2. Фиксация мазка

Существует несколько методов фиксации мазка. Наиболее простой - фиксация над пламенем горелки.

Берут стекло с мазком в горизонтальном положении и три-четыре раза проводят его через желтую часть пламени горелки. Очень важно не перегреть стекло. Простейший способ проверки правильности нагрева - после каждого проведения через пламя слегка коснуться стеклом руки. Если неприятного ощущения нет, то все правильно. При фиксации бактериальные клетки гибнут в результате коагуляции цитоплазмы, кроме того, они прилипают к стеклу.

Другим распространенным методом фиксации является обработка препарата 96%-м спиртом или другими веществами.

3. Окрашивание препарата

При окрашивании мазка препарат следует поместить на предметодержатель над кристаллизатором и далее:

1. Залить фиксированный мазок раствором генцианвиолета на 1 минуту.

2. Слить краситель в кристаллизатор и, не промывая водой нанести на него раствор Люголя на 1 минуту (до полного почернения мазка).

3. Слить раствор Люголя и, не промывая водой залить препарат 96%-м спиртом и обрабатывать, непрерывно покачивая препарат в течение 15-20 с. Это время очень существенно, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и Гр (+) бактерии. При недостаточном времени обработки спиртом препарат оказывается перекрашенным.

4. Промыть препарат водой из промывалки (немедленно)!

5. Залить препарат раствором фуксина Пфейфера на 1 минуту.

6. Промыть препарат водой, просушить фильтровальной бумагой, а затем на воздухе и микроскопировать сначала на малом, а затем на большом увеличении.

После описанной обработки Гр (+) микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Гр (-) получают только цвет дополнительной окраски (фуксина).

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств.М.: Легкая пищевая промышленность, 1984.208 с.

2. Теппер Е.З., Шильникова В.К. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1979. 216 с.

Лабораторная работа № 6

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

КАК ОБЪЕКТА БИОТЕХНОЛОГИИ.

НАБЛЮДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ МОЛОЧНОГО БРОЖЕНИЯ.

Цель работы: освоить технику приготовления мазка культуры молочнокислых бактерий - представителей агентов пищевой биотехнологии и ознакомиться с их морфологическими и биохимическими признаками.

1. Краткая характеристика молочнокислых бактерий

Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения овощей, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр. Кислый вкус черного хлеба определяется также молочной кислотой. Данные процессы вызывает группа молочнокислых бактерий, которая очень разнообразна и широко распространена в природе.

Молочнокислые бактерии обитают на поверхности растений, в молоке, на пищевых продуктах, в кишечнике человека и животных.

Молочнокислые бактерии в основном - анаэробы, но существуют виды, которые способны жить в аэробных условиях. Клетки молочнокислых бактерий по форме кокки или палочки, могут быть одиночными или соединены в цепочки.

Молочнокислые бактерии грамположительные, не способны образовывать споры, требовательны к источникам азота и витаминам (многие из них не развиваются на простых синтетических средах).

Классификация молочнокислых бактерий еще недостаточно разработана. Большинство исследователей кокковые формы объединяют в роды Streptococcus и Leuconostoc, а палочковидные - в род Lactobacillus.

Молочнокислые бактерии можно разделить:

• на гомоферментативные (конечным продуктом брожения является молочная кислота)

C₆H₁₂O₆  2CH₃CHOHCOOH

^{глюкоза молочная кислота}

• на гетероферментативные (конечными продуктами брожения являются уксусная кислота, глицерин, этиловый спирт)

C₆H₁₂O₆  2CH₃CHOHCOOH+CH₃COOH+CH₂OHCHOHCH₂OH+CH₃CH₂OH+CO₂

^{глюкоза молочная кислота уксусная кислота глицерин этиловый спирт}

Молочнокислые бактерии сбраживают моно- и дисахариды. Часто те из них, которые обитают в молоке, сбраживают лактозу, но не действуют на сахарозу. В качестве источника азота эта группа бактерий используют пептоны, смесь аминокислот.

По отношению к температуре молочнокислые бактерии можно разделить:

• на мезофильные - с оптимумом роста 25-35⁰С

• на термофильные - с оптимумом роста около 40-45⁰С.

Отдельные молочнокислые бактерии холодоустойчивы и могут развиваться при относительно низких положительных температурах (5⁰С и ниже). При нагревании до 60-80⁰С они гибнут в течение 10-30 мин.

Молочнокислые бактерии обладают определенной протеолитической активностью, обусловливаемой действием протеиназ и пептидаз.

Протеолитическую активность проявляют как кокковые формы, так и термофильные палочки, стрептобактерии. В процессе протеолиза белков молока, особенно в начале культивирования определенных штаммов в молоке, происходит накопление аминокислот: главным образом аспарагиновой кислоты, глицина, серина, глутаминовой кислоты, треонина, тирозина, валина, фенилаланина, изолейцина, а также пептидов.

Молочнокислые палочковидные бактерии обладают большей протеолитической активностью, чем кокковые формы. Так, L.bulgaricus, L.casei могут переводить до 25-30% казеина в растворимую форму, тогда как Str. cremoris и Str.lactis - 15 - 17%.

Гидролиз белков молока молочнокислыми бактериями осуществляется с помощью внеклеточных протеиназ. Существует прямая зависимость между степенью созревания сыра, его вкусом, ароматом и содержанием в нем свободных аминокислот, накапливаемых протеолитически активными молочнокислыми бактериями.

Для молочнокислых бактерий лучшая питательная среда - молоко. В нем есть все необходимые вещества для развития этих микроорганизмов. В такой среде могут развиваться и другие микроорганизмы: дрожжи, плесени, гнилостные, маслянокислые бактерии. Но молочная кислота быстро подавляет их рост.

Если простокваша долго сохраняется на воздухе, то на ее поверхности образуется белая бархатистая морщинистая пленка. Такая же пленка бывает на поверхности рассола при квашении огурцов, капусты и других овощей. Это и есть молочная плесень - Geotrichum candidum. Она всегда сопутствует молочнокислому брожению и является его нежелательным спутником. Окисляя молочную кислоту, образуемую молочнокислыми бактериями, до углекислого газа и воды, молочная плесень снижает кислотность. В результате в среде начинают развиваться гнилостные бактерии.