем, через 20 минут; почкование СапсШа аМсапв на жидком сусле —' через 30 минут; после проникновения Т-четной фаговой частицы в клетку Е. со1г через 20 минут появляется от 20 до 200 новых фаговых частиц, и т. п. Конечно, в мире микробов имеются представители, скорость размножения которых определяется сутками, например, микобак- терий туберкулеза. С учетом условий среды культивирования и активности ферментов (чаще — иммобилизованных), скорость реакции является, в основном, результатом скорости реакции в непосредственном микроокружении активных центров ферментов и диффузии субстратов и веществ в направлении к этим центрам и от них — в противоположную сторону.

Микробы относятся к живым саморегулирующимся системам, восстанавливающим равновесие после какого-либо воздействия, если оно не было чрезмерно сильным и продолжительным. Если же воздействие действительно было сильным и продолжительным, то организм погибает или переходит в новое устойчивое (равно- весное) состояние. Это может произойти, например, после воздей- ствия мутагенных факторов и образования мутантов (см. выше первое преимущество микробных клеток). В этой связи необходи- мо отметить, что микроорганизмы легче приспосабливаются, или адаптируются к изменившимся условиям существования, чем рас- тения и животные, хотя и среди микробов адаптивные возможно- сти у видов-сапрофитов более выраженные, чем у видов-паразитов; это связано с более широким набором ферментов у первых, нежели у вторых. Поскольку ферменты — это первичные метаболиты, то, в конечном итоге, их арсенал определяется генотипом.

Микробиотехнология на клеточном уровне "практически реа- лизована значительно раньше, чем фито- и зообиотехнологии. Для примера можно назвать приготовление ряда пищевых продуктов (кисломолочных, хлеба, сыров), производство вин, пива, спиртов, органических кислот, аминокислот, антибиотиков, ферментов, от- дельных витаминов, белковых и других кормов для сельскохозяй- ственных животных, а также веществ, производство которых основано на методах генетической инженерии, и пр.

В данной главе не приведены материалы о биотехнологии вирусных препаратов и о процессах, в которых применяют прото-

377

зойные организмы. Вирусы — как облигатные, или безусловные паразиты выращивают в живых тканях животных организмов, а протозоа пока не нашли широкого практического воплощения в производстве. Поэтому определенные сведения о тех и других даны в главе 11.

Микроскопические водоросли — как биообъекты рассмотрены в главе 10. Настоящая глава посвящена биотехнологическим про- цессам, основанным на использовании биообъектов — представи- телей двух царств — бактерий и грибов.

9.1. Принципы культивирования микроорганизмов. С момента внесения микробов (засева) в питательную среду имеет место индукция их физиологической активности, особенно — в логариф- мическую и/или стационарную фазы размножения. При этом одновременно сопряженно протекают многие реакции, катализи- руемые иммобилизованными или свободными ферментами. В ре- акции, особенно — на первых этапах, нередко вовлекаются высо- комолекулярные вещества с определенной конфигурацией моле- кул (сравнить такие источники углерода как глюкоза и крахмал или источники азота—аммония сульфат, какая-либо аминокислота и нативный белок). Поэтому следует учитывать специфику выра- щивания микроорганизмов.

Главные особенности культивирования микробов в целях пол- учения большинства первичных и вторичных метаболитов следу- ющие:

1. необходимость применения специальных биореакторов вме- стимостью 63, 200, 1000 и более м³, в которых возможно поддер- жание асептических условий в течение сравнительно длительного времени;

2. видовые различия биообъектов, с которыми связаны специ- фические характеристики питательных сред, кардинальные точки (минимальные, оптимальные и максимальные) температуры и рН;

3. невозможность одновременного поддержания постоянства критериев химического, теплового, диффузионного и гидродина- мического подобия, с чем связаны трудности масштабирования биотехнологических процессов;

4. различия в массообменных процессах у аэробов и анаэробов — культивирование аэробов осуществляют в трехфазных системах ["твердое тело (клетки)-жидкость-газ"], анаэробы выращивают в виде двухфазных систем ["твердое тело (клетки)-жидкость"];

5. необходимость перемешивания культуральных жидкостей в целях улучшения массообмена (кислорода воздуха для аэробов —

378

прежде всего), а это, в свою очередь, индуцирует ценообразование и, как следствие, диктует необходимость прибегать к пеногашенйю;

6. микроорганизмы чувствительны к воздействию механиче- ских, физических и химических факторов;

7. при микробном синтезе целевых продуктов имеют место индукция, активация, ингибирование, репрессия и некоторые дру- гие регуляторные процессы, усложняющие в целом регуляцию размножения продуцента и биосинтез им конечного продукта;

8. скорость биосинтеза целевых продуктов более медленная по сравнению со скоростями химического синтеза;

9. отдельные виды микроорганизмов, используемых в биотех- нологических процессах, являются болезнетворными и работа с ними должна проводиться с особой тщательностью (дифтерийные и столбнячные палочки, микобактерий туберкулеза, холерный вибрион и др.);

10) некоторые представители микробного мира должны куль- тивироваться только на (в) живых тканях/клетках (куриные эмб- рионы, клетки человека и животных и т. д.); к таким представителям можно отнести вирусы, риккетсии.

Любой биотехнологический процесс.реализуют условно в два этапа. Первый из них — предферментация, когда необходимо выполнить все подготовительные работы для реализации второго этапа — ферментации, то есть накопить и выделить целевой продукт.

Предферментация

Предферментационный этап включает подготовку питательных сред, биообъекта, воздуха для аэробов и биореактора. Компоненты питательных сред подбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией того или иного источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расхо- дуемой (выделяемой) энергии. Обычно качественный и количест- венный составы питательных сред указаны в регламентной доку- ментации.

Питательные среды, используемые на подготовительном этапе, могут несколько отличаться от среды, применяемой на втором этапе. Так, например, при пересеве лиофильно высушенной ма- точной культуры обычно рекомендуют обогащенные питательны- ми ингредиентами жидкие среды. Последующие пересевы осуще- ствляют вначале на агаризованную ферментационную среду, а затем — на жидкую.

На всех этапах подготовки биообъекта питательные среды перед их засевом должны быть стерильными (см. главу 7). Биообъ-

379

ект, или промышленный штамм в идеале должен удовлетворять следующим основным требованиям:

1. стабильность структурно-морфологических признаков и фи- зиологической активности при длительных хранении и эксплуата- ции в производстве;

2. повышенные скорости роста и биосинтеза целевого (-ых) продукта(-ов) в лабораторных и производственных условиях;

3. достаточно широкий диапазон устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры, рН, аэрация, перемешивание, вязкость среды);

4. умеренная требовательность к ограниченному числу источ- ников питания; чем более широкий набор 'источников углерода, азота и других элементов может использовать производственный штамм, тем легче его культивировать и с большей экономической выгодой.

В действительности каждый штамм имеет свои особенности и не по всем показателям отвечает вышеперечисленным требовани- ям. Как правило, чем богаче усвояемыми ингредиентами питатель- ная среда, тем лучше растет и метаболизирует на(в) ней микроор- ганизм. Уже многие годы используют кукурузный экстракт в качестве добавки к питательным средам, поскольку он богат не только источниками углерода и азота, но также микроэлементами и витаминами. Сухие вещества в нем составляют 45—55%, в их состав входят зольные вещества —. 1,5—4,5% (таблица 40).

Не менее часто применяют дрожжевой экстракт из клеток ЗассЬаготусев сегелпв1ае, богатый различными веществами —ами- нокислотами (аргинином — 5%, валяном — 5,5%, гистидином — 4%, изолейцином — 5,5%, лейцином — 7,9%, лизином — 8,2%, метионином — 2,5%, тирозином — 5%, треонином — 4,8%, трипто- фаном — 1,2%, фенилаланином — 4,5%, цистином — 1,5%) и витаминами (биотином — 0,06%, инозитом — 0,3%, кальция пантотенатом — 0,01%, кислотой р-аминобензойной — 0,016%, кислотой никотиновой — 0,059%, кислотой фолиевой — 0,001%, пиридоксина монохлоридом — 0,002%, рибофлавином — 0,01%, тиамина монохлоридом - 0,017%, холинхлоридом — 0,27%) в расчете на сухое вещество. К тому же в биомассе клеток дрожжей содер- жится до 50% белков.

Вместо экстракта можно добавлять автолизат или гидролизат дрожжей.

Объемное и дозирующее оборудование для измерения, транс- портировки и загрузки биореакторов аналогично оборудованию, применяемому, например, в пищевой (или в химической) промыш- ленности: различных типов весы, насосы (например, вакуумные), транспортеры (ленточные, шнековые), элеваторы, контейнеры и др. Газообразные и жидкие продукты обычно подают в биореак- торы по системам стерильных трубопроводов. В крупномасштаб- ном производстве питательные среды и некоторые их компоненты стерилизуют нагреванием и/или фильтрованием через пористые

381

мембраны. Тепловая стерилизация может быть периодической и непрерывной; в биотехнологии применяют оба вида стерилизации.

В случае получения лекарственных средств, например, антиби- отиков для парентерального введения, необходима исключительно высокая степень стерильности питательных сред и целевых про- дуктов. При этом необходимо стремиться снизить, например, вероятность выживания бактериальных спор до величины менее 10¹², исходя из уравнения:

1—Р₀(1) = 1 — е^-*¹, где Р — популяция микроорганизмов, е — логарифм натуральный, 1-время, Н=ЛГ₀ е^-*"', Н, — численность жизнеспособных микроорганизмов в среде до начала стерилиза- ции, ка — величина, обратная средней продолжительности жизни микроорганизма, 1 — Р₀(1) - вероятность выживания хотя бы одной микробной особи при вероятности гибели

Р₀(т.) = 1—(1— | е~^к< 1)14,

Понятно, что перед засевом биообъекта стерильными должны быть и питательная среда и биореакторы. Стерилизацию биореак- торов часто проводят одновременно со стерилизацией питательной среды в них.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В заводской или цеховой лаборатории должна быть подготовлена культура для последующей наработки инокулюма (инокулята), или посевного материала. В этих целях исходный штамм микроорганизма, сохраняемый в условиях, близ- ких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной суш- ки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду. Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить род- ственные связи), операции по пересеву штамма на среду возраста- ющих объемов (площади) повторяют несколько раз и проводят в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам, помеща- емым на качалочные устройства (шюттель-аппараты).

Последующую подготовку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы, в которых на- ращивают посевной материал для промышленных ферментации. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины — окончания Ьод-фазы, то есть когда клетки делятся синхронно.

Известно понятие степень синхронизации, то есть степень участия

382

клеток популяции в синхронном делении (О. Шербаум, 1959—1960), выражающаяся в индексе синхронизации (1з):

где

N0 — число клеток перед началом их синхронного деления, N1 — число клеток после синхронного деления, Т — время, приходя- щееся на Ьод — фазу, д — продолжительность одной генерации. Индекс синхронизации характеризует степень однородности по- пуляции.

При необходимости синхронизацию деления можно индуциро- вать, например, метаболическим шоком (предварительный посев культуры на голодные среды), температурным шоком (смена тем- ператур, в частности, пониженных в начале на оптимальные в последующем), или используя одинаковые по размеру клетки, механически разделенные, например, фильтрованием (селектив- ные методы) и т. п.

В зависимости от плотности суспензии ее необходимое коли- чество может достигать 1—20% объема производственного фер- ментатора. Для аэробных микроорганизмов в инокулятор достав- ляют очищенный стерильный воздух.

В целом, предферментация схематично представлена на рис. 125. В инокуляторах, как и в промышленных ферментаторах, целесообразно поддерживать незначительное избыточное давле- ние воздуха, когда случайные утечки будут происходить только в направлении из системы, а не наоборот. Этим дополнительно обеспечивается асептичность биотехнологического процесса.

Вусловяжх цехом*

Вуелоаих иротаад-

Инокуляторы должны отвечать следующим основным требова- ниям: конструктивные простота, удобство и надежность эксплуа- тации. Посевные аппараты отечественного производства имеют следующие объемы: 10, 5, 2 и 0,63 м⁵, диаметром от 0,9 до 2 м и с частотой вращения мешалки от 180 до 270 оборотов в минуту.

Ферментация

Второй этап биотехнологического процесса, называемый фер- ментацией, проводят в производственных биореакторах. По био- химической сущности он во многом имитирует предферментацию и поэтому названный термин является условным. Тем не менее, он принят на практике и в специальной литературе и не нуждается в каких-либо дополнительных пояснениях.

В процессе ферментации также необходимо использование стерильных питательных сред, воздуха и биореакторов, выбор которых обусловлен особенностями культивируемых микроорга- низмов. На рис. 126 представлены подходы к такому выбору (см. также главу 7).

Биореакторы для аэробных

микроорганизмов

Подвод энергии с жидкой и газовой фазой (ФЖГ)

С перемешивающими устройствами

► | С вибро:

мешалками

ФГ с принудительной циркуляцией

Комбинированные

микроорганизмы

Одноклеточные (бактерии, дрожжи), нитчатые грибы

Микроорганизм в виде суспензии определенной плотности подают из инокулятора(-ов) в промышленный биореактор, или ферментатор, в котором содержится стерильная жидкая питатель- ная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом — все соединения системы должны быть герметично закрытыми. Схема запорно-регулирующих устройств представлена на рис. 127.

Рис. 127: Запорно-регулирующее устройство в системе трубопроводов для засева промыш- ленного ферментатора (2) из инокулятора (1); 3—10 — клапаны, 11 — ловушки конденсата; АБ — отрезок трубопровода.

Исходя из этой схемы, последовательность операций заключа- ется в следующем: открывают клапаны 4 и 7 (клапан 3 закрыт) и стерилизуют участок трубпровода АБ паром под давлением 1,055 кг/см² 20 минут; конденсат собирается в ловушках (11); закрывают клапаны 7, 8, 9, 10 и открывают клапаны 4, 5, 6; ферментатор охлаждают под давлением очищенного стерильного воздуха, сте- рильная среда заполняет соединительный трубопровод; повышают давление в посевном аппарате до 0,7 кг/см² при его снижении в ферментаторе до 0,14 кг/см²; открывают клапан 3 и посевной материал переводят в ферментатор, после чего отключают иноку- лятор и ферментатор от системы подачи пара, закрыв клапаны 3 и 6; открывают клапаны 7 и 8, спускают пар и конденсат при частично открытых клапанах 4 и 5.

Общий объем ферментатора заполняют инокулированной сре- дой на 70—80%, 20—30% объема заполняют газами (инертным — для анаэробов, воздухом — для аэробов).

Аэрация жидкости способствует ценообразованию, снижаю- щему качество ферментации, поэтому используют пеногашение либо механическое (установка в верхней части ферментатора специальной дополнительной мешалки), либо физико-химическое (использование ПАВ для снижения поверхностного натяжения на границе раздела фаз "газ-жидкость"). 13 т. 8524 385

Длительность ферментации колеблется в пределах от 4—5 до 14 суток и дольше, что зависит от особенностей физиологической активности биообъектов. Применительно к биосинтезу антибио- тиков и экзогликанов периодические ферментации проводят обыч- но в течение 4—5 суток.

9.2. Выделение конечных продуктов ферментации. В зависи- мости от целей проведения ферментации конечным продуктом может быть биомасса клеток или какой-либо внеклеточный мета- болит. Тогда в первом случае отходом будет жидкая часть культу- ральной среды, во втором — клетки (см. также главу 8). Кулыпу- ральная среда представляет собой смесь клеток биообъекта, его растворимых продуктов метаболизма, нерастворимых компонен- тов, выделившихся после автолиза части клеток или вследствие нарушения клеточных барьеров проницаемости, а также полно- стью неиспользованных компонентов питательной среды. Исход- ные характеристики культуральной среды (концентрация клеток и продуктов метоболизма, вязкость, морфология клеток и клеточ- ных элементов и др.) накладывают отпечаток на выбор способа отделения биомассы клеток от жидкой фазы.

В зависимости от целевого продукта используют наиболее приемлемый подход для его выделения:

Клетки Растворимый метаболит

1. Седиментация 1. Экстракция и декантация 2. Сорбция

2. Фильтрование 3. Осаждение

3. Центрифугирование 4. Хроматография

4. Отстаивание 5. Выделение с помощью

5. Флотация мембран Приближенная градация нерастворимых веществ и частиц

(включая микробные клетки) по размерам, сказывающаяся на выборе методов их отделения и разделения, может быть представ- лена следующим образом:

1. Крупные частицы — от 0,1 до 1 мм

2. Мелкие частицы — от 0,01 до 0,1 мм

3. Инфрамелкие частицы — от 0,001 до 0,01 мм

4. Высокомолекулярные вещества — от 10 до 1000 нм (10 "⁵—10 ³ мм)

5. Низкомолекулярные вещества — от 0,1 до 10 нм (10 "⁷—10 ⁵ мм).

Для отделения крупных и мелких частиц возможно использо- вание: седиментации, тканевых и волокнистых фильтров, сит и

386

сетчатых фильтров, фракционирование в пене и пузырьках; для отделения низкомолекулярных нерастворимых веществ—диализа и электродиализа, ионного обмена, экстракции растворителями, обратного осмоса.

Некоторые методы применимы к отделению частиц с более широким диапазоном размеров, например, ультрафильтрация (для частиц 2—5 групп), ионный обмен (для частиц 3—5 групп), гель- хроматография (для частиц 2—4 групп), фракционирование в пене и пузырьках (для частиц 1—4 групп), чем другие методы: ультра- центрифугирование (длячастиц, в основном, 5 группы), экстракция растворителями (для частиц 4—5 групп), жидкостные и циклонные сепараторы (для частиц 2—3 групп).

Седиментация происходит в поле гравитационных сил. Ею пользуются для отделения конгломератов типа "кефирных зерен" при некоторых видах молочнокислого или смешанного брожений (молочнокислого и спиртового), а также при биологической обра- ботке отходов с помощью активного ила.

Микробные клетки легко коагулируют под влиянием полика- тионов или привносимых извне полимеров. Возникающие при этом хлопья вместе с клетками достаточно легко отделяются седимен- тацией. Известны легко флокулирующие производственные штам- мы дрожжей, формирующие осадки.

Декантацию, или слив надосадочной жидкости (декантат, су- пернатант) можно заменить вакуум-отсасыванием.

Фильтрование малых объемов культуральной жидкости можно проводить на рамных фильтрах, при больших объемах -— на барабанных вакуум-фильрах. Процесс фильтрации можно суще- ственно ускорить (в 10—100 раз), если культуральную жидкость подвергнуть предварительной обработке — тепловой, добавление флокулянтов (глинозема, кальция хлорида, полиэлектролитов, и т. д.). Если биомасса клеток оказывает выраженное сопротивление фильтрованию, то прибегают к использованию фильтрующего слоя на подкладке. Осадок микробных клеток относится к разряду сжимаемых, то есть уплотняющихся, поэтому со временем скоро- сть фильтрации будет заметно уменьшаться. Чтобы исключить перепады в скоростях фильтрации, слой клеточной массы (напри- мер, мицелия) срезают с помощью ножа.

Центрифугирование — принудительное осаждение частиц (ве- ществ) за счет скорости возрастания центробежных сил. В микро- биотехнологии применяют различные типы центрифуг: осадитель- ные шнековые, непрерывного действия с выгрузкой осадка через

367

сопла, саморазгружающиеся сепараторы и др. С помощью цент- рифугирования удается отделять из культуральных жидкостей бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Однако например, в случаях высоковязких культуральных жидкостей прибегают к их предварительному разбавлению водой (иногда — теплой или горя- чей) во много раз, после чего приступают к центрифугированию — сепарированию. Это характерно для отделения продуцентов высоковязких экзополисахаридов, например, некоторых грибных гликанов типа аубазидана, пуллулана и др.

Отстаивание реализуют в традиционных процессах брожения, а также в крупномасштабных процессах переработки отходов. Это как бы продолжение процесса седиментации.

Флотацию (от англ. ЯоаШюп — всплывание) используют, например, для концентрирования микобактерий туберкулеза из патологического материала в диагностических целях. В микроби- отехнологии флотацию применяют в производстве белка некото- рых одноклеточных микроорганизмов, в пивоварении. Пенная флотация ответственна за образование устойчивой пены на пиве за счет концентрирования растворенных белков на границе раз- дела "воздух-жидкость".

Если целевой продукт представляет собой растворимый мета- болит или он синтезируется внутри клетки и не секретируется вовне, то прибегают к другим методам выделения: экстракции, сорбции, осаждению, хроматографии, выделению с помощью мем- бран. Экстракцию проводят органическими растворителями из клеток (твердая фаза), например, антибиотика гризеофульвина ацетоном, или бензилпенициллина при рН 2,0—3,0 — бутил-аце- татом из культуральной жидкости после отделения клеток проду- цента (система "жидкость-жидкость"), или, наконец, экстракция ферментов (в частности, пуллуланазы) в двуфазных водных систе- мах, например, глюкана-декстрана и несовместимого с ним поли- этиленгликоля (ПЭГ-6000).

Сорбция — это. поглощение каким-либо телом газов, паров или растворенных веществ из окружающей среды. Различают адсо- рбцию, когда в сорбции принимает участие поверхность твердого тела; абсорбцию — поглощение вещества всем объемом жидкости поглотителя; хемосорбцию — поглощение газа, при котором имеет место химическое взаимодействие между поглотителем и газом; десорбция — процесс обратный сорбции, то есть это выделение вещества, поглощенного твердым телом или жидкостью. Из адсорбентов наиболее известны активированный

388

древесный уголь, кизельгур, силикагель, целлюлоза. Все адсорбен- ты должны обладать большой удельной поверхностью. Так, 1 г активированного угля имеет поверхность от 600 до 1700 м², благо- даря чему он обладает высокой поглотительной способностью.

Как осветлители адсорбенты широко применяют в микробио- технологии.

Хорошо известна ионообменная сорбция, используемая, в ча- стности, при выделении аминогликозидного антибиотика стрепто- мицина на катионообменной смоле, содержащей карбоксильные группы:

стрептомицин ^п+ +п (смола)"Н⁺<=> п (смола)^- стрептомицин ^п+ + Н⁺. Стрептомицин элюируют (десорбируют) подкисленной во- дой, смола при этом регенерируется.

В ряде случаев ионообменники можно добавлять непосредст- венно в культуральную жидкость для избирательной сорбции несущего заряд действующего вещества.

Осаждение широко используют в микробиотехнологии при получении белков (например, ферментов), полисахаридов, ряда антибиотиков и других веществ. Белки выделяют при высаливании, изменении рН до изоэлектрической точки, снижении диэлектри- ческой проницаемости раствора, снижений степени сальватации белковых молекул, и другими процедурами.

Наиболее часто используют метод высаливания белков концен- трированными растворами солей. Еще в конце XIX в. было уста- новлено, что различные ионы можно расположить по уменьшению

катионы: Т1?⁺, А1³~!" Н²⁺Ва²* 5г²Т Са⁺,Мд²^Са* КЬ¹",

4

анионыГООС - СН₂- С(ОН) - СН₂- СОО 7

СОО~

^-ООС-СН(ОН)-СОО~Р_,Ю7, НзРСу СН₃С007 Вг^СПСОГ, ВГ, Н0₃,С10₄, 17 СК5 .

высаливающей активности в виде лиотропных рядов, или рядов Гофмейстера:

Несмотря на то, что аммония сульфат наиболее часто приме- няют в качестве высаливающего агента, его с успехом можно заменить другими солями.

Высоковязкие экзополисахариды (аубазидан, декстран, ксан- тан, пуллулан и др.) выделяют осаждением этанолом или ацетоном, то есть смешивающимися с водой органическими растворителями.

389

Альгинаты—полианионные биополимерные углеводы осаждаются раствором кальция хлорида в виде геля.

Некоторые осадители образуют с растворенным действующим веществом нерастворимые соли, выпадающие в осадок в присут- ствии органического растворителя:

стрептомицин +Н₂504+ органический растворитель —> —> X сульфат стрептомицина

Хроматографическое разделение БАБ используют в различных вариантах: гель-фильтрация, или гель-проникающая хроматогра- фия — хроматография на молекулярных ситах, ионообменная хроматография.

Гель-фильтрацию успешно применяют для разделения смеси веществ, различающихся по молекулярным массам. Это могут быть различные метаболиты микроорганизмов, в том числе — полидис- персные белки и полисахариды. Причем небольшие по размеру молекулы разделяемых веществ способны проникать в гель-насад- ку, и поэтому они движутся в хроматографической колонне более медленно, тогда как большие молекулы не проникают в частицы геля и движутся быстрее — они выходят из колонны в первую очередь.

При ионообменной хроматографии ионообменная смола пред- ставляет собой неподвижный слой, тогда как, например, раствор смеси белков является подвижным слоем. Так, белки в катионной форме связываются с катионобменной карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ), несущей отрицательные заряды на целлюлозной матрице. Последующую элюцию белков проводят с помощью буферных растворов возрастающей ионной силы. Первыми элюируют белки, более слабо связанные с КМЦ.

Подобный процесс проводят и на анионобменниках. Наиболее часто применяемым анионитом является диэтиламиноэтилцеллю- лоза.

В случае афинной хроматографии используют высокую специ- фичность таких природных веществ, как ферменты, антитела и лектины. Ферменты образуют комплексы с ингибиторами, анти- тела — с соответствующими антигенами (иммуносорбционная хроматография), лектины — со специальными рецепторами кле- точных стенок.

Метод выделения различных веществ или клеток с помощью мембран все шире внедряется в биотехнологию. Диаметр молекул или частиц является определяющим фактором в выборе обратного осмоса или ультрафильтрации. Для примера можно привести

390

приближенные размеры (диаметр) некоторых молекул и клеток в мкм:

вода (ММ 18 Да) — 0,0002, органические кислоты с ММ от 100 до 500 Да — 0,0004—0,0008, монозы и биозы с ММ от 180 до 400 Да — 0,0008—0,001, некоторые антибиотики с ММ от 300 до 100 Да — 0,0006—0,0012, протеины и гликаны с ММ от 10000 до 1 млн. Да—0,002—0,01, клетки ряда бактерий — 0,3— 1, клетки некоторых дрожжей и мицелиальных грибов — 1—10.

Явление уравновешивания химических потенциалов какого-ли- бо вещества в растворе и в чистом растворителе, разделенных непроницаемой для вещества мембраной, называют осмосом.

Избыточное давление, приложенное к раствору и превышаю- щее его осмотическое давление, побуждает перенос растворителя против градиента концентрации (из разбавленного раствора в чистый растворитель). При этом происходит возрастание концен- трации растворенного вещества, то есть имеет место обрат- ный осмос.

В ряду с осмотическими процессами находится диализ, когда происходит непрерывная диффузия малых молекул в циркулиру- ющий растворитель с удерживанием больших молекул. При этом отсутствует выраженный перенос растворителя против градиента концентрации. Диализ применяют, например, при очистке анти- генных препаратов, представляющих собой протеины, гликопро- теины или более сложные комплексы. С помощью диализа через раличные мембраны освобождаются от неорганических солей.

Ультрафильтрация (см.) применима для концентрирования и очистки молекуле диаметром от 1 до 100 нм (отдельных ферментов) от низкомолекулярных примесей. Растворитель при этом частично удаляется.

На практике нередко используют комбинацию методов для разделения клеток и молекул биологически активных веществ.

Процесс ферментации можно оценивать по различным пока- зателям, используя для этого соответствующие расчетные форму- лы:

1) продуктивность по биомассе (О_х, г/л*ч):

а) для периодического процесса О_х = ~—^

б) для непрерывного процесса О_х = ОХ, где Хо — концент- рация биомассы (г/л) на период времени 1о (ч), Х1 — концентрация биомассы (г/л) на период времени 11(4), ^ — коэффициент разбав- ления или скорости протока, (1/ч), равный удельной скорости (ц)

391

для непрерывного процесса; Б можно нарушить, если изменить скорость протока среды или концентрацию субстрата в ней;

2. удельная скорость роста (1/ч): _ Ху-Хо

3. концентрация биомассы: Х^Хде ¹¹ л^-** для 1од-фазы размножения е=2,718;

2. продуктивность по целевому продукту (О_р, г/л«ч):

Р — Р

а) для периодического процесса: О_р = —

б) для непрерывного процесса: О_р=ОР, где Р — концентра- ция продукта (г/л • ч);

5) удельная скорость образования целевого продукта ^_р) в г/г« ч:

а ^Р'~^Р° ^Чр

6) удельная скорость потребления субстрата (д₈, г/г«ч):

5 — 5

Я*⁼ ~тГГ*—Гч > ^гА^е ^ — концентрация субстрата в г/л;

7) выход биомассы из субстрата, или экономический коэффи- циент (У_х/8) в г/г:

V — -У: — ^°

^х/8~ дГ 5₀-5, ^;

8) выход целевого продукта (У,^) в г/г:

V Чр Рг~ Ро

*^р/*~ дГ 5о-5Г