I Iсвязанн

■ ' гтг> л и гт«^ п

-| Глюкановый Маннан

слой

Глюк он

Маннопротеины - ферменты

Периплазма Плазмалемма

снз

сн_г-сн=с— сн^-сну-снг— сн—сн~+н

^СН3

витамин К1 (фиплохинон)

Н₃СО. Н_эСО

сн_г-сн=Псн^н ^о«_Гсн=Цн

_ плястошмои А

убминоны

Долихолы являются также участниками реакций переноса ман- нозильных и Ы-ацетилглюкозильных единиц на гликопротеины в клетках млекопитающих.

К производным полипреноидов относятся такие БАВ, как ви- тамины К, убихиноны, пластохиноны, токоферолы (в частности, витамин Е), каротиноиды, фитольная группа хлорофилла, способ-

126

Н,С-СН-(СН ) -СН-(СН,) _СН-(СН ) -с=сн-сн,о-со-к

з | 2'3 | 2'Ъ | ¹ 2 3 | 2

сн₃ сн₃ сн₃ сн₃

остаток фитола

К - Мд-порфириновый скелет

ствующая встраиванию пигмента в липидный слой мембраны, эфирные масла.

В состав эфирных масел входят монотерпены и сесквитерпены, относящиеся к классу терпеноидов, то есть соединений, кратных по составу изопрену (С5Н8).

Почти все мембранные образования внутри клетки являются либо производны- ми клеточной мембраны или

скелетная формула скелетная формула Непосредственно СВЯЗаНЫ С

монотерпенов типа секвитерпенов типа _неи- кОМПЛекС ГоЛЬДЖИ (дИК-

п-ментана (ментол, кадинана (кадинены, ^у

цимеол, лимонены, калакарен и др.) ТИОСОМа у ГрИбОВ И раСТе-

^идр) ний) и эндоплазматический

_{ретикулум (ЭПР), эндосомы или- зосомы, пероксисомы и др. Иск- лючение представляют митохон- дрии, о возникновении которых сказано ранее (рис. 42).}

Рис. 42. Основные мембранные структу- ,,._л „..^ _

ры в эукариотической клетке: 1 -\а1 АРВ ^{И3 У}АФ- ^или ЦМФ-сахаров К точная мембрана, 2 — мембрана мито-

Комплекс Гольджи — пред- ставляется параллельными труб- чатыми структурами, связанны- ми с шероховатым ЭПР (шерохо- ватость ЭПР обусловливается присоединенными к его наруж- ной поверхности рибосомами). Принадлежностью мембраны комплекса Гольджи являются специфические гликозилтранс- феразы, катализирующие реак- ции присоединения моносахари-

хондрий, 3 — ядерная мембрана, 4 — мембрана эндоплазматического ретику- люма, 5 — мембрана диктиосом, 6 — мембрана вакуоли.

белкам с помощью гликозидных связей — через гидроксильную группу серина или треонина, ре- же — через амидную группу ас- парагина. Синтезированный гли- копротеин может выделяться из клетки благодаря экзоцитозу или отлагаться до времени в вакуолях комплекса Гольджи в виде гранул или, наконец, переноситься в другие места клетки. В растительных и грибных клетках аналогом комплекса Гольджи является диктио- сома — немногочисленные параллельные дисковидные пластинки, по периферии которых имеются валикообразные расширения и множество разной величины пузырьков. Не исключается возмож- ность участия диктиосомы в синтезе и секреции компонентов клеточных стенок.

ЭПР — мембранная структура, локализующаяся вблизи ядра. Считается, что секретируемые белки мембран синтезируются при участии шероховатогоЭПР, а белки, которые используются клеткой — на свободных рибосомах. Без присоединенных рибосом ЭПР называют гладким. В нем локализуются различные ферменты, включая оксидазы, участвующие в детоксикации ядо- витых для клетки веществ. При участии гладкого ЭПР осуществ- ляется синтез липидов и гидролитическое расщепление гликогена (гликогенолиз).

Эндосома — это мембранная везикула (от лат. уев1си1а — пузырек), возникающая в результате эндоцитоз а; под термином эндоцитоз понимают проявления общего механизма захвата плот- ных частиц (фагоцитоз, от греч. рпадов — поедание), вирусов — виропексисот лат. рех1в (в конце слова) — соединение, скрепление, коллоидов (коллоидопексис)и капелек жидкости (пиноцитоз, от греч. рто — пью, впитываю). Однако чаще захват водонерастворимых веществ (микробов, эритроцитов и других частиц с диаметром более 1 мкм) с образованием ф а г о- с о м ы относят к фагоцитозу, тогда как поглощение водораство- римых веществ с ММ от 180 до 150000 Да и более (антитела, гормоны, маннит, пептиды, сахароза, ферменты) с образованием пиносомы относят к пиноцитозу. Пиноцитоз может быть неселективным (жидкостно-фазным), когда поглощаемое вещество предварительно не связывается с мембраной, и с е- лективным (неспецифическим, адсорбционным и рецепторно-опосредованным), когда вещество предварительно связывается с определенными участками мембраны.

Следовательно, эндосома возникает при эндоцитозе благодаря инвагинации (впячиванию) клеточной мембраны, проявляющей свойства текучести и самозамыкания (жидкостно-мозаичная структура). Во многих случаях эндоцитоз опосредуется рецептора- ми, находящимися на поверхности мембраны (мембранные "пэт- чи", от англ. ра1сп — лоскут, обрывок, заплата). У простейших и низших позвоночных эндоцитоз является единственным механиз- мом питания. На поверхности клетки может располагаться множе- ство рецепторов. Например подсчитано, что на одном нейтрофиле размещается порядка 2»10⁵ рецепторов лишь для фракции компле- мента 5а, а клетка СапсИёа аГЫсапв связывает около 2,5-3» 10⁵ молекул СЗ-фракции комплемента. Рецепторами в гепатоцитах (клетки печени) являются структуры, распознающие галактозу и ГЧ-ацетилгалактозамин в гликопротеинах (Гал/Гал-МАц-рецепто- ры), в том числе — в 1дС-иммунных комплексах; секреторные компоненты, связывающие 1дА-иммунные комплексы; рецепторы, специфичные для маннозо-6-фосфата, и т. д.

Рецепторы животных организмов подразделяют на э к с т е- рорецепторы и интерорецепторы. Первые из них воспринимают сигналы извне: слуховые, обонятельные, вку- совые, тактильные (от лат. гасгШв — осязательный), и др.; вторые воспринимают из внутренней среды — гормональные, медиатор- ные. Так, наиболее чувствительные к нервным медиаторам участки между нервными волокнами и клеточной мембраной называют

5 т. 8524 ¹²⁹

медиаторными рецепторами, а мембранные сайты, чувствительные к гормонам, называют гормональными рецепторами. Иногда используют термин химичес- кие рецепторы, когда хотят сказать о биомолекулах клетки, взаимодействующих с лекарственными или токсическими вещест- вами. Так, веротоксин Е. соН 0157.-Н7 взаимодействует с рецепто- рами ряда клеточных линий, включая Не1а и Уего. Вначале его В-субъединица присоединяется к специфическому рецептору на поверхности клетки с интернализацией (от лат. т1егпи5 — внут- ренний) активной субъединицы А, которая прерывает функции клетки благодаря взаимодействию со специфическими компонен- тами субклеточной "машины". Указанный выше рецептор специ- фичен для веротоксинов 1, 2 и 5Ыда-токсина. Он представляет собой гликолипид — глоботриозилцерамйд (СЪЗ).

Рецепторами также могут быть сульфгидрильные, карбониль- ные, аминные и другие функциональные группы. Однако рецеп- торы обладают не только химическими группировками или моле-

ОН ын-сок I I

НзС-ССН^ ₂-сн=сн-сн-сн-сн₂он

церамид (Р-остаток жирной кислоты)

кулами взаимодействия с лигандами, но и своей архитектоникой (от греч. агспйес1отке — строительное искусст- во). Так, в вегетативной нервной системе место контакта нервных элементов — синапс включает: пресинаптическое нервное окончание, в котором синтези- руется медиатор; синаптическую щель, куда поступает медиатор; постсинаптиче- скую мембрану, в которой имеются ре- цепторы, взаимодействующие с медиато- рами (рис. 43). Широко известными ме- диаторами являются адреналин, норадре- налин, ацетилхолин.

Поэтому говорят об адренорецепто- рах и холинорецепторах (рис. 44). Изве- стны се1-, а2-, Р1-, 02- и у-адренорецепто- ры, а также холинорецепторы нервно- мышечных синапсов (рис. 45). Одни хо- линорецепторы проявляют высокую чув-

130

ствительность к алкалоиду мускарину, поэтому их называют м-холинорецепторами, другие — к алкалоиду никотину, их называют н-холи-норецепторами. На примере н-холинорецептора из электрического органа электрического ска- та доказано, что рецептор существует в виде розеток в двух формах —¹ легкой (95 кДа) и тяжелой (135 кДа); первая — мономер, вторая — димер (рис. 46).

Специфическими лигандами для рецепторов в а-бунгаротокси- не являются аминокислоты Арг-37 и Асп-31. а-Бунгаротоксин образуется крайтом Випдашз (змея — аспид); он представляет

сн—сн_г I ²

он

-т—сн,

он^

СН—СН₂—МН,; ОН

морадреналин

н₃о—СО—О—(СН₂)_г—Мн(СН₃)₃ вцетилхолин

собой полипептид из 71-74 аминокислотных остатков, стабилизи- рованный четырьмя дисульфидными мостиками (жесткая структу- ра).

Из рис. 46 следует, что ионный канал в н-холинорецепторе создается самим рецептором. Теперь доказано, что женщины, болеющие раком молочной железы и не имеющие на раковых клетках рецепторов эстрогена, излечиваются эндокринными пре- паратами лишь в 10% случаев. Напротив, при наличии таких рецепторрв излечиваются подобными средствами в 50-65% случаев и более. Заболевания типа тяжелой миастении (Муаз1ета дгалав) и редкой устойчивой к инсулину формы диабета обусловливаются аутоиммунными реакциями, когда собственные антитела блокиру- ют рецепторы, вызывают их транспозицию (перемещение) внутрь клетки и разрушение.

ШРецепторы, соединяю- ^а.<'""ЛХ щиеся с молекулами — ли-

. ".',■'"'•{ /V* гандами, группируются в /' образовывающихся в мемб- ₅ .чы-/ ране окаймленных ямках,

Рис. 46. н-холинорецептор электрического ^или углублениях. Диаметр

ската; молекулы рецептора в составе фосфо- углублений ОКОЛО 100 НМ. В липидных пузырьков (А); розетка рецептора структуре ИХ ВЫДвЛЯЮТ ТЯ- (Б) с двумя местами связывания а-бунгароток- ,,,,, . „„ . . „

сина желые (ММ = 180 кДа) и лег-

кие (ММ = 35 кДа) цепи клат- ринов (от лат. скШшт — решетчатый барьер), формирующих ассамблею протомеров в форме корзинок, которые и покрывают окаймленные углубления. При эндоцитозе клатриновая клетка — ловушка втягивает внутрь участок мембраны — пэтч. При этом углубления как бы опускаются внутрь клетки, края их сужаются, остается маленькое отверстие, которое вскоре исчезает, и мемб- рана становится гладкой. Мембрана таким образом лишается пэтча, трансформировавшегося внутри клетки в свободно передвигаю- щуюся везикулу (пузырек). В зависимости от процесса (фагоцитоз, пиноцитоз) везикулу называют: "фагосома", "пиносома", "фагоци- тарная", "пиноцитарная" или "эндоцитарная вакуоль", эндосома. Окаймленные ямки дают начало окаймленным пузырькам, теряю- щим впоследствии клатриновое покрытие и способным сливаться с другими неокаймленными везикулами — эндосомами, лизосома- ми по 1шс- и шранс-м еханизмам. Цис-механизм заключается в слиянии поверхностей мембран, непосредственно контактирую- щих с цитоплазмой. Транс-механизм заключается в сближении наружных поверхностей мембраны. По цис-механизму протекает

132

экзоцитоз, слияние везикул в цитоплазме, поглощение одной ве- зикулы другой (аутофагия), почкование; по транс-механизму про- текают: захват мембранных везикул, разделение везикул, эндоци- тоз.

Функция эндосомы — первичная внутриклеточная переработка захваченных веществ при рН ниже 7,0 с последующим транспор- том их в лизосомы или, обходя последние, в места хранения (гранулы).

Эндосомы могут сливаться с клеточной мембраной, и тогда их содержимое выводится из клетки — экзоцитоз. Участки мембраны (пэтчи) могут' отделяться с частью содержимого от эндосомы и возвращаться в одних случаях — на прежнее место (такой процесс называется регургитацией, от франц. гедигдЯаноп — излияние, извержение), в других случаях — на противоположную сторону клетки, где сливаются с мембраной и немодифицированный материал выводят наружу — д и а ц и- т о з (от греч. сИа — через). Продукты экзоцитоза (литические ферменты, гормоны и другие вещества) поступают в околоклеточ- ные пространства, в кровяное русло, в специализированные сек- реторные протоки (например, слюна, секрет поджелудочной же- лезы и т. д.).

В некоторых случаях эндосомы на время превращаются в вакуоли, то есть когда по каким-либо причинам слияние их с лизосомами приостанавливается. Регуляторами таких процессов могут выступать некоторые гликопротеины (например, конканава- лин А), микобактерий туберкулеза и другие факторы.

Весьма существенной для жизнедеятельности эукариотических клеток является способность мембран любых компартментов клет- ки сливаться и разъединяться. Поэтому регулируемый поток в мембранных образованиях в направлении: клеточная мембра- на (эндоцитоз) —» эндосома —» лизосома —» комплекс Голь- джи —» ЭПР —> коплекс Гольджи —» секреторная гранула (экзоцитоз) в основном экспериментально установлен и, следова- тельно, реален.

Лизосомы (0,5 х 2-3 мкм в диаметре) происходят из эндосом. Их число в клетке может достигать нескольких сотен. Лизосомы характеризуются большим полиморфизмом и размерами. Они представляют собой мембранные образования, в которых проис- ходит "переваривание" поступающих в клетку веществ с помощью гидролаз при рН = 3,5-5,0. В лизосомах обнаружено свыше 50

гидролитических ферментов. Продукты гидролиза ранее поступив- шего материала проникают через мембрану лизосом во вне — в цитозоль (основной наполнитель клетки, состоящий из воды с водорастворимыми компонентами), в том числе — связанные с выработкой энергии (гликолиз).

Известны лизосомотропные вещества, которые в непротони- рованной форме (незаряженной) проникают через мембрану ли- зосом и могут накапливаться в них. Они, как правило, являются лиофильными слабыми основаниями и могут быть использованы в практических целях. К их числу относятся противомалярийный

МН-СН-(СН ),-М=(С,Н,)_э препаратхлорохин-про- ^{1 1 73} * ъ * изводное 4-аминохиноли-

н а. Накапливаясь в лизо- сомах, хлорохин блокиру- ем ет метаболизм гемоглоби- на — единственного ис- точника питания малярий- ного плазмодия. Лизосомотропизм слабых оснований базируется на механизме протонной ловушки. Такой механизм присущ и эндосомам, неко- торым отделам комплекса Гольд-

П у д "\ ^жи- (Р^ис- ⁴⁷)-

■ ^ . ,^ IШ 11 НО ^ клетках печени и почекмле-

$ \ /I _(ос^г„_ос) копитающих, растений и грибов

имеются пероксисомы — неровные округловатые мембран- ные образования 0,5-10 мкм в ди- Рис 47. Лизосома — протонная ловуш- аметре, заполненные компактным

ка;П—препарат, ПН⁺— протонизиро- аморфным матрИКСОМ С ПЛОТНОЙ ванный препарат, 1 — быстрое проник- „ „

новение, 2 - протонный насос, з - кристаллоиднои сердцевиной. В медленный выход. них осуществляется окислитель-

ный метаболизм, главным ₀

О,-

АН, А*

АН₂ А

А и А" — субераты (А' — нлзкомолекулярный)

_{участником которого высту- пают пероксисомальные ок- сидазы и каталаза: Можно полагать, что "пероксисо- мальный тип дыхания" (не}

экономичный, но простой по реализации) возник задолго до того, как были "включены" в аэробное дыхание митохондрии. Перокси- сомы — органеллы, возникшие в ответ на появление кислорода в атмосфере. В пероксисомах происходит р-окисление жирных кис- лот. Субстратами окисления (кроме жирных кислот) могут быть разные соединения, включая Б- и Ь-аминокислоты, гидроксикис- лоты, спирты, амины, пурин, но никогда НАД»Н, который окисля- ется в митохондриях. Пероксисомы участвуют также в синтезе углеводов.

У инфузорий (ТеггаЬутепа ругйоггтз) пероксисомы называют глиоксисомами, в которых содержатся лишь два фермента глиоксилатного пути окисления веществ — изоцитрат-лиаза и малат-синтаза.

У некоторых протозойных организмов имеются одномембран- ные органеллы — гликосомы и гидрогеносомы. В первых протекает гликолиз, во вторых — окисление пирувата, сопряженное с синтезом АТФ (у Тпспотопаз Vадта1^5 нет мито- хондрий, но есть пероксисомы). При аэробных условиях высво- бождающиеся при окислении электроны передаются на кислород с образованием НгО; при анаэробиозе электроны переходят к протонам (Н⁺) и образуется водород (Н2). В этой последней реакции участвуют гидрогеназа и ферредоксин (белок с низким окисли- тельно-восстановительным потенциалом).

У грибов имеются хитосомы, содержащие фермент хитинсинтазу, катализирующую реакцию синтеза микрофибрилл хитина. Хитосомы транспортируют микрофибриллы к клеточной стенке, где и собирается хитин. Так же у грибов известны л о- м а с о м ы, располагающиеся между клеточной стенкой и клеточной мембраной. Как производные клеточной мембраны они могут возникать в результате дисбаланса пластичности и тургора клеток, то есть когда мембрана образуется "с избытком". Функция их окончательно не выяснена, но, очевидно, ломасомы могут быть причастными к процессам экзоцитоза и секреции веществ, хотя такой вывод не является окончательным.

При выделении органелл и последующей работе с ними опи- раются на маркерные структуры, топологически привязанные или ассоциирующиеся с ними. Чаще всего такими маркерами являются ферменты (таблица 12).

Фермент - маркер

Классификационный номер фермента (КФ)

Органелла

Аденилатпиклаза

Ыа⁺, К⁺-АТФ-аза 5' - Нуклеотидаза

Лейцинаминопептидаза 7 - Глутамилтранспептидаза Глюкозо-6-фосфатаза НАДфш-цитохром-

О-редуктаза

Эпоксигидролаза

Галактозилтрансфераза

Сиалилтрансфераза

НАДФ-фосфатаза

Сукцинатдегидрогеназа

4.6.1.1

3.6.1.37 3.1.3.5

3.4.11.1 2.3.2.12 3.1.3.9 1.6.2.4

3.3.2.3

2.4.1.38

2.4.99.1

3.6.1.22

1.3.99.1

Клеточная мембрана (базолатеральная)

Клеточная мембрана (апикальная)

ЭПР

Аппарат Гольджи

Митохондрии

(внутренняя

мембрана)

Цитохромокисидаза Ротенон⁺ -нечувствительная НАД»Н-цитохром с-редуктаза Моноаминооксидаза

Кинуренин ^{+ +} -3-гидроксилаза Кислая фосфатаза р - Глюкуронидаза Каталаза

Лактатдегидрогеназа

1.9.3.1

1.6.99.1 1.4.3.4

1.14.13.9

3.1.3.2

3.2.1.31

1.11.1.6

1.1.1.22

Митохондрии (наружная мембрана)

Лизосомы II

Пероксисомы Цитозоль

-сн—соон ин₂

Примечание: ⁺Ротенон является производным изофлавона, ^{+ +}Кинуренин — производ- ное триптофана

_{^-сса ' ОС.}

кинуремии

В последние годы широко используется термин гликока- л и к с (от греч. дгуЫв — сладкий, саИх — оболочка) преимущест- венно в отношении животных клеток, хотя нередко используют его и в более обобщенном виде, то есть когда гликокаликсом называют наружную часть клеточной мембраны эукариот, вклю-

136

чающую гликопротеины и гликолипиды, предназначенную для узнавания однотипных и чужеродных клеток. Иногда вместо на- звания "гликокаликс" пользуются термином "пушистая оболочка", особенно тогда, когда идет речь о толстой оболочке, выстилающей кишечник. Как бы то ни было, термин "гликокаликс" приложим ко всем клеткам (в том числе — безъядерным как, например, эритроциты), у которых мембранные олигосахаридные цепи в гликоконъюгатах выполняют функции признания (рекогниции). Из мембранных гликопротеинов наиболее полно изучены г л и- кофорин и фибронектин (от греч. гагов — нести, от лат. йЪга — волокно, пес1ег — связывать, присоединять). Первый из них содержится в эритроцитах, в нем около 50% углеводов и 130 аминокислотных остатков, ММ его 30 кДа. Фибронектин содержится в клеточных мембранах других клеток, он обладает выраженной адгезивностью (от лат. асШаевю — слипание, сращение) и способствуетконглютинации (отлат. сопд!иипаио — склеивание) гомологичных клеток.

К мембранным белкам относятся также л е к т и н ы, выпол- няющие функции признания и защиты. Известны бактериолекти- ны, миколектины, лихенолектины, ихтиолектины, зоолектины (все- го порядка 1000 лектинов). Ряд из них широко используется на практике для исследования клеточных мембран, в гистохимии, в структурной химии углеводов и т. д.

Эукариотическая клетка содержит ядро, состоящее из ДНК, РНК, белков и ряда низкомолекулярных веществ. Низшие грибы полинуклеарны. Ядро окружено двухслойной липопротеиновой мембраной, в которой имеются ядерные поры — поросомы. ДНК вместе с гистонами (нуклеосомы) формируют хромосомы, число которых различно у разных организмов (чаще число их находится между 10 и 50). Ближе к центру каждой хромосомы располагаются центромеры, связывающиеся с ахроматиновым веретеном в пери- од деления клеток. Оформленное ядро эукариотической клетки содержит ядрышко, в котором сосредоточены гены, кодирующие синтез 285, 185 и 5,85 рРНК. Ядрышко является также местом образования рибосом. Около ядра клетки располагаются две цен- триоли, представляющие собой белковые микротрубочки, содер- жащие белок тубулин (в растительных и грибных клетках центри- оли не обнаружены). Центриоли входят в состав митотического аппарата — биполярной структуры в форме веретена.

Рибосомы эукариот по морфологии и функции напоминают рибосомы прокариот. Однако они сами и их субчастицы характе- ризуются другими константами седиментации — для недиссоции- рованных рибосом 805, для большой субчастицы 605, для малой 405.

В цитоплазме эукариотической клетки находится большое ко- личество (до нескольких тысяч) энергообеспечивающих структур — митохондрий, возникших эндосимбионтно. Средние прибли-

Рис. 48. Эукариотические клетки: I

• грибная, II — растительная, III — животная. (1 — клеточная стенка, 2

• клеточная мембрана, 3 — ядро, 4

• ядрышко, 5 — конденсированный хроматин, 6 — рибосомы, 7 — пол- ирибосомы, 8 — шероховатый эндоп- лазматический ретикулум, 9 — аппа- рат Гольжди (диктиосома — у грибов и растений), 10 — митохондрии, 11

• ядерные поры, 12 — вакуоль, 13

— пиноцитозный пузырек, 14 — " окаймленный пузырек, 15 —лизосо-

ма, 16 — окаймленная ямка, 17 — волокнистая область, 18 — тонофи- ламенты, 19 — десмосома, 20 — плаз- модесма, 21 — плотный контакт, 22

— жировая капля, 23 — центриоль (триплеты микротрубочек).

1x7 мкм. Это — двухмембранная органелла, причем внутренняя мем- брана выраженно складчатая. Складки ее, называемые к р и с - т а м и (от лат. спв1а — гребень), образуют митохондриальный мат- рикс, внутри которого локализуют- ся рибосомы и кольцевидно-замк- нутая ДНК, кодирующая некото- рые митохондриалъные белки (ми- тохондрии во многом сходны с бак- териальным протопластом). Во внутренней мембране локализует- ся цепь переноса электронов и фер- ментный комплекс, катализирую- щий реакции образования макро- эргического АТФ.

На рис 48 показано принципи- альное сходство эукариотических клеток млекопитающих, растений и грибов.

4.4. Некоторые функциональ- ные особенности клеток и клеточ- ных систем. Биотехнология базиру- ется на практической реализации метаболической активности кле- ток, выделенных из природных суб- стратов или экспериментально со- зданных в лабораторных условиях. В зависимости от целевого продук- та, получаемого при реализации би- отехнологического процесса, поддерживают соответствующий уровень метаболической активности биообъекта. Если речь идет о каком-либо метаболите, тогда задают такие параметры культиви- рования, которые обеспечивают максимальный выход данного вещества. Если же конечным продуктом является биомасса клеток

или тканей, то в процессе выращивания создают условия для максимального выхода их в расчете на число одиночных клеток, на вес массы по отношению к объему среды, либо количеству потребленного субстрата (экономический коэффициент).

Питательные среды, рекомендуемые для культивирования представителей акариот, прокариот и эукариот принципиально отличаются между собой в том смысле, что для "выращивания" акариот необходимы живые клетки или ткани. Так, вирусы гриппа накапливают в куриных эмбрионах, вирус табачной мозаики — на растениях табака, фаги — в клетках бактерий и т. д.

Большинство прокариот достаточно легко культивируется на доступных питательных средах, однако среди них есть виды, которые с трудом или совсем не растут в таких условиях — им, как и акариотам, нужны живые ткани (некоторые спирохеты, пневмоцисты, риккетсии, хламидии). Такие виды называют обли- гатными паразитами, что необходимо учитывать при организации соответствующих производств.

Эукариотические клетки, как правило, удается культивировать в лабораторных и производственных условиях с большим или меньшим успехом. При сравнении, например, клеток дрожжей — сахаромицетов, используемых в производстве вин, и клеток — бластов человека, применяемых в производстве интерферона, культивирование последних сопряжено с большими трудностями, чем культивирование первых. В такой же мере можно говорить о различиях клеток растений и животных. Для клеток растений характерна тотипотентность, то есть способность любой отдельной растительной клетки в соответствующих условиях культивирова- ния трансформироваться в целое растение. Клетки животных не обладают такой способностью и выращивать их труднее, чем клетки растений.

Питательные среды для прокариот и эукариот должны содер- жать все необходимые ингредиенты, используемые в конструктив- ном и энергетическом обмене (источники азота, углерода, серы, кислорода, водорода, фосфора, витамины). В качестве примеров можно привести питательные среды для ЕзспепсЫа соИ, РешсШшт спгубодёпит, культур клеток табака и В-лимфобластов человека (таблицы 13-16). Е. соИ широко используют в биотехнологии, в частности, штаммы, несущие чужеродную генетическую инфор- мацию о синтезе человеческого гормона соматотропина, или штам-

139

мы, секретирующие энтеротоксин, и другие; отдельные виды пенициллов являются продуцентами антибиотиков пенициллино- вого ряда: бензил-, оксибензил-, феноксиметил-, 6²-пентил-, п-геп- тил-, п-амил-, аллилмеркаптометилпенициллинов с общей форму- лой:

к—со—ын

(СНз), СООН,

тсс

о

Культуру клеток N. 1аЪасиш используют для пол- учения алкалоида никотина, а культуру клеток лимфобла- стов, например, В-ряда — для получения белка сс-ин- терферона.

Ингредиент

миллимоли

мг/л НгО

мг%

Кукурузный экстракт Гидрол Лактоза

Аммония нитрат Натрия сульфит •5НгО

Натрия сульфат •10Н₂0

Магния сульфат •7Н₂0 Марганца сульфат • 5НгО Цинка сульфат

Калия

дигидрофосфат Кальция карбонат Кислота фенилуксусная

8,7 15

4,6

1,6

1

0,008 0,1

14 30

3»10-'

5»10³ 3»10³ 1,25»10³

1*10³

500

250

20 20

2»10³ 3»10³

1»10³

300

500 300 125

100

50

25

2 2

200 300

100

Питательная среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга (М5) для культиви- рования клеток N. таЪасшп включает следующие компоненты (таблица 15).

Таблица 15 Питательная среда для N. 1аЬасит

Ингредиент	Миллимоли	мг/л НгО	мг%
Калия нитрат Аммония нитрат Магния сульфат «ШгО Кальция хлорид »2НгО Калия дигидрофосфат Марганца сульфат »4НгО Цинка сульфат »4НгО Кислота борная Калия иодид Меди сульфат »5НгО Натрия молибдат »2НгО Кобальта хлорид «бИгО Железа закисного сульфат »7НгО Натрия ЭДТА* »2Н20 Мезоинозит Тиамин гидрохлорид Пиридоксин гидрохлорид Ксилота никотиновая Глицин Гидролизат казеина Сахароза БАП* НУК" ДФУК'	19 20 1,5 2,9 1,2 0,1 0,0037 0,1 0,005 0,0001 0,001 0,0001 0,1 0,1 0,6 0,0014 0,0024 0.004 0,027 87,7 0,002 0,0053 0,0009	1900 1650 370 440 170 22,3 8,6 6,2 0,83 0,025 0,25 0,025 27,8 37,3 100 0,4 0.5 0,5 2 10000 30000 0,5 1 0,2	190 165 37 44 17 2,23 0,86 0,62 0.083 0,0025 0,025 0,0025 2,78 3,73 10 0,04 0,05 0.05 0.2 1000 3000 0,05 0,1 0,02

Примечание* ЭДТА — этилендиаминтетраацетат; БАП (цитокинин) — 6-бензиламинопу рин; НУК (ауксин) — онафтилацетат; ДФУК (ауксин) — 2,4-дихлорфеноксиацетат.

М5-среда многоцелевая, универсальная, подходит для каллусо- образования и индуцирует морфогенез многих двудольных расте- ний.

Среды для культивирования клеток животных являются более сложными по сравнению с приведенными выше средами, предназ- наченными для бактерий, грибов и клеток табака. Так, X. Игл предложил минимальную незаменимую среду (МЕМ), вариант которой по Р. Далбекко (ДМЕМ) содержит следующие компоненты (таблица 16).

По сравнению со средой МЕМ в среде ДМЕМ почти в два раза увеличино содержание аминокислот и в 4 раза — витаминов. Ее используют для культивирования различных видов клеток.

С учетом особенностей клеток в среды МЕМ и ДМЕМ можно вносить какие-либо добавки, например, трансферрин, инсулин, бычий сывороточный альбумин, цельную или диализованную сы- воротку крови (5-10% по объему).

Кроме подобных сред предложены также бессывороточные

142

среды, в которых сыворотка крови замещается смесями из очи- щенных белков, пептидов, липидов, микроэлементов и других веществ. Однако они, в большинстве своем, не являются универ- сальными.

Разнообразие питательных веществ Д средах для культивиро- вания клеток млекопитающих служит предпосылкой к строгому соблюдению мер предосторожности в целях предотвращения за- грязнения их вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами. В сравнительном плане клетки прокариот и эукариот заметно раз- личаются по скорости роста. Поэтому, например, животные и большинство растительных клеточных систем уступают в конку- ренции микробным системам.

С биотехнологической точки зрения важными являются поня- тия о первичных и вторичных метаболитах или о реакциях первичного и вторичного обмена, которые сходны у всех живых организмов. К реакциям первичного обмена относят образование и расщепление нуклеиновых кислот и оснований, белков и их предшественников, а также большинства углеводов, липидов, не- которых карбоновых кислот. К реакциям вторичного обмена от- носят те из них, которые сопровождаются образованием алкалои- дов, антибиотиков, триспоровых кислот, гиббереллинов и некото- рых других веществ, расцениваемых несущественными для про- дуцента. Более того, образование вторичных метаболитов свойст- венно не всем видам, а лишь только некоторым.

Реакции первичного и вторичного обмена трудно дифферен- цируемы, а существенность или несущественность вторичного метаболита для продуцента оценивается весьма субъективно и нередко без учета роли его в естественных ассоциациях различных организмов. Вот почему научно более обоснованным является представление о первичных метаболитах как продуктах матрично- го синтеза, то есть белках (преимущественно — ферментных), а вторичные метаболиты представляют собой продукты реакций, катализируемых ферментами (Н. П. Блинов, 1979):

I ► Преметаболиты ч

| ► Интермедиаты, или прометаболиты

ГИнформационные I

молекулы *

—► Первичные^етаболйты

а) ферментные белки *

б) неферментные белки Вторичные метаболиты -

Преметаболиты в схеме представляют собой простые питатель- ные вещества, поступающие извне (аммоний, ионы металлов, углекислота, сульфаты, фосфаты, нитраты, для гетеротрофов — моносахариды и некоторые другие).

К интермедиатам, или прометаболитам относятся простые са- хара, аминокислоты, нуклеиновые основания и др. Информацион- ные молекулы ДНК и РНК вычленены из состава других реакций, хотя их синтез и распад (прерывистые стрелки) также катализи- руются ферментами. Важно подчеркнуть, что, в отличие от пер- вичных метаболитов образование вторичных метаболитов непос- редственно не кодируется ядерной или цитоплазматической ДНК. Согласно такому представлению все живые организмы синтези- руют присущие им первичные и вторичные метаболиты.

Г На основании положений, сформулированных В. Н. Шапошни- ковым (1939), каждый продуцент в своем развитии проходит две фазы, названных Ж. Д. Бу'Локком (1961, 1967) трофофазой и идиофазой (от греч. гхоиэ —- питание, 1с1ю5 — свой, специфический). В период трофофазы активно протекают конструктивный и энер- гетический обмен — в клетках преобладают синтетические про- цессы, нарастает количество первичных метаболитов и ряда внут- риклеточных вторичных метаболитов — липидов,. гликанов, глико- конъюгатов; скорость роста и размножения организма при этом высокая, а продукция экзогенных вторичных метаболитов низкая, и, напротив, в идиофазу скорость роста и размножения низкая, а продукция экзогенных и эндогенных вторичных метаболитов вы- сокая (рис. 49). Продуктивность культуры может быть повышена за счет внесения предшественников метаболитов (преимуществен- но в период времени, приходящийся на конец идиофазы). .

^{м м}

Из рис. 49 видно, что продолжительность трофофазы более короткая у дрожжей, чем у пеницилла и клеток табака. Накопление этанола 5. сеге\а51ае сопровождается возрастанием ингибирующей активности его на продуцент и поэтому кривые, приходящиеся на идиофазу идут почти параллельно, повторяя характер кривой для первичных метаболитов, биосинтез которых начинается в период трофофазы.)

Биосинтез фибринолитического фермента (первичный метабо- лит) клетками кератиноцитов млекопитающих полностью корре- лирует с ростом числа клеток (2) и не коррелирует с числом их в стационарной фазе (3) или, тем более, в фазе отмирания (4).

Пенициллин, синтезируемый Р. спгузодепит, и не ингибирую- щий продуцент, выраженно накапливается в идиофазу.

Алкалоид никотин синтезируется клетками табака замедленно и при переходе культуры в стационарную фазу выход его заметно уменьшается.

В каждом из приведенных примеров можно отметить свои особенности биосинтеза первичных и вторичных метаболитов, что определяется возрастанием сложности клеточных систем при пе- реходе в ряду -» Мусоъа -» Р1ап1ае -» АштаИа среди представителей эукариот. В любом случае первичные и вторичные метаболиты образуются клетками как естественные продукты в процессе их культивирования в соответствующих средах и под каталитическим действием ферментов. Эти последние могут инги- бироваться с помощью специальных веществ, называемых анти- метаболитами, имеющими структурное сходство с метаболитами. Такие вещества являются исключительно важными для выяснения и познания путей обмена веществ, а также для использования наиболее активных из них как лечебных средств. В качестве примеров можно попарно назвать следующие метаболиты и анти- метаболиты:

СООН

СООН

(сн₂)₂

СООН

СООН

янтарная кислота (метаболит)

малоновая кислота (антиметаболит)

аденин (метаболит) 6-меркаптопурин (антиметабопит)

С учетом более медленного (примерно в 100 и более раз) роста и размножения клеток животных и растений в сравнении с микробными клетками трофофаза и йдиофаза у них значительно растянуты во времени. Тем не менее всегда следует стремиться к сокращению временных интервалов трофофазы, поскольку это поможет сократить срок проведения всего биотехнологического процесса и удешевить конечный продукт.

При выращивании клеток в культурах следует иметь в виду их следующие особенности:

1. дифференцированность, 2. склонность к аггломерации, 3. изменение размеров и цитоархитектоники в процессе развития, 4. дизруптивность, 5. способность к трансформации.

Клетки многоклеточных растений и животных, в противопо- ложность одноклеточным видам, по мере роста и развития орга- низма становятся все более специализированными, возникают ткани с конкретными функциями (дифференциация). В диффе- ренцированных клетках специализация функций обусловливается генетической детерминированностью, проявляющейся в феноти- пах. Иными словами — дифференциация является результатом различной экспрессии генетической информации в разных клет- ках.

С другой стороны с дифференциацией связаны биосинтез и накопление вторичных метаболитов. В качестве примеров можно назвать образование и отложение лигнина в сосудистых элементах ксилемы и трахеидах растений, биосинтез андрогенных гормонов в клетках половых желез у мужских особей животных, и т. д.

Торможение или подавление дифференцировки может сопро- вождаться существенным изменением в характере реакций вто- ричного обмена. Например установлено, что каллусы дифферен- цирующихся корней растения красавки (Аггора ЬеИайоппа) синте- зируют так называемые тропановые алкалоиды (атропин; скопо- ламин; гиосциамин — аналог атропина, содеращий Ь-троповую

сн,-сн-сн₂^ у сн-сн^

| 1^-СВ, СНО-СО-СН о ^_сн_з сно-со-сн

сн,-сн-сн₂ сн,он ^Чс'н-сн/ сир

атропин скополамин

кислоту):

Те же, но не дифференцированные культуры, не синтезируют названные алкалоиды.

В других случаях не дифференцированные культуры тканей способны синтезировать вторичные метаболиты, но в меньших количествах, чем дифференцированные аналоги их (например, алкалоид никотин, образуемый Мсоиапа ъаЪасит).

Применительно к бактериальным культурам можно назвать Вас. 1липпд1еп515, формирующей при дифференциации — фаза спорообразования белковый ромбовидный параспоральньй кри- сталл, обладающий токсическим действием "преимущественно в отношении насекомых из отряда чешуекрылых, и поэтому исполь- зующийся в борьбе с вредителями, например, лесного хозяйства.

В отличие от бактерий грибы более дифференцированные организмы, и у них также отмечена зависимость синтеза ряда вторичных метаболитов от степени дифференцировки. Например, биосинтез пигментов у большинства дейтеромицетов приурочен к началу конидиеобразования или, у некоторых видов (АигеоЪазШшт риИШапз), он связан по времени с формированием хламидоспор.

Казалось бы, что приведенные примеры могут служить дока- зательством существования общей закономерности, относящейся

1-1/

к прямо пропорциональной зависимости синтезируемого вторич- ного метаболита от уровня дифференцировки клеток, то есть, чем выше дифференцировка, тем больше образуется метаболита. Во многих случаях зто так и есть. Однако, что касается растений, то имеются многочисленные данные о высокой активности дедиффе- ренцированных культур, например раувольфии змеевидной (КаишоШа зегрепиа), синтезирующих индольные алкалоиды. Оче- видно, тотипотентность клеток растений является одним из важ- нейших задатков способности их синтезировать вторичные мета- болиты при подборе адекватных условий культивирования и сти- мулирования, то есть воздействуя на триггерные (от англ. глддег — спусковой крючок) или эффекторные механизмы метаболиче- ских путей вторичного обмена.

Растительные и животные клетки примерно в 10 - 100 раз больше по размерам, чем клетки бактерий и грибов, диаметр многих из них варьирует в пределах 20 - 150 мкм. Однако только животные клетки и прокариотические микоплазмы лишены ригид- ной клеточной стенки. Тем не менее прокариотические и эукари- отические клетки в процессе роста и развития стремятся к орга- низационной завершенности (бактериальные — в пределах минут- часов, грибные — в пределах часов-суток, растительные и живо- тные — в пределах нескольких суток).

В случаях поддержания многоклеточных популяций в гистоло- гически организованной форме, соответствующей исходным тка- ням, и при сохранении специализированных для этих тканей функций, говорят о культурах тканей. При диссоциации тканей на клетки с утратой ими гистологической организации и специа- лизированных функций при выращивании т лагго говорят о куль- турах клеток. Разъединение клеток стимулирует их рост.

При выращивании животных клеток в культуре в целях пол- учения специальных продуктов необходимо принимать во внима- ние и учитывать их генетическую нестабильность и, как следствие, вариабельность фенотипической экспрессии с последующими ста- рением и отмиранием. Всего этого удается избегать при использо- вании гибридомных клеток.

Если старение и гибель клетки были бы предопределены гене- тически, то это значило бы, что позитивная дифференциация является логическим следствием роста и развития клетки, достиг- шей высшей стадии специализации, и она завершается смертью. Согласно все более подтверждающейся на практике клонально-се- лекционной (стохастической, от греч. 51оспа51Асо5 — случайный, вероятностный) теории смерть клетки происходит вследствие по-

148

степенного накопления трансляционных ошибок в работе генома под влиянием инфекций, радиационного облучения и других му- тагенных воздействий, то есть когда наступат критическое возра- стание энтропии.

Кроме дифференциации клеток важной особенностью их яв- ляется склонность к аггломерации (от лат. адд1отегаШ5 — скоп- ление). Это может происходить в различных условиях и с клетками различного уровня организации — прокариотами и эукариотами. Те из них, которые имеют клеточную стенку, чаще аггломерируют за счет химических компонентов, локализованных в ней. Причем процесс "скучивания" является физико-химическим (адсорбция, ионное и ковалентное взаимодействия), зависящим не только от особенностей клеток, но и от компонентов среды, используемой для их культивирования. Поэтому аггломерация может быть след- ствием: 1. адгезии (от лат. айпаезю — склеивание, слипание) клеток друг к другу или к поверхности культурального сосуда за счет веществ — адгезинов, расположенных на их поверхности, и других причин; 2. агглютинации по схеме "антиген-антитело", когда в качестве антигена оказываются культивируемые клетки, а в каче- стве антитела — гомологичные или гетерологичные агглютиниру- ющие иммунные сыворотки; 3. слияния клеток с образованием гибридов.

Известные к настоящему времени адгезины, например, в клет- ках дрожжей и ряде растений представляют собой преимущест- венно гликопротеины. В поверхостных структурах гриба Н151ор1а5та сар5и1аШт за адгезию к эпителиальным клеткам от- ветственны галактоза, манноза и фукоза (в меньшей степени — глюкоза), но не Ы-ацетилглюкозамин.

На поверхности ростковых трубок СапсИйа аМсапз располага- ются антигенные эпитопы, или детерминанты (от греч. ер1 — на, поверх, к; 1ороз — место; от лат. йе1е]тшпаио — определение) с ММ 60-230 кДа, проявляющие адгезию к фибриногену. Такие эпитопы называют еще фибриногеносвязывающими факторами. На каждой ростковой трубке располагается до 4000 мест фиксации фибриногена. На поверхности дрожжевых псевдомицелиальных клеток того же вида располагается маннопротеин (ММ 60 кДа), белковая часть которого может связываться с производным СЗ- фракции комплемента (гСЗЪ), проявляя свойства адгезина.

У бактерий и некоторых грибов функцию адгезинов выполняют белки фимбрий. Вместе с тем у грамотрицательных бактерий могут образовываться так называемые локальные зоны адгезии между клеточной мембраной и клеточной стенкой, лишенной пептидог- ликанового слоя. В этих зонах два фосфолипидных слоя входят в

149

Рис. 50. Схема образования локальной зоны адгезии в оболочке грамотрицательных бактерий (в направлении а - в): 1 — мембранный фосфолипид, 2 — периплазмати- ческое пространство, 3 — пептидогликан, 4 — фосфолипидный слой, 5 — белок, 6 — углевод.

Клетки животных, находясь в системах органов и тканей, взаимодействуют между собой за счет ионов, десмосом, электо- ронноплотных гликопротеинов.

Следует иметь в виду, что клетки прокариот и эукариот имеют отрицательный заряд и поэтому ионные взаимодействия, сущест- вующие между ними, присущи так же клеткам и субстратам, несущим электрический заряд. Если этот заряд отрицательный (как и заряд клетки), то в среде должны быть двухвалентные катионы и адгезии, например, фибронектин клеточного или плазматическо- го происхождения. Фибронектин — гликопротеин с ММ 200-250 кДа. Он найден на поверхности глиальных клеток и фибробластов, в плазме, амниотической и спинно-мозговой жидкостях.

Реакция агглютинации клеток специфическими антителами (иммуноглобулинами — 1д) с давних пор используется в иммуно- логии. Антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами, локализующимися на клеточной поверхности. При этом отмечает- ся аггломерация клеток, где связующими звеньями выступают 1д. Вследствие различной антигенной структуры микробов в их агг- лютинации принимают участие антитела различной специфично- сти.

Прилипание прокариот к поверхности В-лимфомицитов про- исходит, например тогда, когда животное, от которого взяты лимфоциты, было предварительно иммунизировано этими же бак- териями. Это так называемый феномен иммуноклеточного при- липания. Вариантом его является непрямая гемадсорбция, когда вместо клеток прокариот используют, например, гаптены, которые сорбируются на эритроцитах т \а!го. Такие эритроциты формиру- ют розетки вокруг лимфоидных клеток животного, ранее иммуни- зированного микроорганизмом, из которого выделен гаптен.

Что касается спонтанного слияния клеток прокариот или эука- риот, то такие процессы происходят редко и преимущественно между макрофагами или миобластами (от лат. туо — мышечный, ЫазШз —зародышевая материнская-клетка) с образованием мно-— гоядерных клеток — синтиций (от лат. вупсугшт — многоядерная протоплазматическая масса).

Частоту слияния можно существенно повысить, направленно используя для этого полиэтиленгликоль, лизолецитин, ДНК-содер- жащие вирусы герпеса или РНК-содержащие вирусы Сендай.

НО—(СН2СН2—0)п-Н Лизолецитин — это продукт, образую- полиэтиленгликоль Щ^{ийся из} лецитина под действием леци- тиназы. В случае образования гетерока- рионов и последующей пролиферации гибридной клеточной линии (увеличение числа клеток), то хромосомы будут частично теряться, в то время как оставшиеся хромосомы будут определять один или комбинацию других признаков. Это важно для экспрессии генов (в том числе — генов злокачественности). О гибридизации клеток см. также 5.2.1.

В процессе роста и развития клеток происходят изменения в размерах и архитектонике структурных компонентов клеток. Для прокариот такие изменения трудно уловимы при их быстром размножении простым делением. В случае спорообразования такие изменения можно уловить с большей определенностью. Используя цейтраферную киносъемку удается четко зафиксировать проис- ходящие события, например, через интервалы времени, равные нескольким секундам. Грибные, растительные и животные клетки в этом смысле оказываются более удобными объектами для наблю- дения. Можно проследить их рост по размерам, равно как и формирование дифференциальных структур в течение часов и суток.

Животные клетки образуют псевдоподии (ложноножки), с помощью которых передвигаются по субстрату. Псевдоподии об- ладают адгезинами. При образовании или наличии второй клетки, с которой контактирует первая, их псевдоподии осуществляют движения в противоположном направлении — наступает контак- тное ингибирование. Развиваясь в виде монослоя, клетки полно- стью перестают двигаться и приостанавливают свой рост. Плот- ность клеток может возрасти и за счет многослойности их в культуре. Одиночная оплодотворенная яйцеклетка служит источ- ником всех 10¹⁴ клеток в организме взрослого человека и некоторая часть из них делится (всего по расчетам, происходит 20⁶ делений в секунду). Здесь исключительно важна роль ЦНС, гормонов и других регулирующих факторов.

151

Дизруптивность (от лат. сИзгирИо — разрыв) клеток прокариот и эукариот — еще одна их особенность. Причем нельзя провести четкой границы между представителями этих надцарств по диз- руптивности. Понятно, что клетки, имеющие клеточную стенку, значительно устойчивее клеток, не обладающих ею (для сравнения можно назвать микоплазмы, протопласты и сферопласты, клетки Е. соН, конидии АзрегдШиз гйдег, меристемные клетки картофеля

— 5о1апит ШЬегозит, Т-лимфоциты человека). Даже при разру- шении в дезинтеграторах различного типа бактериальные клетки несколько менее устойчивы на разрыв, чем грибные.

Клетки животных без клеточных стенок относятся к разряду высоко дизруптивных, тогда как большинство микробных клеток

— к разряду низко дизруптивных. Этот показатель имеет особое значение для организации соответствующих производств, в кото- рых предусматриваются перемешивание и барботаж культураль- ной жидкости, а также при реализации конечного продукта в виде клеток, когда, например, они должны быть разрушены и примене- ны в качестве белковых добавок к кормам для животных. Без дизрупции клетки пройдут через пищеварительный тракт, остава- ясь мало измененными. В этой связи перспективны способы ферментативного гидролиза клеточных стенок. Причем лизис кле- ток может происходить двояко — за счет собственных ферментов (автолиз) и под воздействием внешних ферментов (гликозидаз, гликозаминидаз, амидаз, пептидаз) — экзолиз. Глубина лизиса клеток зависит от ряда превходящих факторов: химического со- става и архитектоники клеточных стенок, температуры и состава окружающей среды, возраста клеток и других. При полном осво- бождении от стенки клеточного содержимого, окруженного мем- браной, образуются протопласты; при частичном — сферопласты. Без стабилизаторов в среде время существования тех и других весьма ограничено.

В нашей стране и за рубежом ферментная промышленность производит отдельные литические ферменты для продажи. К числу их относятся дрожжелитин, лизосубтилин, лизоцим, проназа и другие.

Солюбилизирующим действием на клетки обладают некоторые органические соединения (мочевина и ее производные, толуол, бутанол, диметилформамид, поверхностно-активные вещества и другие).

В ряде случаев важна синхронизация клеток, когда большин- ство из них находятся в одинаковом фазовом состоянии. Этому соответствует экспоненциальная фаза размножения одноклеточ- ных видов. Синхронизации микроорганизмов добиваются следу-

152

ющими методами: сменой температурных режимов выращивания, голоданием с последующим переносом на полные среды, фильтра- цией клеток одинаковых размеров. В синхронизированном состо- янии они сохраняются в течение 2-4 генераций, после чего пере- ходят к асинхронному росту, развитию и размножению.

В случаях синхронизации клеток млекопитающих применяют сепарацию и индукцию. В первом случае проводят дифференци- альное центрифугирование в градиентах бычьего сывороточного альбумина, сахарозы или фиколла (синтетический высокомолеку- лярный сополимер сахарозы и эпихлоргидрина.

При этом отделяются, в основном, клетки С1_сн СН—СН

одинакового возраста и объема, перешедшие ² \ / ²

из фазы митоза в фазу С-2 (см. раздел 5.1.), эшилоргадрин О когда их объем возрастает примерно вдвое. Синхронизированные клетки составляютт 65-70%. Во втором случае (при индукции) блокируют клетки в определенной фазе жизненного цикла с помощью ингибиторов синтеза ДНК (аметоптерина, 5-аминоура- цилла, гидроксимочевины) или ингибиторов митоза (винобластин — см. раздел 4.3, колхицин и его производные).

5-^СН₂ — N -< >- ссч^нчсн^-соон N || " ' СООН

аметоптерин (метотрексат; 4-амино-Н*-метилфолмевая кислота)

М НСОСН,

™Н₂ Н₃СО, л*^/—^ '

СО

№ЮН 11₃СО

гидрокси- 5-амииоурацил _мочевииа

Клетки затем промывают для освобождения от ингибиторов (блокаторов) и дают им синхронно развиваться, учитывая тот факт, что после одной-двух генераций они становятся асинхронными. При индукции достигают меньшей синхронизации клеток (2-50%), чем при сепарации, однако данный показатель можно повысить при осуществлении повторных блокировок.

Степень синхронизации определяется митотическим индексом (М1), то есть индексом частоты митозов на 1000 клеток (оценивают в окрашенных препаратах): М1 = 1000:МС, где МС — число клеток с признаками митоза. Зависимость здесь обратно пропорциональ- ная — чем меньше М1, тем синхронизация больше.

Для некоторых представителей эукариот (не прокариот) изве- стны фазовые состояния, сопровождающиеся изменением росто- вых характеристик — трансформация. Так, отдельные грибы являются диморфными, то есть фенотипически двойственными, растущими либо в мицелиальной форме, либо в дрожжевой (АигеоЬазШшт зрр., Н151ор1а5та зрр., СапоМа врр., Мисог врр. и др.). Так, например, А риНшапз — продуцент экзогликана в глубинных условиях растет в виде одноклеточных, почкующихся дрожжевых клеток, тогда как на поверхности агаризованных питательных сред дрожжевые клетки трансформируются в мице- лиальные, мало или совсем не образующие экзогликана. Подобная морфо-физиологическая трансформация является обратимой. В этой связи выделяют три главные группы диморфных грибов — температурозависимые (В1а51отусе5 йегтаШкиз), зависимые от температуры и от питательных веществ (№51ор1а5та сарзгЛаШт), и зависимые только от питательных веществ (СапсИйа аНйсапз).

У животных клеток трансформация — процесс необратимый. Он может протекать под влиянием онкогенных РНК- или ДНК-ви- русов и называется вирусной трансформацией. К РНК-онкоген- ным вирусам относятся лейковирусы кошек, мышей и птиц, вирус опухоли Биттнера, поражающий млекопитающих, вирусы сарко- мы; к ДНК-онкогенным вирусам относятся: аденовирусы, вирусы папилломы, полиомы и 5У-40 (от лат. 5шиап \аш8 — вирус обезьян) из группы папова-вирусы, герпес-вирусы и вирусы оспы. Следует иметь в виду и тот факт, что ДНК нормальных клеток могут содержать в себе провирусный материал и поэтому такие клетки способны к необратимой трансформации под влиянием физиче- ских и химических мутагенов. Провирусные сегменты ДНК назы- вают онкогенами.

В условиях, ограничивающих рост нормальных клеток, транс- формированные клетки как менее требовательные к факторам роста, пролиферируют до более высокой плотности и они стано- вятся способными культивироваться в глубинных условиях (сус- пензионные культуры) при изменении своей формы до сфериче- ской. Следовательно, и у грибных, и у животных, а также у ряда растительных клеток их морфологическое сходство (сферичность, округлость) в глубинных условиях выращивания находится под контролем генотипа и сопровождается изменением преимущест- венно клеточной мембраны.

Трансформированные т лагхо клетки представляют собой по- тенциально важные объекты для выбора оригинальных продуцен- тов ценных веществ.