Часть I

Биотехнология — как научная дисциплина

Глава 1

ПРЕДМЕТ, ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ, ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Биотехнология — это наука об использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве. Название ее происходит от греческих слов Ъюа — жизнь, 1екеп — искусство, 1одой — слово, учение, наука. К числу биологических процессов

п

относят те из них, в которых применяют биологические объекты различной природы (микробной, растительной или животной), например, производство ряда продуктов медицинского, пищевого и другого назначения — антибиотики, вакцины, ферменты, кор- мовой и пищевой белки, полисахариды, гормоны, гликозиды, ами- нокислоты, алкалоиды, биогаз, удобрения и пр.

В соответствии с определением Европейской Федерации Био- технологов (ЕФБ, 1984) биотехнология базируется на интегральном использовании биохимии, микробиологии и инженерных наук в целях промышленной реализации способностей микроорганизмов, культур клеток тканей и их частей. Уже в самом определении предмета отражено его местоположение как пограничного, благо- даря чему результаты фундаментальных исследований в области биологических, химических и технических дисциплин приобрета- ют выраженно прикладное значение. Биотехнология непосредст- венно связана с общей биологией, микробиологией, ботаникой, зоологией, анатомией и физиологией, биологической, органиче- ской, физической и коллоидной химией, иммунологией, биоинже- нерией, электроникой, технологией лекарств, генетикой и другими научными дисциплинами.

Человек, рождающийся для познания мира (в том числе — и самого себя), давным-давно освоил на практике различные процес- сы биотехнологии, не зная по существу, что они относились к такому разряду. В самом деле, с библейских времен известно виноделие, тысячелетия насчитывает хлебопечение и т. д.

Познавательная деятельность людей непосредственно сказыва- лась на уровне социального развития общества. Недаром вторую половину XX столетия мы называем периодом научно-технической революции. Наука сегодня имеет огромное значение в жизни людей, и научный подход к решению любой задачи — веление и требование времени.

Наука формировалась и эволюционировала по мере формиро- вания и развития человеческого общества. Это, в частности, не- посредственно относится и к биотехнологии. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехниче- ский. Эмпирический (от греч. етрешков — опытный) или доисто- рический период — самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет — до нашей эры и около 2000 лет — нашей эры. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и

12

некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к раз- ряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяй- ства) стал побудительным мотивом революции в изготовлении продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад и привела к изобретению техники земледелия — началу произво- дительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века.) Стали формироваться так называемые приречные цивилизации Месопо- тамии, Египта, Индии и Китая. Шумеры — первые жители Месо- потамии (на территории современного Ирака) создали цветущую в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством готовить пиво. В этом следовали им ассирийцы и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издрев- ле приготавливавшийся в домашних условиях, хотя о микробах — индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам Пастера, и это несмотря на существование с XIV в. так называемого "Орлеанского способа" приготовления уксуса; первая дистилляция вина осуществлена в XII в.; водку из хлебных злаков получили в XVI в.; шампанское известно с XVIII в., но получение почти абсолютного этанола впервые удалось в XIV в. испанцу Раймунду Луллию (ок. 1235 — 1315) благодаря перегонке вина с негашеной известью.

В те древние времена продукты питания растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии (8 — 7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая более 30 ООО клинописных табличек, из которых в 33 имелись сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом городе размещался сад лекарственных растений.

тому же эмпирическому периоду относятся: получение кис- ломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.

Длительное накопление фактов происходило и в области ми- кологии (от греч. тукев — гриб). Сведения о грибах можно найти в писаных источниках древности, а Луций Лициний Лукулл (106 — 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами("лу- куллов пир"), предпочитал всем съедобным грибам кесарев гриб (Аглаппа севагеа, Ь). Древние евреи хорошо знали ржавчину хлебных злаков и головню. В IV — I веках до н. э. были собраны интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах Аристотеля, Диоскорида, Плиния Младшего, Теофраста. В после-

13

дующие века нашей эры микология стала самостоятельной наукой

— велика роль в этом Д. Персоона и Э. М. Фриза, по праву считающихся отцами систематической микологии.

Таким образом, народы исстари пользовались на практике микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных.

Второй, этиологический (от греч. аШа — причина) период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и первую треть XX века (1856 — 1933 гг.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822

— 1895) — основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической, санитарной). С аналитической микробиологией не- посредственно связано открытие Пастером молекулярной ассимет- рии (стереоизомерии). Это, по существу, бриллиантовый век мик- робиологии. Пастер вскрыл микробную природу брожений, дока- зал возможность жизни в бескислородных условиях, эксперимен- тально опроверг ходячее тогда представление о самопроизвольном зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопро- филактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации, называемый по его имени пастеризацией и т. д.

Немеркнущая слава Пастера не затмила имен его выдающихся учеников и сотрудников: Э. Дюкло, Э. Ру, Ш. Э. Шамберлана, Ж. А. Вильемена, И. И. Мечникова. В этот же период творили Р. Кох, Д. Листер, Ш. Китазато, Г. Т. Риккетс, Д. И. Ивановский, А. Лаверан и другие.

Параллельно с Пастером трудился в Германии, а позднее — во Франции, выдающийся миколог А, де Бари (1831 — 1888) — основоположник физиологической микологии. Изучив стадии раз- множения и историю индивидуального развития грибов (онтоге- нетический метод), с учетом их взаимоотношений с другими видами, а также цитологических и биологических особенностей, де Бари создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе современных классификационных схем микро- и макромицетов.

Де Бари — основоположник микофитопатологии — науки о грибных болезнях растений (от греч. Шоп — растение, раШоз — болезнь), под его руководством сформироваласьплеяда выдающих- ся ученых (в том числе — из России): Ф. М Бальфур, И. В. Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М. С. Воронин, А. Кох, А. С. Фаминицин и др.

В биотехнологии важными являются питательные среды для культивирования ряда биообъектов. Уже А Пастер приготовил первую жидкую питательную среду в 1859 году, метод выращива- ния грибов на желатине предложил О. Брефельд в 1864 г., Ж. Ролен сообщил о жидких средах для выращивания нитчатых грибов в 1870 г., Р. Коху в 1876 г. удалось вырастить бациллы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох предложил метод культи- вирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и затем

— на агаризованных питательных средах.

В настоящее время, предлагая самые сложные и необычные в каком-либо отношении среды для выращивания биообъектов, мы опираемся на основополагающие результаты этих выдающихся ученых. Аналогичным образом можно сказать и о вариантах способов стерилизации питательных сред, имея в виду тиндализа- цию, кипячение, дробную стерилизацию и др. Все они основыва- лись на необходимости уничтожения посторонней микрофлоры, которая попадала в среды в процессе их изготовления.

В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в 1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д. И. Ивановским (1864

— 1920). Последовавшие за этим обнаружения других вирусов обеспечили становление новой научной дисциплины — вирусоло- гии: Ф. Леффлер и П. Фрош в 1898 г. открыли вирус ящура, Д. Кэррол в 1901 г. — вирус желтой лихорадки, Ф. Туорт в 1915 г. и Ф. д'Эрелльв 1917 г. — вирусы бактерий (бактериофаги). Большой вклад в вирусологию был внесен отечественными и зарубежными учеными — Л. А. Зильбером, А. А. Смородинцевьгм, М. П. Чума- ковым, А. Борелем, К. Левадити, К. Ландштейнером, В. Стэнли, П. Лейдлоу, П. Руа, П. Ф. Эндерсом и многими другими.

Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответствующих процес- сов (бродильных, окислительных и др.). Например, маслянокислые бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобак- терии и молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этано- ла до уксусной кислоты и т. д. В этот период было начато изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также некото- рых продуктов обмена (метаболизма) — ацетона, бутанола, лимон- ной и молочной кислот; во Франции приступили к созданию

15

биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.

Знание причин биологических процессов еще не исключало нестерильные операции, хотя и стремились к использованию чистых культур микроорганизмов.

Для всестороннего изучения морфолого-физиологических свойств и продуктов обмена, прежде всего, микробов все ранее предложенные способы их выращивания оказались малопригод- ными. Более того, накопление однородной по возрасту большой массы клеток оставалось исключительно трудоемким процессом. Вот почему требовался принципиально иной подход для решения многих задач в области биотехнологии. В 1933 году А. Клюйвер и Л. X. Ц. Перкин опубликовали работу "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. С этого времени начинается третий период в развитии биологи- ческой технологии — биотехнический. Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудо- вания, обеспечившего проведение процессов в стерильных усло- виях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного био- технологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939 — 1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфициро- ванными ранами). Все прогрессивное в области биологических и технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в биотехнологии. Следует отметить, что уже в 1869 г.. Ф. Мишер получил "нуклеин" (ДНК) из гнойных телец (лейкоци- тов); В. Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию ферментов; Т. Леб в 1897 г. установил способность к выживанию вне организма (в пробирках с плазмой или сывороткой крови) клеток крови и соединительной ткани; Г. Хаберланд в 1902 г. показал возможность культивирования клеток различных тканей растений в простых питательных растворах; Ц. Нейберг В 1912 г. раскрыл механизм процессов брожения; А. Михаэлис и М. Л. Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных реакций, а А. Каррел усовершенствовал способ выращивания клеток тканей животных и человека и впервые применил экстракт эмбрионов для ускорения их роста; Г. А. Надсон и Г. С. Филлипов в 1925 г. доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на дрожжи, а в 1937 г. Г. Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот (НТК); в 1960

16

г. Ж. Барски и др. впервые обнаружили соматические тбриды опухолевых клеток мыши. Следовательно, накопленные научные факты стали побудительным мотивом для разработки способов крупномасштабного культивирования клеток различного проис- хождения. Это необходимо было для получения различных клеточ- ных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда ами- нокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция) разработал теоретические основы непрерывного управляемого культивирования микробов; в 50-е годы вопросам практической реализации непрерывного культивирования микроорганизмов по- святили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек, Н. Д. Иеру- салимский и др.

Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том числе главного из них — биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее время.

Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от

греч. депеыз — происхождение, возникновение, рождение) начал- ся с 1972 г. В этом году П. Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с коллегами выделил в химически чистом виде лактозный ген из кишечной палочки, показав тем самым возможность направленных манипуляций с генетическим материалом бактерий.

Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозмож- ным достигнуть современных результатов в области биотехноло- гии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привело к фор- мированию строго научного подхода к разработке биотехнологи- ческих процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть генотехнического периода.

Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусст- венно встроенную генетическую информацию об этом гормоне. На таком же уровне или с близким к тому заделом находятся следующие генно-инженерные препараты: интерфероны, фактор некротизации опухоли (ТИР), интерлейкин-2, соматотропный гор- мон человека и аналог его соматомоднн Ц и другие^ "~

Зная строение аппарата наследственности у разных организ- мов, удается манипулировать не только нуклеиновыми кислотами, но и целыми хромосомами (хромосомная инженерия) и клетками (клеточная инженерия).

Для генотехнического периода характерны: разработка интен- сивных процессов (вместо экстенсивных) на основе направленных фундаментальных исследований (с продуцентами антибиотиков, ферментов, аминокислот, витаминов), получение супер продуцен- тов; создание продуцентов, несущих в себе бессмысленную гене- тическую информацию (например, гены интерферона человека в клетках Рвеийотопаз аегиддпоза); создание необычных организ- мов, ранее не существовавших в природе (неклубеньковых расте- ний, несущих гены азотобактерий, ответственные за способность фиксировать молекулярный азот из воздуха); разработка и внед- рение экологически чистых и, по возможности, безотходных тех- нологий; разработка и внедрение в практику специальной аппара- туры блочного (сменного) типа для различных биотехнологических схем; автоматизация и компьютеризация биотехнологических про- цессов; создание экономически оптимальных производственных процессов при максимальном использовании сырья и минималь- ном потреблении энергии. Вот почему инженер — биотехнолог в современном понимании должен быть широко и глубоко подготов- ленным специалистом, в распоряжении которого оказываются сложнейшие биологические системы (или аналоги их), синхронно работающие в заданном направлении. В любом биотехнологиче- ском процессе наиважнейшим звеном является биообъект, "кап- ризы" которого по любому поводу могут пагубно сказаться на результатах этого процесса.

В течение последних 10 — 15 лет текущего столетия происхо- дило бурное развитие биотехнологии, определились сферы при- оритетного внедрения конкретных результатов биотехнологиче- ских разработок, и, как следствие, появились такие названия, как медицинская биотехнология, иммунобиотехнология (от лат. 1ттипи5 — невосприимчивый), биогеотехнология (от греч. део — земля), инженерная энзимология (от греч. еп — в, гуте — заква- ска) . Одни из них прочно входят в лексикон специалистов, напри- мер, иммунобиотехнология, инженерная энзимология, другие на- звания приживаются плохо или с трудом (медицинская биотехно- логия, биогеотехнология). К медицинской биотехнологии относили те производственные процессы, которые завершались созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицин- ского назначения (прежде всего профилактического или лечебного

18

действия на организм человека). Это — антибиотики, некоторые витамины, коферменты и ферменты, отдельные микробные пол- исахариды — как самостоятельные препараты или вспомогатель- ные вещества при создании различных лекарственных форм, аминокислоты, нуклеозиды и др.

Иммунобиотехнология объединяет производства вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуно- медиаторов, моноклональных антител и некоторых других. Можно заметить, что на основе иммунобиотехнологических процессов создаются также профилактические и лечебные средства, объеди- няемые под эгидой медицинской биотехнологии. Следовательно иммунобиотехнология представляется здесь частным случаем ме- дицинской биотехнологии. Вместе с тем, иммунобиотехнологиче- ские процессы по целевым продуктам вышли за пределы медицин- ского назначения (например, в иммуноферментном анализе, им- муноблотинге). В равной мере большинство ферментов (как и аминокислот или некоторых других продуктов) производится не для целей здравоохранения. Поэтому термин "Медицинская био- технология" представляется во многом искусственным и, очевидно, отсюда плохо приживающимся. Напротив, вычленение иммуноби- отехнологии в качестве самостоятельной научной субдисциплины является обоснованным, и производственные процессы здесь четко ограничены использованием иммунной системы того или иного макроорганизма или отдельных компонентов ее (макрофаги, лим- фоциты, различные иммуноглобулины).

Биогеотехнология — это субдисциплина, ранее называвшаяся геологической микробиологией. Сущность ее сво- дится к использованию микроорганизмов для добычи полезных ископаемых, например, цветных металлов, нефти; для окисления метана в угольных шахтах и пр. Спектр биогеотехнологических производственных процессов невелик, но очень важен для жизне- обеспечения народного хозяйства. Необходимо подчеркнуть, что не все процессы, относимые ныне к биогеотехнологическим, яв- ляются сугубо технологическими (например, окисление метана с помощью специальных микроорганизмов). Обычно принято счи- тать, что в результате биотехнологического процесса образуется какой-то целевой продукт, используемый на практике. В приведен- ном примере окисления метана преследуется иная цель — сниже- ние концентрации метана до безопасного (например, для шахте- ров) уровня. Хотя и в этой реакции образуются конечные продук- ты, которые могут быть использованы на практике: СШ + 0₂—* С0₂ + 2Н₂

19

Инженерная энзимология — это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе живых клеток для получения соответст- вующих целевых продуктов. Биообъект здесь — фермент (или комплекс ферментов). На практике обычно используют иммоби- лизованные ферменты (реже — иммобилизованные клетки), бла- годаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная -активность. Иногда инженерную энзимологию отождествляют с биотехнологией. В этом содержится большая доля истины, так как все реакции в клетках катализируются ферментами. Однако слово "инженерная" привносит свою специфику, заключающуюся в акценте на создание конструкции (от франц. епдш — машина), в данном случае — на конструирование биокатализаторов с задан- ными свойствами с последующим использованием в биотехноло- гическом процессе.

В научной литературе можно встретить и другие названия биотехнологических процессов, например, "Биотехнология живо- тной клетки", "Экономическая микробиология", "Ферментация и биоинженерия", "Промышленная микробиология", "Сельскохозяй- ственная биотехнология", "Биохимическая инженерия" и др. Более того, в принципе можно говорить и писать о биотехнологии каждого индивидуального продукта, образуемого каким-либо мик- робом, какими-либо клетками растений и животных, или появля- ющегося под каталитическим воздействием фермента; в равной мере речь может идти и о биотехнологии продуцентов каких-либо веществ, например, о Рапах дтхепд (жень-шень), о КагглгоШа зегрепипа (Раувольфия змеевидная), об Асипотусек врр. (актино- мицеты) и т. д. Поэтому наиболее рациональным является лодраз- деление биотехнологии на микробную биотехнологию, раститель- ную, или фитобиотехнологию, и животную, или зообиотехноло- гию, включающую также и биотехнологические процессы, осно- ванные на использовании клеток человека.

Из приведенной схемы видно, что наибольшее число реализо- ванных процессов имеет место в микробной биотехнологии. Мно- гие микроорганизмы обладают заметным преимуществом перед растительными и животными объектами по таким показателям, как скорость размножения, лабильность и быстрота адаптации к изменяющимся условиям среды обитания. Этим и определяется диапазон применения микробов в различных отраслях производ- ственной деятельности человека, то есть все то, что составляет

20

Биотехнология

микробиотехнология

фитобиотехнология

зообиотехнологии

использование

в легкой

промышленности, в пищевой

промышленности, в медицинской в агропромышленном

комплексе,

в медицинской и

косметической

промышленности

в животноводстве, в медицинской

промышленности, в пищевой

промышленности

промышленности,

в химической

промышленности,

в металлургии,

в нефтедобывающей

промышленности,

в водном хозяйстве,

в защите окружающей

среды,

в энергетике, в косметической

промышленности

предмет "Промышленная микробиология". Это можно представить в следующем виде (таблица 1).

Какие же основные цели и задачи стоят перед биотехнологами? Во-первых, поддержание и активация путей обмена клеток, веду- щих к накоплению целевых продуктов при заметном подавлении других реакций обмена у культивируемого организма; во-вторых, получение клеток или их составных частей (преимущественно — ферментов) для направленного изменения сложных молекул (на- пример, рестриктазы, изомеразы и т. д.); в-третьих, углубление и совершенствование рДНК-биотехнологии и клеточной инженерии на предмет получения особо ценных результатов в фундаменталь- ных и прикладных разработках; в-четвертых, создание безотход- ных и экологически безопасных биотехнологических процессов; в-пятых, совершенствование и оптимизация аппаратурного офор- мления биотехнологических процессов с целью достижения мак- симальных выходов конечных продуктов при культивировании естественных видов с измененной наследственностью методами клеточной и генной инженерии; в-шестых, повышение технико- экономических показателей биотехнологических процессов по сравнению с существующими.

Характеристика процесса

Биосинтез

Трансформация