Ферменты.

В кале содержится ряд ферментов. Наибольшее практическое значение имеет определение энтерокиназы и щелочной фосфотазы, количественное определение которых используется как биохимический тест для оценки деятельности кишечника.

Определение щелочной фосфатазы (по Фоминой, Михлину, Шлыгину). Щелочная фосфатаза - характерный кишечный фермент, присутствующий в ферменте и слизистой оболочке тонкой кишки в больших количествах. В других пищеварительных секретах фермента содержится мало.

Принцип. В качестве субстрата используют фенолфталеинфосфат натрия, при инкубации которого с ферментом освобождается фенолфталеин, дающий красную окраску в щелочной среде. Появившаяся окраска визуально сравнивается с окраской стандартного щелочного раствора фенолфталеина. Определение проводится в условиях, оптимальных для действия щелочной фосфотазы в присутствии активатора (0,001 М Мg+, при температуре 37° и при рН 10,0).

Реактивы. 1. 0,1% раствор фенолфталеинфосфата натрия в 0,1 н аммиачном буфере рН 10,1. Для приготовления буфера смешивают 1 объемную часть 0,1 н раствора хлорида аммония (NH4Cl) и 4 части 0,1 н раствора аммиака (проверенного титрометрически). Исходные для буферной смеси растворы удобнее приготовлять и сохранять в виде 1 н концентрации и перед употреблением разбавлять в 10 раз. 2. 1,5% раствор сульфата магния, 3. Стандартный раствор фенолфталеина: смесь 1 мл 0,05% полуспиртового раствора (50 частей спирта + 46 частей воды) фенолфталеина, 1 мл 0,1 н раствора аммиака и 4 мл 0,1 н раствора хлорида аммония. Степень окраски раствора проверяют в фотоэлектроколориметре. Оптическая плотность при зеленом светофильтре и толщине слоя 1 см должна быть 0,17-0,19. Стандартный раствор сохраняют в темном месте в посуде, не подвергшейся выщелачиванию, в течение 1-2 нед. 4. Этиловый спирт.

Оборудование. 1. Термостат на 37-38°. 2. Центрифуга на 2500-3000 об/мин, с центрифужными стаканами емкостью 10-25 мл. 3.Ступки фарфоровые емкостью 50-100 мл. 4. Градуированные пипетки емкостью 2,5 и 10 мл. 5. Пробирки и штативы, 6. Кварцевый песок. 7.Фотоэлектроколориметр.

Ход определения. Готовят вытяжку из фекалий 1:10 (см. определение энтерокиназы). Степень разведения вытяжки зависит от ожидаемых результатов анализа. При исследовании фекалий взрослых берут разведение 1:30 (1 часть вытяжки и 2 части дистиллированной воды). При исследовании фекалий детей первых 2-3 лет жизни разведение 1:200 или 1:1000, т. е. Вытяжку дополнительно разводят в 20 или 100 раз. Определение начинают с ориентировочной пробы: к 0,5-1 мл вытяжки добавляют равный объем раствора фенолфталеинфосфата в аммиачном буфере (реактив № 1). Если в течение 2 мин появляется значительное розовое окрашивание то вытяжку разводят дополнительно в 10 раз и снова испытывают тем же образом. В случае появления розовой окраски разводят вновь. Отсутствие окраски в течение 2 мин свидетельствует о достаточной степени разведения материала (исходное разведение).

Для исследования берут 8-10 пронумерованных пробирок из бесцветного стекла одинакового диаметра. В каждую пробирку, за исключением первой, наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку наливают 1 мл исследуемого раствора в исходном разведении, установленном в ориентировочной пробе. Во вторую пробирку наливают 2 мл исследуемого раствора и хорошо перемешивают с водой, набирая в пипетку жидкость и выдувая обратно. После этого 2 мл смеси из второй пробирки переносят в третью и т.д. до конца ряда. Из последней пробирки 2 мл жидкости отбрасывают. Таким образом, получают ряд разведений с уменьшением количества ферментного материала в каждой пробирке на 1/3. Во все пробирки добавляют по капле 1,5% раствора МgSO4 (реактив № 2), служащего активатором, и по 1 мл реактива № 1. Пробирки закрывают пробками . перемешивают и помещают в термостат при 37а С на час. По истечении времени наблюдается постепенное изменение окраски от интенсивно-красной на одном краю до полного отсутствия красного окрашивания на другом. Поднося пробирку со стандартным раствором фенолфталеина (2 мл), нахолят степень окраски в ряду, равную стандартной.

Количество фермента, вызывающее в описанных выше условиях появление такой окраски, принято за единицу фосфатазы.

Расчет. Количество единиц фосфатазы в 1 г исследуемого материала по формуле: Е=Р/а , где а - количество разведенной вытяжки в пробирке со стандартной окраской, Р - предварительное разведение материала.

Клиническое значение. В фекалиях здоровых взрослых людей щелочная фосфатаза содержится в количестве до 450 ед/г. Увеличение ее в фекалиях, так же как и увеличение содержания энтерокиназы, связано с изменением функции толстых кишок и деятельности микрофлоры. При кишечных заболеваниях иногда отмечают 1500-3000 ед/г щелочной фосфатазы. Повышение количества этих ферментов указывают на более тяжелые нарушения функции кишечника. У детей содержание щелочной фосфатазы в фекалиях выше, чем у взрослых. У новорожденных оно составляет в среднем 4500 ед/г, у детей в возрасте около года - 5000-20000, в среднем 12000 ед/г, далее оно уменьшается и в возрасте 10-12 лет находится на том же уровне, что и у взрослых.