Глава 3

Фундаментальные исследования в области энзимологии

Любая клетка - целостная система, составные части которой структурно и функционально взаимозависимы. Эта зависимость выражается прежде всего в генетически обусловленном синтезе белковых молекул - преимущественно ферментов. В хронологиче- ском порядке только белки - продукты матричного синтеза должны

45

относиться к разряду первичных; все другие молекулы, возника- ющие под каталитическим .действием ферментов, оказываются вторичными. Выдающийся шведский химик И. Я. Берцелиус, предложивший в 1836 г. термин "катализ" (за 35 лет до выявления М. Манасеиной каталитических функций дрожжевого сока в 1871 г.), пророчески писал: "У нас есть все основания предполагать, что в тканях и жидкостях растений и животных происходят тысячи каталитических процессов". И это в то время, когда ферменты еще не были известны науке. Теперь, например, утверждается, что в мельчайшей клетке (0,1 мкм в диаметре), относящейся к МоШсш.е5, содержится более, чем 100 ферментов, то есть столько, чтобы клетка могла самостоятельно функционировать как организм. Ес- тественно, что в клетке других прокариот и эукариот насчитывают более 1000 биокатализаторов. Большинство микробов лишено спе- циализированных структур, хотя бы отдаленно напоминающих органы дыхания, пищеварения и другие, присущих высшим эука- риотам. Поэтому основная метаболическая нагрузка (метаболизм - это биологический обмен веществ и энергии) в процессах их роста, развития и размножения падает на ферменты. В любой живой клетке находятся малые и большие (полимерные) молекулы различных веществ. Они должны синтезироваться в клетке, а некоторые секретироваться из нее (нередко, распадаясь перед этим на более мелкие составные части или их производные). Во всех таких процессах участвуют ферменты. Уже сегодня известно около 2000 индивидуальных ферментов и это не предел. В клетках прокариот и эукариот ферменты распределены и локализованы целесообразно, например, в цитоплазме находятся почти все фер- менты гликолиза, в матриксе митохондрий - ферменты цикла трикарбоновых кислот и 3-окисления жирных кислот, ферменты окислительного фосфорилирования - во внутренней мембране митохондрий.

В клетке Е.соП нить ДНК имеет размеры 1,4«10⁶хЗ,0 нм, а массу 1»10~¹⁴ г. В разомкнутом состоянии длина ее составит примерно 1,4 мм, то есть подобная ДНК приблизительно в 500 раз длиннее бактериальной клетки, вмещающей эту ДНК. Такая хромосома кишечной палочки заключает в себя- информацию, достаточную для кодирования 4500 белков, значительная часть которых будет представлена ферментами.

Ферменты составляют основную массу клеточных белков. На долю одного фермента приходится от сотых долей процента (у некоторых вирусов) до 10 -12% (уряда микроорганизмов клеточной организации, например у Е.соП). В то же время хромосомная ДНК не есть простая последовательность множества генов. Поэтому

46

нельзя считать, что количество хромосомной ДНК, например у представителей эукариотических организмов пропорционально уровню их эволюционного развития. В таком случае некоторые лягушки и рыбы были бы развиты более, чем животные и человек, поскольку уних размер генома достигает 10¹⁰ - 10^й пар нуклеотидов (пн), а у млекопитающих и человека он на 1 - 2 порядка ниже (10⁹

- 10¹⁰ пн). Суть здесь в том, что у высокоразвитых существ значительная часть ДНК оказываетсяя молчащей, так как она образована не генными последовательностями (у человека к этому типу относится 80 - 90% всей ДНК) или повторяющимися огромное число раз идентичными последовательностями. Все это не может не сказываться на ферментном наборе в клетках, органах и тканях, равно как и на их функциональной активности.

Ферменты давно являются объектами биотехнологии - их ин- дустрия зародилась в начале XX в., и объемы ферментного произ- водства продолжают нарастать, а что касается публикаций о био- катализаторах, то в мире появляется более 10 ООО статей ежегодно. Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассорти- менте - организованным частицам (вирусами). Наука, изучающая ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология

- это ветвь или субдисциплина биологической технологии, изуча- ющая биотехнологические процессы, в которых используется ка- талитическое действие ферментов. Главная задача инженерной энзимологии заключается в практической реализации фермента- тивных процессов в целях экономичного получения различных веществ и энергии для нужд народного хозяйства.

Чтобы выйти на уровень инженерной энзимологии, необходи- мо решать многие основополагающие проблемы и задачи, к кото- рым можно отнести:

1) способы выделения и очистки ферментов в зависимости от их топологии в биообъекте или при выделении в среду обитания;

2) определение состава и строения фермента;

3. особенности кинетики ферментативного действия в зависи- мости от внешних условий;

4. оценку активности ферментов в зависимости от их чистоты или, напротив, от наличия естественных примесей или искусствен- ных добавок;

5. механизмы и пути регуляции синтеза и активности фермен- тов;

6. моделирование действия ферментов в иммобилизованном состоянии, учитывая при этом иммобилизацию индивидуальных ферментов и полиферментных систем, каковыми являются живые клетки;

3. аппаратурное оформление ферментативных процессов;

4. экономичность ферментативных процессов, рекомендуемых к внедрению в производство.

Некоторые из этих проблем и задач будут рассмотрены в данном разделе, другие (6-8) - во второй части учебника.

Распределение ферментов в клеточных структурах неравноз- начное, и независимо от того, что биосинтез их осуществляется в элементах ядерного аппарата, часть ферментов секретируется внеклеточно - преимущественно гидролазы. Это обусловлено не- обходимостью расщепления полимерных веществ до такого уров- ня, чтобы продукты гидролиза могли поступить в клетку для конструктивного и/или энергетического обменов.

К ферментам внеклеточного типа можно отнести микробные амилазы, липазы и пептид-гидролазы, катализирующие реакции гидролиза соответственно крахмала^ жиров и белков. Животная протеаза (пепсин) условно также может быть причислена в разряд внеклеточных, так как она поступает из соответствующих клеток (главных клеток слизистой оболочки желудка) в полость желудка; то же можно сказать и о ферментах поджелудочной железы, поступающих в просвет двенадцатиперстной кишки.

Следует иметь в виду, что многие ферменты синтезируемые в клетках, являются зимогенами, или неактивными ферментами, и для трансформации их в активные формы необхо- дим ограниченный (специфический) посттрансляционный проте- олиз.

В любом случае получение экзо- и эндоферментов на опреде- ленных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения и очистки будут определяться лишь их физико-химическими ха- рактеристиками. Так, при выделении экзофермента клетки проду- цента становятся отходом, а культуральна я жидкость или, в другом случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом. Если речь идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют подходящим растворителем. Полученный раствор также представ- ляет собой полупродукт — сырец. И если речь здесь идет об одном и том же ферменте,- но разного происхождения и топологии (экзо- и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделения будут во многом тождественными. В этом случае можно использо- вать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию,- гель- хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру-

48

гие. При необходимости выделют ферменты, локализованные в каких-либо структурах клетки. Тогда, с учетом физико-химических характеристик таких структур (размер, плотность, форма), приме- няют дифференциальное центрифугирование после дезинтегра- ции клеток (тканей). При этом сферические частицы различной плотности и/или размера будут перемещаться в центрифужной пробирке на одно и то же расстояние за разное время. Время прохождения частицы из одного положения (п) в другое (г₂) можно определить, исходя из следующего уравнения:

. 9 Т) Т2

2 со²К²(рр-гя) п ' где I — время, г| — вязкость центрифугируемой жидкости, со

— угловая скорость, К— радиус частицы, рр — плотность частицы,

р/ — плотность центрифугируемой жидкости, ^ — коэффициент силы тяжести.

Форма выделяемых частиц не всегда сферическая, и тогда в используемые методы вносят необходимые поправки, или выбира- ют какие-либо другие способы изоляции и расчета. Ферменты — глобулярные белки, поэтому при их разделении играют роль, в основном, молекулярные массы (ММ) молекул, а не число субъ- единиц (С) в них. В качестве примера можно назвать химотрипсин (ММ = 24500 Да, С = 3), щелочную фосфатазу (ММ = 80000 Да, С = 2), лактатдегидрогеназу (ММ = 140000 Да, С = 4)', триптофаназу (ММ = 220000 Да,С = 8), и др. Более того, известны ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию в организме одного вида, но представляющие собой различные молекулярные формы. Их называют изоферментами, выделение которых по высказанным причинам заметно осложняется.

Большие по размеру компоненты (интактные клетки, неразру^ шённые частицы ткани, ядра) осаждаются при дифференциальном центрифугировании быстрее — их собирают в осадок при срав- нительно невысоких скоростях; супернатант (от. лат. вирегпаъапв

— всплывающий), или надосадок подвергают последующему цен- трифугированию при более высоких скоростях. При этом в осадке могут быть митохондрии. В случае дальнейшего центрифугирова- ния при еще более высоких скоростях вращения ротора центри- фуги можно собрать рибосомы.

Во время вращения ротора с большой угловой скоростью со развивается центробежное ускорение (С), во много раз превосхо- дящее силу тяжести и способное достигать величин 600—600000 д

49

(д=ускорение силы тяжести). С = огт (г — расстояние, пройден- ное частицей). Так, для выделения ядер из дезинтеграта эукарио- тических клеток требуется 10 минут центрифугирования при 600 д, для изоляции лизосом и митохондрий — 5 мин. при 15000 д, для выделения рибосом — 1 час при 100000 д. Скорость продвижения частицы в направлении г (Уг) описывается уравнением

Уг = (I — время)

Центрифугирование дезинтеграта клеток или тканей при боль- ших скоростях в водной суспензии представляет собой турбулен- тный поток и сила сопротивления движению различных частиц ("твердых тел") определяется не вязкостью жидкости (т)), а ее плотностью (р), тогда сила сопротивления называется гидравличе- ской и описывается формулой Р = С/5рг^, где Р — гидравлическая сила сопротивления, Сг — коэффициент, зависимый от формы твердого тела, 5 — площадь поперечного сечения тела. Для сфери- ческого тела значения Сг находятся в интервале 0,05 — 0,2 в зависимости от характера поверхности (гладкая, шероховатая); для тонкого диска, перпендикулярного потоку, С{ равна примерно 0,55.

Относительная роль динамического сопротивления и вязкого трения сказывается на поведении движущейся жидкости и харак- теризуется безразмерным числом Рейнольдса:

Ке = ^=^, т]1у т)

где 1 — характерный линейный размер. При обтекании тел 1 — это длина или поперечный размер, при течении в длинных трубках 1 — это диаметр трубки. В условиях центрифугирования скорости частиц и, следовательно, их числа Рейнольдса очень малы. Поэтому для определения силы сопротивления среды, действующей на частицу, пользуются законом Стокса. Согласно этому закону сила сопротивления, испытываемая твердым шаром при его медленном поступательном движении в неограниченно вязкой жидкости, описывается выражением Р = 6лт)Ду, где Я — радиус шара, т| —коэффициент вязкости жидкости, V — скорость движения шара.

Параметры движения частицы можно вычислить по следующе- му уравнению, исключив из него коэффициент силы тяжести, поскольку направление г перпендикулярно направлению силы тяжести:

6тщКУ_г = ^у- С(рр-р/),

где У_г скорость частицы в направлении г, С — центробежное ускорение, рр — плотность частицы, р/ -— плотность жидкости, Т1 — вязкость жидкости, К — радиус частицы.

50

При подходе к выбору биообъекта—продуцента того или иного энзима важно иметь хорошую (по скорости роста, продуктивности и активности фермента) культуру — штамм (не клон), так как поддерживать его в лабораторных и производственных условиях легче, чем клон. К тому же клоновые культуры используют, как правило, для генетических целей.

Необходимо иметь в виду и такие факты, как полифермент- ность культуральных жидкостей или тканевых экстрактов, из которых предстоит выделить те или иные ферменты в индивиду- альном виде. Это особенно относится к гликансинтетазам и глика- назам, что является своеобразным отражением разветвленности углеводных полимеров (участие в синтезе более, чем одной синте- тазы) и их полидисперсности (опосредованность действия генети- ческого кода на процесс синтеза полисахарида во время роста и развития культуры клеток или ткани, то есть здесь имеет место нематричный синтез углеводного полимера). В таких случаях це- лесообразно применить афинную хроматографию (от англ. аШпну — сродство).

Афинная хроматография основана на специфичности биомо- лекул. Принципиально этим методом возможно получение абсо- лютно чистых веществ. В нативном состоянии ферменты за счет своего активного центра и регуляторного участка (одного или более) взаимодействуют с небольшим числом лигандов, которые представляют собой субстраты, либо эффекторы. Благодаря высо- кому сродству активного участка фермента к лиганду, их обрати- мому связыванию и отсутствию какой-либо другой реакции между лигандом и матрицей возможно эффективное проведение афинной хроматографии.

В качестве лиганда обычно используют конкурентный обрати- мый ингибитор (см.), его ковалентно сшивают с соответствующей нерастворимой матрицей так, чтобы он не терял своей способности связываться с ферментом. Матрицей с лигандом в соответствую- щем буферном растворе заполняют колонку, а затем через нее пропускают раствор фермента, подлежащий очистке. В колонке задерживается лишь специфический фермент, а все другие при- меси уходят. После этого проводят элюцию специфического фер- мента, используя раствор субстрата в среде с другим рН и (или) ионной силой. При разделении ферментов методом афинной хро- матографии необходимо знать все кинетические параметры целе- вого фермента, располагать хорошей матрицей и удачно подобран- ным лигандом. В качестве примера приводим схему путей сшива- ния лиганда с одной из возможных гидроксильных групп полиса-

51

харида агарозы (или сефарозы) через удлиняющие мостики, на- пример диаминов типа Н21М(СН2)хЬ1Н2 (х=2 — 6) и е-аминокапро- новой кислоты:

н₃с—сн—сн_г—сн₂—сн₂—С ООН ын₂

Е -аминокапроновая кислота

агарозная матрица

"Т— он

и— он

Т

он

он

е^/к(сн₂)_хж₂

^* бромциан

о I

с=ын

I

(сн₂)_х

I

ын,

о

I

с=ын

I

(^сн2>х

I

к

производные изомочевимы

I

о

I

с=(мн

I

ж

I

сок

К -ЛИГАНД

I

со

I

со

I

ин

I

Хорошей матрицей для афинной хроматографии является три- сакрил марки СР 2000 (Франция), получаемый сополимеризацией Ы-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола и гидро- ксилированного акрилового бифункционального мономера. Три-

52

сакрил — высоко гидрофильный сополимер за счет вторичных амидных и первичных гидроксиметильных групп. Последние на- ходятся на поверхности молекулы, тогда как полиэтиленовый кор (от англ. соге — сердцевина) полностью скрыт внутри.

сн«он сн₂он

I ² I

ны—с—сн,он ни—с—сн₂он

II II

со сн,он ^со сн₂он

I ² I

_{СИ—СИ 0—СН—СНо СН—СНо—сн—сн„}

| ^СН2^ОН | ^С

НМ— С—СгЦОН НЫ—С—СНоОН

I ² I

сн₂он сн₂он

² _I ^{2 2} _I ²

со со

сн₂он

трисакрип СР2000

Ь—с-о-(( )у-ш_{2 0} о

1-с-н |-с-о-с-н ^? - II

"\ И-Э-2ЭХ

|-ин-со-я

'2

|—О—НН -С—СНгОН » \—С~*мцол^-Ш

сн^он

трисжриг &р2000 •^МИИОПР°^ИТ^

трисакрила ор2000

Рис. 8. Получение некоторых сорбентов для афинной хроматографии на основе трисакрила СР 2000 (КДА — карбонилдиимидазол, НФХФ — нитрофенилхлоро- формиат, БЭ — бисэпоксироны, ГА — глутаральдегид, Ы-Э-2ЭХ — Ы-этоксикарбо- нил -2-эт0кси-1, 2-дигидрохинолин, АЯК — ангидрид янтарной кислоты).

Трисакрил стабилен при разных температурах — до 121°С и

при рН1— 11, равно как устойчив к диссоциирующим агентам и

поверхностно-активным веществам. В целях использования его для

53

афинной хроматографии проводят активацию такими веществами, как глутаральдегид, эпихлоргидрин, дивинилсульфон, р-нитрофе- нил-хлороформиат, карбонилдиимидазол, этилендиамин и др. (рис. 8).

Активированный трис акрил используют затем для сшивания с лигандом. В качестве примера можно привести иммобилизацию лиганда на трисакриле, активированном глутаральдегидом (рис. 9).

. о СНО СНО

^-С^Н-СН-СН-ГСН^-СН^ЧСН^-СНО +■ Н,1у-| лиганд | -

СНО

. О СНО СНО

^> II I I

>-с-га-сн-сн-(сн₂)₂-сн-сн-(сн₂)₂-сно

СНО

лиганд

Рис. 9. Схема иммобилизации лиганда с трисакрилом, активированным глутараль- дегидом.

В любом случае выделение и очистка ферментов — это наука, граничащая с искусством. В самом деле, если химическая реакция протекает с выходом 0,1% и с сотней побочных продуктов, то вряд ли химик-органик проявит интерес к процессу получения (и, тем более, очистки) целевого продукта. Но именно такие задачи встают перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный бе- лок. В работе с биологическим материалом необходимы и важны знания предварительных характеристик по содержанию белка в различных биообъектах (даже в органах и тканях одного и того же вида животного). От этого зависит выбор материала, его предва- рительная подготовка для включения в технологический процесс.

Молекулы ферментов чувствительны к различным воздействи- ям, поэтому при их выделении и очистке требуется соблюдать необходимые меры предосторожности: контролировать темпера- туру (нередко поддерживать ее близкой к точке замерзания ис- пользуемого растворителя), рН (как правило — с помощью буфер-

54

ных растворов), концентрацию белка, ионную силу раствора, концентрацию ионов тяжелых металлов (удаляют их с помощью комплексообразователей, например ЭДТА), значение окислитель- но-восстановительного потенциала (Е₀), который должен поддер- живаться на низком уровне (например, с помощью меркаптоэта- нола). Следует иметь в виду и тот факт, что многие белки в разбавленных растворах проявляют склонность к денатурации — устойчивость возрастает в присутствии их субстратов.

Из вспомогательных приемов очистки ферментов часто поль- зуются диализом, лиофилизацией, пропусканием растворов через соответствующие молекулярные сита (гелевые, мембранные). В качестве примера очистки гипотетического фермента приведена таблица 5. Из данных в таблице обращают на себя внимание сокращение объемов раствора, содержащего целевой продукт (в 200 раз), уменьшение содержания белка в 5 раз при заметном возрастании активности фермента в 100 раз (в расчете на 1 мг белка).

Суммарный выход достаточно высокий, а степень очистки превосходная - в 250 раз. Но такие показатели далеко не типичны для разных ферментов.

В качестве критериев чистоты ферментов используют данные электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), оп- ределения молекулярной массы различными методами, по раство- римости (кривые растворения), оценки полидисперсности с опре- делением специфической активности каждой фракции, хроматог- рафирования на различных носителях и в нескольких системах, аминокислотного состава (особенно — при обнаружении белковых примесей), включая секвенирование (от англ. ведиепсе — после- довательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах, и т. д.

В последние годы продолжает расти интерес к внеклеточным ферментам микроорганизмов, поскольку микробы — продуценты относительно легко культивируются в контролируемых условиях и подвергаются направленному изменению в сторону получения высокопродуктивных вариантов.

У грамположитёльных бактерий экзоферменты топологически могут быть строго внеклеточными (многие протеазы, гликозидазы и др.) и локализованными с наружной стороны клеточной мемб- раны, например, сс-глюкозидаза у Вас. ИсЬетгоггшз (это можно доказать при протопластировании клеток, когда ферменты пере- ходят в окружающую среду после удаления клеточной стенки).

Грибы в отношении секреции экзоферментовуподобляют грам- положительным бактериям. У грамотрицательных бактерий экзо- ферменты дополнительно могут находиться в периплазматическом пространстве. Казалось бы, что такие ферменты должны рассмат- риваться внутриклеточными, однако они достаточно легко осво- бождаются при осмотическом шоке или в результате протоп- ластирования клеток.

Строго внеклеточных ферментов у грамположитёльных бакте- рий больше, чем у грамотрицательных, однако среди последних имеются выраженные продуценты их (аэромонасы, псевдомонасы, некоторые энтеробактерии и др.).

Каким же образом секретируемые белки транспортируются через структуры клеточной оболочки?

В конце 70-х годов XX в. была предложена так называемая сигнальная гипотеза (Г. Блобелидр., 1979). Согласно этой гипотезе

56

секретируемый белок через ЫН2-конец удлиняется на 15—30 аминокислот, вкупе составляющих лидерный, или сигна- льный пептид, направляющий рибосому, из которой он появляется, к мембране. В мембране лидерный пептид вместе с другими мембранными белками формирует канал, стабилизирую- щийся при присоединении рибосомы. Рибосома синтезирует бе- лок, и он тут же экспортируется через пору. Этот механизм называется котрансляционной секрецией. После частичного или полного экспорта белка сигнальный пептид удаляется с помощью специфической сигнальной эндопептидазы. Решающую роль в секреции играет гидрофобная центральная часть сигнальной по- следовательности размером около 5,5 нм (от 15 до 19 аминокислот) и находящаяся в высокоупорядоченной конформации. ЫНг-Конец в составе гидрофильного домена (от англ. йотат — регион, область) присоединяется к отрицательно заряженной внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. В ходе трансляции белка гидрофобный участок сигнальной последовательности по- степенно внедряется в мембрану до появления участка расщепле- ния в форме петли на ее внешней стороне. После этого сигнальная эндопептидаза отщепляет сигнальную последовательность от рас- тущей цепи полипептида, способствуя тем самым котрансляцион- ной секреции белка (рис. 10).

К настоящему времени доказано, что котрансляционная секре- ция присуща прокариотам и эукариотам. Таким путем секретиру- ются, например, сс-амилаза у Вас.БиЪхШв, Р-лактамаза у Вас.Нспетгоггтз, экзотоксин у СогупеЬас1епит сирпШепае.

После завершения котрансляционного транспорта рецептор- ные белки мембраны освобождаются и могут функционировать в плоскости мембраны.

У прокариот и эукариот имеется также другой тип секреции —посттрансляционный, когда через мембрану транспортируется завершенный белок. Механизм транспорта объясняется либо с привлечением триггерной гипотезы У. Уикнера (1979), либо ранее рассмотренной сигнальной гипотезы (рис. 11). Согласно обеим гипотезам роль белка - предшественника, обладающего сигнальной последовательностью, весьма велика. В первом случае эта после- довательность обеспечивает скручивание полипептида так, что гидрофобные области его связываются с мембраной. Затем белок может освобождаться из мембраны благодаря отделению сигналь-

57

в

1 1 2 3 4 5 64124 7878 779 81 10 7 11 717

_{^^^шп^^мшА^шмж}

сд

_!

(7^

м

нои последовательности за счет эндопротеолиза. Во втором слу- чае сигнальная последователь- ность полной полипептидной це- пи вместе с рецепторными бел- ками мембраны формирует по- ры. Бедок развертывается и про- исходит перемещение (трансло- кация), сопровождаемая удале- нием сигнальной последователь- ности.

Для эукариот доказано, что их эндоплазматический ретику- лум содержит для работающей рибосомы своеобразные "при- чальные белки", к которым при- соединяется комплекс рибосомы с частицей, узнающей сигналь-

ную последовательность. Частица включает шесть полипептидных цепей и небольшую молекулу РНК с константой седиментации 75. Причаливание рибосомы с частицей индуцирует трансляцию при последующей секреции растущего белка (рис. 12) до момента появления сигнального пептида из рибосомы, когда происходит блокада трансляции.

На основе рассмотренной "сигнальной гипотезы" мож- но сформулировать следую- щие основные положения:

Рис. 12. Начальные этапы векторного пере- носа белков в эукариотических клетках: I — блокирование трансляции, II — снятие блока трансляции после "причаливания" рибосомы — 1, сигнальная последовательность — 2; частица, узнающая сигнал — 3, "причаль- ный" белок — 4, мембрана — 5, сигнальный пептид — 6.

1. процесс экспорта бел- ков эволюционно консерва- тивен (прокариотические клетки узнают сигнальную последовательность эукариот и наоборот);

2. в мембране существует некий механизм экспорта, или аппарат секреции;

3) свободные рибосомы в

цитоплазме клетки и рибосомы, связанные с мембраной, не раз- личаются между собой;

4. у эукариот на эндоплазматическом ретикулуме имеются так называемые причальные белки для функционирующих рибосом, соединенных с частицами, узнающими сигнальную последователь- ность;

5. секретируемые белки синтезируются обычно в форме более длинного предшественника;

6. белки, как правило, секретируются котрансляционно (реже — посттрансляционно), то есть растущий полипептид переносится через мембрану по мере трансляции;

7. в структуре подлежащего секреции белка может существо- вать "стоп"-последовательность, останавливающая секрецию и да- ющая начало интегральному мембранному белку.

Следует вспомнить, что молекулярные массы (ММ) ферментов достаточно большие и находятся в пределах примерно от 12 до нескольких тысяч килодальтон (кДа). Ферменты с ММ более 100 кДа обычно представлены субъединицами (двумя и более).

Нелегко себе вообразить, например, что кишечная палочка, размножающаяся в течение 20—30 минут, реализует множество направленных и строго избирательных биокаталитических процес- сов. Прямыми и косвенными доказательствами в опытах с фер- ментом трансаминазой аспарагиновой кислоты установлено, что отдельные стадии каталитической реакции протекают в простран- стве около нескольких сотен кубических миллимикрометров (нм) за время от десятитысячных до миллионных долей секунды.

Для того, чтобы управлять действием ферментов, необходимы фундаментальные исследования по расшифровке молекулярных основ ферментативного катализа. Многое уже сделано в данном направлении, но это лишь начало, а желательно знать как можно больше о всех группах ферментов.

Согласно классификации (КФ) ферменты подразделяются на шесть главных классов, каждый из которых включает подклассы и подподклассы:

I. Оксидоредуктазы (КФ1.) — катализируют окислительногвос- становительные реакции;

II. Трансферазы (КФ2.) — катализируют реакции переноса функциональных групп (фосфатных, ацильных, гликозильных, аль- дегидных и др.);

III. Гидролазы (КФЗ.) — катализируют реакции гидролиза

60

(перенос функциональных групп на молекулу воды);

4. Лиазы (КФ4.) — катализируют реакции присоединения по двойным связям и обратные реакции;

5. Изомеразы (КФ5.) — катализируют реакции изомеризации, то есть перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных форм;

6. Лигазы (КФ6.) — катализируют реакции образования связей С — С, С — 5, С — ОиС — N. сопряженных с расходованием энергии АТФ или других нуклеозидтрифосфатов.

Подкласс и подподкласс ферментов соответственно обозначают вторым и третьим числами; порядковый номер фермента - четвер- тым числом в его подподклассе. Например, бетаин-гомоцистеин- метилтрансфераза имеет кодовый номер (шифр) — КФ 2.1.1.5, то есть согласно классификации (КФ) этот фермент относится к трансферазам (И-й главный класс), переносящим одноуглеродные остатки (первый подкласс) в форме метила — метилтрансферазы (первый подподкласс), номер конкретного фермента 5 (бетаин: Ь-гомоцистеин 5-метилтрансфераза), катализируемая реакция здесь следующая:

СОО' сн,—зн соон сн,—5— сн»

I I I I

а^-м+Ещсгуз + снг » сн_г-м=(сн₃)₂ + сн₂

не—ж- сн-мкг

^ьетвин I диметилглицин I

соон соон

Ь-гомоцистеин метионин

Классификация и номенклатура ферментов имеют универсаль- ное значение, то есть они распространены на все ферменты, независимо от источника их получения.

Со времени выделения Дж. Б. Самнером в 1926 г. уреазы в кристаллическом виде несомненно признавалось, что все фермен- ты — это простые или сложные белки. В 1981—1982 гг. Т. Р. Чех с сотрудниками открыл каталитическую активность у рибонукле- иновой кислоты. Этим опровергается универсальность принципа "фермент — это белок", а кроме того привносятся новые концепции в ранние этапы эволюции живой материи. Некоторые исследова- тели (Дж. Дарнелл-младший) считают, что первым веществом наследственности была РНК, а не ДНК, поскольку ей присуща

61

большая функциональная универсальность — она способна хра- нить информацию, воспроизводиться, направлять синтез белка и вести себя как фермент. Вместе с тем следует оговориться, что диапазон реакций, катализируемых РНК, еще недостаточно велик, чтобы указанное выше опровержение принималось сегодня в "конкурентный расчет".

В отличие от небиологических катализаторов ферменты — высоко специфичны, они имеют активные центры, многие из них проявляют свою активность в присутствии коферментов (коэнзи- мов) небелковой природы, то есть в таких случаях ферменты являются сложными белками. К сожалению, до сих пор нет достаточной четкости в определениях коферментов и кофакторов. Одни авторы отождествляют эти понятия, другие используют лишь один термин — коферменты, третьи выделяют ионы некоторых металлов в разряд активаторов, прямо не связывая их с кофермен- тами, и т. д. Накопленный фактический материал служит веским основанием подразделять белки-ферменты на две группы — про- стые ферментные белки и сложные ферментные белки, из которых сложные содержат в своем составе неорганические и/или органи- ческие небелковые структуры — коферменты. Коферменты могут обратимо или необратимо (простетические группы) связываться с белковой частью — апоферментом. Полный ферментный комплекс называют холоферментом. Если же действие некоторых фермен- тов лишь активируется неорганическими ионами или атомами металлов и не снимается полностью в их отсутствии, то такие активаторы следует называть кофакторами.

Функции контакта с субстратом и катализа у простых фермен- тных белков выполняют боковые радикалы аминокислот в пол- ипептидной молекуле; в сложных ферментных белках эти функции выполняют преимущественно коферменты.

Коферменты классифицируют по каталитическим и структур- но-функциональным признакам. Например, коферментами окси- до-редуктаз являются: НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, липоевая кислота и др.; коферментами трансфераз-пантотенат, УДФ-глюкоза, ЦДФ- холин, тетрагидрофолиевая кислота и др. Ряд коферментов явля- ются производными витаминов: тиамина (декарбоксилазы сс-кето- кислот, транскетолазы), рибофлавина (ФМН, ФАД), пантотеновой кислоты (кофермент А), никотинамида (НАД, НАДФ) и т. д. Отсюда

62

понятна необходимость отдельных витаминов в питательных сре- дах для биообъектов.

Достаточно много ферментов (порядка 25%) относится к метал- лоферментам, представляющим собой одну из групп металлобио- молекул.

Такие ферментные белки без металлов не проявляют фермен- тативной активности. В тех же случаях, когда ионы металлов не выполняют роли коферментов (металлы-кофакторы), а лишь акти- вируют ферментативные реакции, то такие ферменты по сути

Металлобиомолекулы

Ферментные белки

Оксидоредуктазы Оксидазы (Ре,Си,Мо) Дегидрогеназы (Ре,Си.Мо) Гидроксилазы (ре,Си,Мо) Оксигеназы (Ре)

Супероксид—

дисмутаза

(Си.2п,Мп)

Нитрогеназы

(Ре,Мо)

Гидрогеназы

(Ре)

Транспортные и аккумулирующие белки

Переносчики электронов Цитохромы (Ре) Ре—5(Ре) — белки Си—белки

Акк^гмулщэуюгггие,

лиадорортньге ж

структурные Ферритин (Ре) Трансферрин(Ре) Церулоплазмин (Ре)

Небелковые молекулы

Фотовосстанав —

_ливающие. Хлорофилл (Мд) и Фотосистема II (Мп,Мд)

Транспортирующие металлы и структур —

Сидерофоры (Ре) Скелетные (Са,51)

Гидролазь!

Карбоксипепти—

даза (7л)

Аминопептидазы

(Мд.Мп)

Фосфатазы

(Мд,гп,Си)

Связывающие 0₂ Миоглобин (Ре) Гемоглобин (Ре) Гемеритрин (Ре) Гемоцианин (Ре)

Изрмеразь^^интетазы Витамин В₁₂—белок Коэнзимы (Со) — белки

своей не являются металлоферментами. Их следует называть ме- таллоактивйрованными ферментами.

Можно утверждать, что в металлоферментах ионы металлов выполняют и каталитическую и структурную роли, тогда как в металлоактивированных ферментах — преимущественно катали- тическую. Тем не менее металлы в качестве коферментов и кофакторов в какой-то части сходны в своих функциональных проявлениях. Для металлоактивированных ферментов возможны 4 схемы трехчленных комплексов, участниками которых являются фермент (Ф), субстрат (С) и металл (М) в стехиометрическом соотношении 1:1:1.

М

1) Ф—С—М, 2) Ф—М—С, 3) М—Ф—С, 4) Ф

В первой схеме мостиковое положение занимает субстрат, во второй — металл, в третьей — фермент и в четвертой — металл в циклическом комплексе. Металлоферменты, например, не форми- руют комплекс Ф—С—М, так как при очистке они выявляются в форме Ф—М.

Металлоферментами являются так называемые геминовые ферменты (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза), в составе которых имеется простетическая железопорфириновая группи- ровка, или гем; трансферазы, у которых коферментная форма витамина В12 представлена 5'-дезоксиаденозилкобаламином.

гем

Все ферменты с коферментом В12 катализируют реакции об- мена водорода, связанного с углеродом, на какую-либо иную

64

группу (алкильнуго, аминную, гидроксильную, карбоксильную). Другая коферментная форма витамина В12 — метил-кобаламин (группа СЫ в коррине замещена метилом) участвует в реакциях переноса метильных групп. Кофермент В12 в определенной степени сходен с гемом, однако вместо железа в нем содержится кобальт.

В настоящее время стали известны и новые коферменты. Например, корфин (фактор 430) представляет собой никельтетра- пиррол и напоминает рассмотренные выше макроциклические структуры гема и коррина. Корфин выступает коферментом окси- доредуктазу метанобразующих бактерий, связанных с окислитель- но-восстановительным превращением одноуглеродного субстрата. 3 т. 8524 ⁶⁵

Н₂гЮС

соон

соон

В метанообразующих бактериях найдены также фактор 420, оказавшийся гидридным донором, и фактор, восстанавливающий диоксид углерода.

У метилотрофных бактерий, окисляющих метан, обнаружен кофермент метоксатин, содержащий в своей молекуле ортохино- новую простетическую группу. Оксидоредуктаза — глюкозодегид- рогеназа Асте1оЬас1;ег са1соасеИси8 содержит сходную ортохино- новую простетическую группу. Вот почему такие ферменты пол- учили название хинобелки.

>н У-сн₂- ( он

V -и .О

о ?^нз й ^СО°"

он

_он Ч__СН2_о-р— о' "с' \/Л/^ГЧы|/' ^ СОО" О" О СОО"

фактор 420 - гидридный донор

соо

соо н о СОО~

фактор, восстанавливающий СО2

Механизм действия этих коферментов точно пока неизвестен.

Кофакторами в металлоактивированных ферментах часто вы- ступают ионы магния, цинка, кальция, то есть металлы с постоян- ной валентностью. Например цинк активирует алкогольдегидроге- назу, щелочную фосфатазу; кальций - сс-амилазу; магний — АТФ- азу, гексокиназу и многие другие ферменты; марганец (или магний) — енолазу; калий — пируваткиназу, и т. д.

Из сказанного о металлоферментах и металлоактивированных ферментах следует, что наличие определенных ионов в среде культивирования биообъектов строго обязательно.

Кинетические характеристики биокатализаторов, определяю- щие активность и длительность работы ферментов в различных условиях, являются важными показателями и при промышленном получении ферментов. Все эти данные подробно рассматриваются в курсе биохимии. Здесь же мы останавливаемся лишь на важней- ших параметрах, без которых биотехнология ферментов будет недостаточно охарактеризованной.

В процессе биокатализа активность ферментов и, следователь- но, их каталитические функции снижаются. Кажущаяся структур- ная громоздкость их в нативном виде (от лат. паШге — природа) с лихвой компенсируется эффективностью катализа, если сравни- вать их с неорганическим ("простыми") катализаторами. Однако в изолированном виде ферменты достаточно легко инактивируются, что приобретает важное значение для практики. Отсюда возникает проблема стабилизации активности ферментов в случаях их про- мышленной эксплуатации. Следует заметить, что т лггто инактива- ция и активация ферментов, равно как и синтез их йе поуо или йепио (по-лат. — заново), регулируется самим организмом. К тому же в организме (клетке, ткани) многие ферменты находятся в связанном состоянии. Очевидно, что при этом их конформации больше или меньше изменяются, что не безразлично для клетки с

функциональной точки зрения. Из практической работы известно немало случаев, когда неполностью очищенные ферменты были какое-то время активнее и стабильнее чистых образцов биоката- лизаторов. На этом основании можно предполагать, что так назы- ваемые примеси создавали благоприятное окружение ферменту и, очевидно, выгодное потребителю. Стабилизация ферментов могла быть обусловлена разными факторами, например, иммобилиза- цией на мембранных структурах, соединением с высокополимер- ными углеводами или гликоконъюгатами и пр. Подобная стабили- зация сродни консервации белковой молекулы, так как здесь речь идет о сохранении фермента какое-то (обычно более или менее длительное) время со всеми присущими ему параметрами.

В любом случае при получении ферментов в производстве необходимо опираться на воспроизводимые результаты, заложен- ные в регламенте.

Активность и стабильность—как параметры важны и для вновь внедряемых в производство ферментов, поскольку предполагаемая их "выходная активность" приобретает существенное значение с точки зрения выбора (или проектирования) конструкции реактора, оснащении его необходимой контрольно-измерительной аппарату- рой и т. д. (в частности, для исключения быстрой инактивации фермента).

Активность биокатализаторов измеряют в международных еди- ницах (МЕ) — 1 МЕ соответствует количеству фермента, превра- щающему 1 микромоль (мк/молы 10"⁶ моль) субстрата в 1 мин. в стандартных условиях. Единицы активности могут быть выражены в мкЕ, нЕ и пЕ, то есть соответственно в микро-, нано- и пикоеди- ницах с учетом превращения 10"⁶, 10"⁹ или 10"¹² моля субстрата в 1 мин. Удельную активность выражают в единицах на 1 мг белка. С 1973 г. введена единица ферментативной активности катал (кат.), соответствующая количеству катализатора, способного превра- щать 1 моль субстрата в продукт за 1 секунду. Тогда соотношения катал и МЕ будут следующими: 1 кат= 1 моль субстрата • С"¹ = 60 моль» мин^-1 =60#10⁶ мкмоль* мин"¹=6«10⁷ МЕ, 1 МЕ= 1 мкмоль* мин'= 1/60 мкмоль• с¹ = 1/60 мккат= 16,67 нкат= 16670 пкат. Все это косвенно подтверждает факт трудности выделения ферментов в чистом виде и на практике приходится чаще иметь дело с группой белков в продукте — сырце или в исходном материале, или, наконец, в других партиях материала, подлежащих разделению.

В лабораторных и производственных условиях нередко прихо-

68

дится иметь дело с денатурацией ферментов в зависимости от ряда факторов, например, биологических—гидролиз целевого продукта какой-либо пептид-гидролазой, находящейся в исходном сырье или привнесенной случайно, например, при микробном загрязнении; физических — неадекватное температурное, механическое, ради- ационное воздействия; химических — рН, комплексообразовате- лей, растворителей, ионогенных поверхностно-активных веществ, тяжелых металлов и т. д.

Естественно, что от качества выделения и очистки фермента зависит надежность анализа его структуры. Тем не менее, следует помнить, что одинаковые ферменты, выделяемые из различных источников, могут иметь разные аминокислотные последователь- ности и, следовательно, они не тождественны — их каталитическая активность и свойства будут различными. В качестве примера можно назвать вид Вас. соади1апБ, образующий глюкозоизомеразу; этот фермент активируется ионами Со²⁺ , а такой же фермент, продуцируемый мутантом данного вида при рН более 8, не нуж- дается в ионах кобальта. Вот почему точность имеющейся инфор- мации об источнике фермента, его технологии, паспортных данных приобретает исключительную важность при сравнении фермента, выпущенного разными фирмами-изготовителями.

М. Левитт и К. Чотиа в 1976 г. подразделили структурно известные белки по наличию и расположению а-спиралей и В-слоев на пять классов:

I — белки, состоящие только из а-спиралей, уложенных вместе в глобулярную структуру;

2. — белки, состоящие только из Р-слоев и формирующие глобулу в форме бочонка;

3. — белки, включающие сс-спирали и (3-слои (а + (3-белки), но разобщенные в третичной структуре;

4. — белки а/(3, в которых а- и Р-структурные" участки чере- дуются в первичной структуре, формируя третичную структуру, в центре которой находятся обычно параллельно уложенные р-слои, окаймленные с обеих сторон сс-спиралями;

V — обычно малые молекулы с многими -5—5-мостиками или ассоциированные с крупным кофактором "неупорядоченные бел- ки", обладающие слабой вторичной структурой.

На рис. 13 представлены схемы Дж. Ричардсон (1981) для различных белков, отнесенных к какому-либо одному из пяти вышеназванных классов.

Рис. 13. Пять классов белков по Дж. Ричардсон (1981):

А — миохемеритин (класс I), Б — Си, 2л—супероксиддисмутаза (класс II), В — лизоцим (ос+Р-структура, III класс), Г и Д — две ортогональные проекции НАД—свя- зывающего домена лактатдегидрогеназы (IV класс),

Е — тризофосфатизомераза (ГУ класс), Ж — нейраминидаза вируса гриппа (V класс).

Более или менее длинные цепи белков, как правило, формируют домены, представляющие собой свернутую в пространстве струк- туру, имитирующую маленькую белковую молекулу. Доменам присущи функции связывания, и в ферментных белках активный центр располагается преимущественно на границе между двумя или большим числом доменов. К настоящему времени установлено, что домены способны перемещаться друг относительно друга в процессе функционирования содержащей их молекулы. В трипси- ногене домен из неупорядоченного состояния переходит в упоря- доченное в ходе активации зимогена.

Заметный прогресс в изучении структуры белков начался с конца 70-х годов текущего столетия. Если до этого структуры их выводили на основании метода диффракции нейтронов, карт распределения электронных плотностей с введением в молекулы белков тяжелых атомов, то в последующие годы были развиты методы синхронной радиации, методы с использованием компью- терной техники, что сослужило огромную службу кристаллогра- фии данных биополимеров. В этой связи статичный метод рентге- ноструктурного анализа одиночного кристалла способен дать ди- намичную информацию. На основании указанных методов пока- зано, например, что фермент лизоцим имеет оболочку из 33—35 прочно связанных молекул воды и менее упорядоченную область из 95—105 молекул воды, соединенных с белком лишь одной водородной связью. Около 60—80% остальной воды распределено в промежутках между кристаллами и не влияет на электронную плотность белка.

Молекулы белков не являются жесткими структурами — они подвижны л, следовательно, достаточная лабильность молекул ферментов (молекулярная вибрация) играет важную роль в узна- вании субстрата и стабилизации переходного состояния.

Чтобы увидеть ферменты в действии стали использовать метод рентгеноструктурного анализа при низких температурах (криоэн- зимология) — можно сделать "стоп-кадры" в кинетически значи- мых точках катализируемой реакции.

Теперь хорошо известно, что ферменты, внедряемые в про- мышленность выгодно отличаются от неорганических (или синте- тических) катализаторов рядом преимуществ, существенным из которых следует назвать низкую энергоемкость ферментативных процессов, то есть сравнительно небольшие затраты внешней энергии. На каталитические процессы в промышленности прихо- дится 80—90% и доля их продолжает возрастать. В неорганическом синтезе, например, получают контактным способом десятки мил- лионов тонн серной кислоты в год. При контактном процессе окисление ЗОг в ЗОз протекает в присутствии катализатора Уг05 с добавлением К2О и других оксидов.

В органическом синтезе на никелевых катализаторах осущест- вляют многие реакции гидрирования соединений, включающих С = С, С= С, С = О, N02 — группы. Для примера назовем алюмо- молибденовые, алюмохромовые и алюмоплатиновые катализато- ры, применяемые для дегидрирования линейных и разветвленных алканов в олефины. Так, катализаторы на основе оксида хрома, применяемые в реакции превращения бутана в бутен, работают при температуре около 600°С, а регенерация их протекает при 640—650°С. Оксидные катализаторы окисления С03О4, СГ2О3, МО

эффективны также при температурах 250—600°С. Лишь отдельные катализаторы полимеризации (ВРз) проявляют свое действие при —80°—100°С, например, при получении полиизобутилена. Однако чтобы добиться понижения температуры до —80° или —100° С, также необходима затрата энергии.

Напротив, все биохимические реакции в живых системах потекают при сравнительно низких температурах. Например, фер- менты микроорганизмов — сапрофитов, живущих в почве средних широт нашей страны, относятся к мезофилам, то есть их ферменты эффективно действуют в пределах от + 10 до + 50°С (с преимуще- ственным интервалом от + 20 до + 30°С). Нечто аналогичное можно сказать и о ферментах растений. Ферменты животных более эффективны при нормальной температуре тела.

Тем не менее, следует помнить, что для каждого фермента есть свои так называемые кардинальные точки температуры, рН и др. (ттнтшт, орйтит, тахпгшт).

Необходимо также отметить и тот факт, что скорости фермен- тативных реакций при оптимальных условиях многократно превы- шают скорости реакций, в которых используются неорганические (синтетические) катализаторы.

Ферменты, с точки зрения энергетики, заметно снижают энер- гию активации химических реакций. Под энергией активации понимают количество энергии в Джоулях, необходимое для при- ведения всех молекул 1 моля вещества при определенной темпе- ратуре в состояние критического энергетического уровня (пере- ходный уровень), при котором начинает происходить химическая реакция. Если не все молекулы вещества достигают переходного уровня, то скорость химической реакции снижается.

Основные пути повышения скоростей реакции — это либо использование температурного фактора, либо катализаторов. В случае применения неорганических или синтетических катализа- торов необходимо использовать в большинстве случаев высокие температуры. Как уже было сказано, биокатализаторы эффективно работают при сравнительно низких температурах. Скорости реак- ций зависят от концентраций субстратов. Когда фермент насыщен субстратом, он не может функционировать быстрее — это и есть максимальная скорость реакции (Ушах), то есть, когда доля свобод- ного фермента оказывается предельно низкой.

Общая скорость ферментативной реакции должна быть про- порциональной концентрации фермент-субстратного комплекса Е5 (Е — энзим, 5 — субстрат). Зависимость скорости фермента- тивной реакции от концентрации субстрата графически представ- ляется гиперболической кривой (рис. 14). Км на рисунке представ- ляет собой константу Михаэлиса—Ментен, то есть концентрацию

специфического субстрата, при которой конкретный фермент ■ обеспечивает скорость реакции, равную половине Ушах- До насто- ящего времени анализ кинетики всех ферментативных реакций проводят на основе следующего математического уровнения Ми- хаэлиса—Ментен:

₌ Ушах [5]

° К_м+[8\

где Уо — начальная скорость при концентрации 5, Ушах — максимальная скорость и К_м — константа Михаэлиса—Ментен для данного фермента, соответствующая определенному субстрату.

Нередко прибегают к преобразованиям уравнения Михаэли- са—Ментен для получения каких-либо преимуществ при изучению кинетики ферментативных реакций. В частности, к таким преоб- разованиям относится уравнение Лайнуивера-Бэрка:

1 _К_М 1 1 Уо ~ Ушах [5] ⁺ Ушах

Согласно этому уравнению, по графику, построенному в двой- ных обратных координатах, можно более точно определить Ушах (рис. 15).

На основании взаимодействия фер- ментов и специфичных им субстратов, а также учитывая множество фермента- тивных реакций в клетке или в организ- ме, и, наконец, принимая во внимание другие взаимодействия в биосистемах (антигены-антитела, токсины и их рецеп- торы и т. д.), можно говорить о компле- ментарности как основе биологической специфичности. В большинстве случаев имеет место молекулярная комплемен- тарность. Такие взаимодействия проте- кают согласно законам термодинамики. Однако известны взаимодействия фер- ментов с другими веществами, кото- рые сопровождаются снижением I л полным подавлением активности био- катализаторов. Вещества, подавляю- щие ферментативные реакции, назы- вают ингибиторами (от англ. тЫЪИ — препятствовать, сдерживать). Они из- бирательно взаимодействуют с фер- ментами, например, цианиды, оксид углерода, азид натрия ингибируют оп-

73

ределенные окислительно-восстановительные ферменты; иодаце- тамид, ртутные и мышьяковистые соли блокируют тиоловые фер- менты; амины, гидразиды и др. взаимодействуют с карбонильной группой ферментов и, как следствие, ингибируют их активность. Очевидно, что в живой клетке на принципе "активация-ингибиро- вание" проявляется и требуемая клетке функциональная актив- ность в соответствующих условиях существования.

Все ингрбиторы подразделяют на обратимые и необратимые: среди обратимых выделяют конкурентные и некон- курентные. Обратимые ингибиторы образуют непрочные комплексы с ферментами [Е1], которые способны распадаться на исходные компоненты.

Е+ Ю Е1

Мерой ингибирования является та концентрация ингибитора, которая вызывает угнетение фермента наполовину (Ьо). Отсюда, чем меньше величина I, тем сильнее ингибитор, а чем больше I, тем слабее. В случае взаимодействия необратимых ингибиторов комплексы [Е1] не распадаются и реакция протекает лишь вправо

Е + I -»> Е1

Конкурентный ингибитор связывается с активным центром фермента и далее, в отличие от фермент-субстратного комплекса, не подвергается ферментативной трансформации. Следовательно, конкурентный ингибитор выступает конкурентом субстрату за связывание с активным центром. Изменяя концентрации субстра- та, можно вытеснить из комплекса ингибитор. Примером конку- рентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы является малонат (в норме — субстратом выступает сукцинат).

Неконкурентный ингибитор связывается где-то в другом месте фермента, а не с активным центром. При этом изменяется кон- формация всей молекулы фермента, сопровождающаяся обрати- мой инактивацией его каталитического центра. Неконкурентные ингибиторы взаимодействуют и со свободным ферментом и его фермент-субстратным комплексом:

Е + 1<~Е1 . Е5+1<^Е51

Комплексы Ё1 и Е51 становятся неактивными.

Из сказанного можно сделать вывод о том, что в работу ферментов может вмешиваться множество различных веществ, с помощью которых регулируется их биосинтез и активность. Био- синтез ферментов будет рассмотрен позднее в этой главе. Что же

74

касается регуляции активности биокатализаторов, то, наряду с большим накопленным материалом в этом-направлении, открыва- ются новые пути обмена, в регуляции которых участвуют фермен- ты, и познание которых становится насущно необходимым; давно возникла потребность полнее изучить взаимодействие между известными ме- таболическими циклами с определением роли и механизмов энзиматического ре- гулирования такого взаимодействия, а также исследовать глубину участия раз- личных ферментов в поддержании гоме- остаза организмов (от греч. оетоюв — подобный, одинаковый, 51а515 — состоя- ние, неподвижность), то есть устойчи- вость их внутренней среды.

Любая живая клетка представляется устойчивой системой, поддерживаю- щейся однонаправленным потоком ме- таболитов (рис. 16).

В зрелых клетках концентрации ме- таболитов относительно постоянны. Гибкость устойчивой системы, каковой является зрелая клетка, подтверждается слабыми изменениями и уравновешива- нием сдвигов, благодаря чему организм

поддерживает постоянство внутренней среды вопреки широкому разнообразию питательных веществ, качества воды, внешней тем- пературы и т. д.

При переходе от одноклеточных организмов к многоклеточным регуляторные механизмы ферментативных процессов существен- но усложняются, хотя основные концепции приложимы к сущест- вам любой организации.

В лабораторных или производственных условиях трудно или невозможно увязать изменение ферментативной активности в клетке (ткани) с каким-либо одним (из двух) процессом — возра- станием количества фермента или возросшей эффективностью биокатализатора. Более определенно можно говорить о повышении или понижении активности в тех случаях, когда имеют дело с ферментом в системе (-ах) ш лагго, тем более, что большинство результатов по оценке регуляции их активности получены в таких системах.

В механизмах регуляции ферментативной активности у эука- риотических клеток (в отличие от прокариот) существенна роль физического разграничения (компартментализация) внутреннего

75

содержимого (протопласта). Организация набора ферментов, ка- тализирующих соответствующую последовательность метаболиче- ских реакций, в виде макромолекулярного комплекса координи- рует ферменты и "канализует" интермедиаты (промежуточные продукты) по данному метаболическому пути. Более того, конфор- мационные изменения в одном компоненте комплекса может передаться благодаря белок-белковому взаимодействию другим ферментам комплекса. Вследствие этого возможно приумножение регуляторных эффектов.

Велика роль ионов металлов в металлоферментах и металлоак- тивированных ферментах, в которых аденозин-трифосфат (АТФ) выступает субстратом. Когда комплекс "АТФ-ион металла" оказы- вается субстратом реакции, то обычно максимальная активность наблюдается при молярном соотношении АТФ и металла близким к единице. При избытке того или иного из этих ингредиентов отмечается ингибиторный эффект. Поскольку нуклеозидди- и три- фосфаты образуют стабильные комплексы с дивалентными кати- онами, постольку внутриклеточные концентрации нуклеотидов могут влиять на внутриклеточное содержание свободных ионов металлов и, как следствие, на активность определенных ферментов. Например, конфигурация глутаматсинтетазы кишечной палочки в отсутствие ионов металлов релаксирует ("расслабляется") и стано- вится каталитически неактивной; добавление Мо²⁺ или Мп²⁺ вос- станавливает активность фермента.

Каталитическая активность и регуляция активности ферментов могут протекать в форме мгновенного обратимого ингибирования по типу обратной связи (РеебЬаск тЫЬШоп) с использованием аллостерических эффекторов небольшой молекулярной массы, не имеющих структурного сходства с субстратами или коферментами и связывающимися с аллостерическими сайтами (не активными центрами) ферментов.

_д Ф1 _ Ф2 _в ФЗ _г Ф4 _п А >Б >В >Г >Д

Это — механизм грубого контроля регуляции активности фер- ментов. В указанной схеме продукт Д способен связываться с первым ферментом (Ф1) или ингибировать его. Следовательно, Д — это отрицательный аллостерический эффектор или РеебЬаск- ингибитор Ф1 и таким образом может регулироваться синтез Д. В качестве примера такой регуляции можно назвать ингибирование триптофаном антранилат-синтетазы у микроорганизмов на пути

76

синтеза триптофана, где промежуточным продуктом является ан- траниловая кислота.

Различают кумулятивную, мультивалентную (согласованную) и кооперативную РеейЬаск-ингибиции. В первом случае два или более конечных продукта ингибируют строго аддитивно один регуляторный фермент; во втором — два и более конечных про- дукта находятся в избытке и только при этом условии происходит полная ингибиция реакции; при кооперативной ингибиции един- ственный конечный продукт, присутствующий в избытке, тормо- зит действие регуляторного фермента, но когда, при наличии двух и более конечных продуктов, торможение заметно превышает аддитивные эффекты кумулятивной РеебЬаск-ингибиции.

В отличие от РеебЬаск-ингибиции РеесНэаск-репрессия заклю- чается в том, что производное (дериват) конечного продукта (ре- прессор) подавляет образование ферментов (а не влияет на их активность) в данном метаболическом пути:

/

гД (конечный

i продукт)

-репрессор

(аминокислоты 1

Регуляторную роль в каталитической активности может играть так называемая ковалентная модификация, когда к ферменту присоединяется фосфатная группа (обычно у эукариот) или нук- леотид (обычно у прокариот). Ферменты, подвергающиеся кова- лентной модификации, сопровождаю- щейся модуляцией их активности, на- зываются интерконвертирующими. Они существуют в двух активных со- стояниях — высокой и низкой катали- тической активности (рис. 17).

В ряде случаев конечный или про- межуточный продукт используется в ка- честве активатора какого-либо фермен- та — это аллостерическая активация или РеейЬаск-активация.

Ф-Е

НМФ-Е

Наряду с грубой регуляцией актив- ности ферментов по механизму РеебЬаск-ингибиции известен тонкий контроль, в котором ферменты — алло- стерические белки имеют не только ка- талитические центры для связывания с субстратом, но и близко расположен- ные другие места (одно или более), с

77

которыми связываются небольшие молекулы — эффекторы. При- соединяясь к своему месту, эффектор вызывает конформационное изменение в ферменте. При этом родство каталитического центра фермента к субстрату либо уменьшается — наступает аллостери- ческая ингибиция, либо, напротив, возрастает — наступает алло- стерическая активация (рис. 18).

(а)	(6)

Рис 18. Схематичное изображение модификации активного центра (АД) фермента (Ф) с помощью эффектора (Э), взаимодействующего на аллостерическом сайте (А); 8-субстрат, (а)—аллостерическая ингибиция, (б)—аллостерическая активация.

При реализации инженерно-энзимологических процессов важ- но знать и, следовательно, применять эффекторы на практике. Вследствие компартментализации клеточных процессов у эукариот остаются неизвестными концентрации эффекторов (а нередко — и сами эффекторы) в клетках. Ярким примером здесь служит фосфофруктокиназа - давно и хорошо изученный фермент глико- лиза. Оказалось, что она имеет эффектор — фруктозб-2,6-дифос- фат, открытый лишь 10 лет назад X. Г. Херсом, Л. Хью и Е. Ван Шафтингеном.

Очевидно, что во всех рассмотренных примерах регуляции активности ферментов важное значение имеет чувствительность биокатализаторов к регуляции, то есть нередко усиление (ампли- фикация) "сигнала" может оказать решающее влияние на включе- ние—выключение каскада реакций.

78