8. Лабораторна діагностика

У лабораторію направляють голову з двома шийними хребцями або головний мозок великих і середніх тварин. Доставляють свіжий труп дрібної тварини. Суворо виконують правила взяття патологічного матеріалу. Відбір мозку, інші операції з патологічним матеріалом слід виконувати в умовах стерильності, ретельного дотримання правил особистої безпеки. Ветеринарний спеціаліст під час відбору матеріалу має бути одягненим у спеціаль­ний комбінезон із шоломом, що закриває голову й шию, або в два ха­лати й відповідний головний убір, прогумовані нарукавники й фар­тух, гумове взуття. Руки повинні бути захищені двома парами рука­вичок (хірургічними й анатомічними), очі — спеціальними окуляра­ми, а ніс і рот — шестишаровою марлевою пов'язкою. Обличчя можна також закривати спеціальною маскою з оргскла.

Для відбору патологічного матеріалу міцно фіксують голову тва­рини. Шкіру після розрізу вздовж середньої лінії й поперечних роз­різів відсувають убік, відрізають м'язи. Потім видаляють склепіння черепа за допомогою пилки для кісток чи долота, стерильними ін­струментами витягають мозок, який вміщують у широкогорлу банку з притертою скляною пробкою або капроновою кришкою. Консерво­ваний мозок для вірусологічних досліджень непридатний.

Банки з мозком, свіжий труп або голову тварини ретельно упа­ковують у поліетиленові мішки, які вміщують у вологонепроникну тару, що щільно закривається, з вологопоглинальною прокладкою, просоченою дезінфектантом. Упакований патологічний матеріал і супровідний лист відправляють із посильним. У супровідному листі вказують адресу лабораторії ветеринарної медицини, в яку направ­ляють матеріал; назву матеріалу; вид і номер тварини, дату імуні­зації її проти сказу; анамнестичні дані й обґрунтування підозри що­до захворювання тварини на сказ; зазначають усіх постраждалих і тих, хто контактував з твариною; називають відправника, його ад­ресу, дату відправлення, прізвище лікаря ветеринарної медицини.

Індикація й ідентифікація вірусу. Із кожного відділу голов­ного мозку (амонового рога, мозочка, кори півкуль, довгастого моз­ку) готують по 2 мазки для реакції імунофлуоресценції та для вияв­лення тілець Бабеша — Негрі у світловому мікроскопі, з мозковою тканиною проводять реакцію дифузійної преципітації, за негатив­них результатів проводять біо-пробу.

Виявлення специфічних тілець-включень. Мазки фік­сують не менш як 2 год в етило­вому спирті й забарвлюють за Муромцевим, у разі забарвлен­ня за Селлерсом мазки не фік­сують Після забарвлення препара­ти переглядають у світловому мікроскопі з імерсією. Позитив­ним результатом вважають на­явність специфічних тілець Ба­беша — Негрі. Щодо забарвлен­ня тілець Бабеша — Негрі за Муромцевим, то це світлофіолетові утвори з темно-синіми включеннями, частіше розміщені поза нервовими кль тинами; за Селлерсом — у ци­топлазмі чітко окреслені овальні чи довгасті гранулярні утвори рожево-червоного кольору.

Тільця Бабеша — Негрі виявляють лише в 65 — 85 % дослідже­них проб, відібраних від тварин, хворих на сказ, тому їх відсутність не виключає сказ, матеріал досліджують за допомогою інших тестів (РІФ, РДП, біопроба).

Реакція імунофлуоресценції (РІФ) — один з основних тестів діагностики сказу. Однак у РІФ не можна досліджувати матеріал від щеплених проти сказу тварин упродовж 3 міс, а також тканини, консервовані гліцерином, формаліном, спиртом, і матеріал, що гниє.

Зазвичай у діагностичній практиці використовують прямий ме­тод імунофлуоресценції із застосуванням антирабічного флуоресці­юючого імуноглобуліну. Із різних відділів мозку готують по 2 тонких мазки, фіксують препарати в охолодженому (мінус 8 — мінус 20 °С) ацетоні впродовж не менш як 4 год Фіксовані мазки висушують на повітрі, наносять флуоресціюючий імуноглобулін, вміщують у вологій камері в термостат за температури 37 °С на ЗО хв, ретельно про­мивають фізіологічним розчином чи фосфатним буфером із рН = 7,4 й споліскують дистильованою водою. Після висушування на повітрі наносять нефлуоресціюючу імерсійну олію, переглядають мазки в люмінесцентному мікроскопі, оцінюючи інтенсивність світіння ком­плексу антиген - антитіло.

Антиген вірусу сказу виявляється у вигляді яскравих жовто-зелених чи зелених, різної форми й розміру гранул у клітинах чи поза клітинами. Діагноз вважають установленим, якщо в кількох полях зору виявляють не менш як 10 типових гранул округлої й овальної форми з яскравим зеленим світінням або знаходять безліч найдрібніших точок світіння. Інтенсивність світіння оцінюють у плюсах. Відсутність специфічного світіння вважають негативним результатом.

У контрольних препаратах із мозку здорової миші виявляють тьмяне сірувате чи слабке зеленувате світіння.

Як доказ специфічності світіння комплексу антиген — антитіло використовують метод пригнічення імунофлуоресценції. Мазки з досліджуваного мозку тварин обробляють спочатку 5%-м антирабіч-ним нефлуоресціюючим імуноглобуліном упродовж ЗО хв за темпе­ратури 37 °С у вологій камері, а після промивання фізіологічним розчином — флуоресціюючим імуноглобуліном за загальноприйня­тим прямим методом.

У цьому разі антиген, зв'язаний із нефлуоресціюючими антиті­лами, не зв'язується флуоресціюючими специфічними антитілами. Тому такі препарати флуоресценції не дають.

Реакцію дифузійної преципітації під час діагностики сказу проводять не лише зі свіжим мозком тварин, а й з тим, що загниває. Проби, відібрані з різних відділів головного мозку (мозок мишей беруть цілком), об'єднують і розтирають у ступці. Отриману пасто­подібну гомогенну масу вміщують у центральні лунки 1,5%-го ага­рового гелю на предметних стеклах або в чашках Петрі. У периферичні лунки пастерівською піпеткою наливають антирабічний імуноглобулін у дворазових розбавляннях від 1 : 2 до 1 : 16. Після витримування агару з внесеними компонентами у вологій камері в термостаті (37 °С) впродовж 6 год чи за кімнатної температури впродовж 18 год обчислюють результати. Остаточно оцінюють ре­зультати за 48 год. У позитивних випадках спостерігаються лінії преципітації між лунками з антигеном і розбавляннями антирабіч­ного імуноглобуліну. Негативні результати цих досліджень не ви­ключають сказу. Виявлення антигену становить 45 — 70 %.

Біологічну пробу вважають найнадійнішим методом діагности­ки сказу (близько 98 % вірогідності); метод має велике епізоотоло­гічне значення.

Недоліком методу є велика витрата часу на проведення проби й об­лік. Результати отримують занадто пізно для того, щоб можна було визначити необхідність початку вимушеної вакцинації покусаних осіб. У процесі проведення біопроби слід враховувати також, що в моз­ку й слинних залозах лисиць, загиблих від сказу, виявлено речови­ну, яка інгібує інфекційність вірусу. Це не дає змоги в окремих ви­падках остаточно зробити висновок про наявність чи відсутність хвороби у тварин методом інтрацеребрального зараження мишей, але не перешкоджає індикації вірусного антигену в реакції імунофлуоресценції, яка для такого виду тварин, як лисиці, є най­більш чутливим методом.

Біопробу проводять на білих мишах, переважно си­сунцях масою 6 — 8 г чи моло­дих — масою 10 - 14 г. Викорис­товують і дорослих мишей масою 16 - 20 г. Матеріалом для зара­ження є надосадова рідина, отримана після відстоювання 10%-ї суспензії, приготовленої з усіх відділів головного мозку, яка після обробки антибіотиками дає негативний результат бактеріо­логічного контролю. Для біопроби беруть 6-10 мишей. Мишенят за­ражають інтрацеребрально в дозі 0,03 мл, а дорослих мишей — під-шкірно у верхню губу або в кінчик носа по 0,05 — ОД мл.

Результати спостереження реєструють у журналі впродовж ЗО діб. Загиблих у перші 48 — 72 год не враховують, вважаючи їхню загибель результатом травми або бактеріальної інфекції. Після інкубаційного періоду, що може тривати від 6 до 20, а частіше 10 -14 діб, з'являються перші ознаки захворювання, нетипові для зараження неиротропним вірусом: млявість, скуйовдженість шерсті. Пізніше ви­являються все типовіші ознаки для нейротропного захворювання: порушення координації рухів, своєрідна горбатість спини, розвива­ються парез і параліч задніх, потім передніх кінцівок і — загибель.

Однак тільки на підставі клінічних ознак, нехай навіть типових, ще не можна встановити діагноз. Необхідно досліджувати всіма ви­кладеними методами головний мозок тварин, що загинули на 4 — 30-й день. Біопробу вважають позитивною, якщо в мазках із мозку зара­жених мишей виявляють тільця Бабеша — Негрі або антиген вірусу сказу в реакціях імунофлуоресценції й дифузійної преципітації.

Негативний діагноз установлюють тільки після закінчення тер­міну біологічної проби, якщо специфічної загибелі мишей не спостерігалося, а результат реакцій імунофлуоресценції й дифузійної преципітації негативний.

Надійнішим методом лабораторної діагностики сказу е заражен­ня досліджуваним матеріалом чутливих клітинних культур (НГУК, ВНК) з наступним виявленням вірусних антигенів за допомогою РІФ. За чутливістю він не поступається біологічній пробі на білих мишах, разом з тим дає змогу значно оперативніше виявити збуд­ника сказу — впродовж 24 - 72 годин.