4.3. Діагностика хвороби Тешена.

Для виділення збудника частіше використовують фрагменти кори головного мозку: мозочок, довгастий мозок, сегменти з шийної й поперекової частини спинного мозку розміром 1-2 см. Вірус можна виділити з фекалій хворих тварин, проте у зязку з можливістю тривалого перебування вірусу в кишечнику тварин, перехворілих без прояву симптомів хвороби, діагностична цінність таких досліджень є низькою. В окремих випадках беруть змиви з прямої кишки.

При відбиранні матеріалу, для виділення даного вірусу, слід памятати що в максимальних концентраціях він міститься в тканинах центральної нервової системи, в кінці інкубаційного періоду і на самому початку паралітичної стадії (протягом 1-2 днів); пізніше вміст вірусу в тканинах центральної нервової системи стає дуже незначним, а до моменту загибелі відмічають, так звану, ауто стерилізацію. Враховуючи ці особливості, для вірусологічного дослідження слід відбирати матеріал від тварин спеціально забитих при появі або на висоті підйому симптомів хвороби (не пізніше 3-5-го дня).

Ми проводили розтин трупів трьох підсвинків, що загинули від гострої форми перебігу хвороби Тешена. Характерними патологоанатомічними змінами були гіперемія слизової оболонки носа, яка майже у всіх випадках є багряно-червоною або синюшною, спостерігається інєкція судин мякої мозкової оболонки.

У одного підсвинка спостерігали крапкові і розлиті крововиливи на ендокарді і епікарді, серозній оболонці плеври і незначний набряк легень; у печінці і селезінці, на стінках кишок усіх тварин відмічали венозний застій. Брижові судини наповнені кровю, брижові лімфатичні вузли збільшені, шлунок слабо наповнений вмістом, слизова оболонка шлунку вкрита густою прозорою слизовою рідиною, на окремих ділянках слизової оболонки кишок виявляли ділянки гіперемії. Сечовий міхур, у всіх випадках був переповнений сечею. При розтині трупів двох підсвинків спостерігали інфаркти селезінки.

У Житомирській обласній державній лабораторії ветеринарної медицини вірус хвороби Тешена було виділено на культурі клітин СНЕВ (свиняча нирка ембріональна версенізована) і надалі ідентифіковано в реакції нейтралізації (РН) з набором діагностикуму, що випускає Чернігівський НДІ сільськогосподарської мікробіології. Слід відзначити, що діагноз на хворобу Тешена було підтверджено 21 квітня 2003 року, і 17 листопада 2003 року (матеріал надіслано 7 листопада 2003 року) знову виділили збудника із присланого патологічного матеріалу і підтвердили діагноз. Класичну чуму й хворобу Ауєскі виключили лабораторними дослідженнями.

Зібраний матеріал поміщали в стерильні пеніцилінові флакони і доставляли в лабораторію в термосі з льодом. Матеріал можна консервувати і в 50%-ному забуференому розчині гліцерину з рН (7,2-7,4). В супровідній були подані відомості про те, що імунізації тварин проти хвороби Тешена, в даному господарстві, не проводили (при першому дослідженні у квітні), і про те, що тварини були щеплені у травні 2003 року інактивованою емульсин-вакциною проти хвороби Тешена виробництва Сумської біофабрики (при пересилці

матеріалу в лабораторію від щеплених тварин у листопаді 2003 року).

В лабораторії матеріали обробляли загальноприйнятими методами: готували 10%-ну суспензію на фосфатно-буферному розчині (ФБР), центрифугували при 3-5 тис. об/хв. протягом 15-30 хв. якщо матеріал був консервований гліцерином, то його попередньо відмивали від гліцерину фізіологічним розчином, просушували на стерильному папері,а потім після зважування готували суспензію.

Для більшої вірогідності виділення вірусу і зменшення кількості проб, які досліджуються, кусочки з різних відділків мозку, від однієї тварини обєднували в загальну пробу, яку потім подрібнювали й розтирали в ступці.

Щоб вірус краще зберігався в такій суспензії до неї додавали 1-2% стерильної неспецифічної, ін активованої теплом сироватки крові телят. До використання суспензію зберігали при + 4^оС.

Також, для виділення вірусу використовували перещеплювану лінію клітин СНЕВ. Матеріал із кожної проби вносили по 0,1 мл не менш ніж в 4 пробірки з культурою клітин, після адсорбції (при 37^оС упродовж 30 хв.) кожну пробірку заливали підтримувальним середовищем по 0,9 мл. Для контролю 4 пробірки залишали незараженими. Цитопатичні зміни в нашому випадку проявились у першому пасажі (за відсутності цитопатичних змін в перших пасажах культуру проморожують і знову проводять зараження). Цитопатичні зміни, що виникали в культурах клітин під дією вірусу хвороби Тешена характеризуються скупченням округлих клітин із підвищеною світлопереломлюваністю (рефрактильністю), які стають помітними на 3-5-й день після зараження. Уражені клітини відділяються від поверхні скла; крім вогнищ дегенерації, зявляються ділянки, що зовсім не мають клітин. Культуральну рідину проморожували при наявності цитопатогенної дії на +++ і надалі ідентифікували вірус у реакції нейтралізації.

Ідентифікація вірусу із застосуванням реакції нейтралізації (РН). В обласній державній лабораторії ветеринарної медицини застосовується

прискорений метод запропонований співробітниками Чернігівського інституту сільськогосподарської мікробіології. Метод дозволяє одночасно здійснювати виділення, титрування і типування вірусу в культурі клітин СНЕВ. Для виділення вірусу заражали 4 пробірки з культурою клітин 10%-ною суспензією з патологічного матеріалу. В кожну пробірку додавали по 0,1 мл суспензії і 0,9 мл підтримувального середовища і поміщали в термостат. Для контролю залишали 4 пробірки з незараженою культурою. Потім брали два ряди пробірок, із культурою клітин, по 5 пробірок (перший ряд для титрування; другий – для типування). В першому ряді пробірок робили послідовні 10-кратні розведення суспензії патологічного матеріалу з 10-1 до 10-5. В другий ряд пробірок переносили по 0,5 мл кожного розведення антигену, починаючи з 1СГ5, і додавали по 0,5 мл приготовленої ін активованої специфічної сироватки в робочому розведенні (із цією метою специфічну сироватку з набору розводили 1:1000 і інактивували 30 хв. при 56^оС, таку сироватку можна зберігати в холодильнику при 4^оС 6 міс.), струшували, ставили для контакту при 37^оС на 1,5 год. Далі суміш кожного розведення по 0,2 мл інокулювали в 4 пробірки з культурою клітин, в яких попередньо ростове середовище заміняли на 0,8 мл підтримувального середовища. З кожного розведення першого ряду, починаючи з 10~5, заражали по 0,1 мл в 4 пробірки з культурою клітин, де ростове середовище попередньо було замінене на 0,9 мл підтримувального.

Усі пробірки з культурою клітин (48 пробірок) інкубували в термостаті 7-8 діб, щоденно проглядаючи на наявність цитопатогенної дії (ЦПД). ЦПД у нашому випадку проявилась через 72 год. Титр збудника без сироватки становив відповідно 41, а отже, вірус було ідентифіковано як збудник хвороби Тешена.

В окремих випадках (якщо лабораторії не володіють технологіями вирощування культур клітин) проводять виділення вірусу на поросятах 2-4-х міс. віку. Використовують по 2 тварини для зараження й контролю. Заражають 5%-ною суспензією головного і спинного мозку від вбитих хворих свиней

або вірусовмісною культуральною рідиною по 0,2-0,4 мл інтрацеребрально і по 1,0 мл на скарифіковану слизову кожної ніздрі. Спостереження за такими тваринами проводять протягом 1 міс. біопробу вважають позитивною при розвитку, в заражених тварин, клінічних ознак хвороби й відсутності таких ознак у контрольних. Зараження поросят можна проводити під ефірним наркозом або без нього, а трепанацію робити бором без попереднього надрізання шкіри на лінії, яка поєднує задні кути очей, дещо вбік від середньої лінії. Цей спосіб досить зручний, тому що при невеликому отворі зменшується можливість попадання секундарної мікрофлори.

В лабораторіях ветеринарної медицини можна застосовувати гістологічне дослідження. Це єдиний метод діагностики, який застосовується в лабораторних умовах без використання культур клітин. Для дослідження використовують тканини головного й спинного мозку. Кусочки мозку фіксують в 10%-ному нейтральному формаліні, поміщають у парафін, готують зрізи, фарбують їх гематоксиліном-еозином і здійснюють мікроскопію. Повна гістологічна картина хвороби Тешена являє собою негнійний поліоенцефаліт. У позитивних випадках зміни знаходять у середній і каудальній частинах головного мозку, у довгастому мозку, в шийній і поперековій частинах спинного мозку (при гострій формі у спинному мозку добре виражена деструкція нейронів).