Хохлов

Глава 3. Фармацевтическая разработка лекарственных препаратов

По итогам проведенного исследования БЭ может быть сделано 3 варианта заключения:

1.Тестируемый и референтный препараты биоэквивалентны – отношения средних геометрическихи их 90% доверительные интервалы всех изучаемых параметров укладываются в установленный диапазон.

2.Тестируемый и референтный препараты небиоэквивалентны – отношения средних геометрическихи их 90% доверительные интервалы всех изучаемых параметровне укладываются в установленныйдиапазон.

3.Тестируемыйиреферентныйпрепаратынемогутбытьпризнаныбиоэквивалентными – отношение средних геометрических и их 90%-доверитель- ный интервал хотя бы одного из сравниваемых параметров укладываются в установленный диапазон, а у остальных фармакокинетических констант – выходят за допустимые границы. При этом варианте заключение возможен дополнительныйнабордобровольцевипродолжениеисследованиястемже тестируемым препаратов без изменения его состава и технологии.

Этап статистической обработки завершается формированием отчёта. В этототчётвходятвсерезультатывыполненныхрасчётов:значенияфармакокинетические параметры каждого добровольца, их отношения, результаты их логарифмического преобразования, включая описательную статистику, итоги многофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), вычисленные отношения средних геометрических и границы 90% доверительных интер-

валов параметров Cmax, AUC0-t, AUC0-∞, Cmax/AUC0-t. Также к данному документуприлагаютсятаблицысиндивидуальнымизначениямиконцентраций

в точках отбора проб и фармакокинетические профили тестируемого и референтного препарата для каждого из испытуемых [111, 213].

3.9.4. Причины получения неэквивалентных результатов исследований биоэквивалентности

В ходе проведения клинических исследований биоэквивалентности могут быть получены недостоверные или отрицательные результаты. Основной причиной некорректных результатов являются ошибки биоаналитической методологии и неправильный выбор дизайна и объёма выборки [212, 213]. Причинами неэквивалентности тестируемого и референтного препарата могут быть отличия в физико-химических свойствах АФС и составе вспомогательных веществ, влияющие на скорость всасывания и биодоступность, а также в технологии производства.

3.9.4.1. Основные ошибки, допускаемые при проведении биоаналитического этапа

Припроведениибиоаналитическогоэтапахимикамиможетбытьдопущен ряд ошибок при разработке методик количественного определения изучаемых соединений: при оценке селективности, эффекта матрицы, стабильности аналита или его метаболитов в биологической матрице.Недостаточная селективность является следствием низкой избирательности выбранного метода анализа. Так, при проведении исследования низкомолекулярных соединений с помощью иммунохимических методов возможно возникновение

201

Промышленная фармация. Путь создания продукта

перекрёстных реакций с близкими по структуре метаболитами. В случае ис- пользованияВЭЖХиГХбезмасс-спектрометрическогодетектированиявоз- можноко-элюированиевместесанализируемымвеществомминорныхмета- болитов и эндогенных соединений, что приводит к получению завышенных результатов. Применение масс-спектрометрического детектора позволяет устранить данную проблему. Однако, при этом возможна фрагментация потенциально нестабильных метаболитов, таких как глюкурониды, N-оксиды, сложные эфиры, лактоны, в источнике ионов из-за жёстких условий анализа (высокие температуры и напряжение). Влияние разложения данных классов веществ на количественное определение аналита можно предупредить следующими способами: подбором программы их хроматографического разделения, выбором более мягких условий ионизации (снижение напряжения капилляра электроспрея и температуры в источнике ионов), изолированием

Табл. 15. Параметры хромато-масс-спектрометрического определения микофеноловой кислоты методом ВЭЖХ-МС/МС

202

Глава 3. Фармацевтическая разработка лекарственных препаратов

аналита с помощью жидкостно-жидкостной или твёрдофазной экстракции [210, 211, 370, 371]. Так, при разработке ВЭЖХ-МС/МС-методики определения микофеноловой кислоты (МФК) в плазме обратную конверсию её фенольного глюкуронида (ФГМФК) удалось нивелировать путём изменения условий изократического элюирования на градиентное (табл. 15) [208, 369]. В случае применения метода ГХ-МС для измерения концентрации МФК в плазме её основной метаболит удалось изолировать путём селективной экстракции метиленхлоридом при коррекции до величины рН 2,0: ФГМФК при данных условиях не экстрагируется (рис. 27) [211, 371]. Уменьшение температуры в источнике ионов для устранения фрагментации возможно, например, при совместном определении ацетилсалициловой и салициловой кислоты [212, 213]. При этом необходимо учесть, что смягчение оптимальных условий хромато-масс-спектрометрического определения, в большинстве случаев, приводит к снижению чувствительности.

Рис. 27. Примеры хроматограмм образца плазмы, содержащего ФГМФК в концентрации 100 мкг/мл (А) и МФК в концентрации 0,05 мкг/мл, после дериватизации экстракта при использовании ГХ-МС-метода

203

Промышленная фармация. Путь создания продукта

Эффектматрицы–этоподавлениеилиусилениеаналитическогосигнала под влиянием компонентов биологической матрицы, приводящее к снижению прецизионности результатов. При использовании для количественного определения метода хромато-масс-спектрометрии данное явление происходит из-за коэлюирования эндогенных веществ, главным образом, фосфолипидов, вместе с молекулами аналита. Известны следующие способы устранения матричных эффектов [212, 213]:

1.Изменение условий подготовки проб для селективной экстракции аналита: замена осадителя при использовании депротеинизации; замена экстрагента при жидкостно-жидкостной экстракции, замена вида сорбента при твёрдофазной экстракции; замена способа подготовки проб.

2.Изменение параметров хроматографического разделения: замена вида сорбента хроматографической колонки (C18-, C8-, фенилгексилсиликагели и. т.д.), применение двумерной хроматографии, изменение параметров элюирования, состава подвижной фазы [209, 375].

3.Изменение условий масс-спектрометрического детектирования: смена полярности, изменение способа ионизации с электрораспылительной на химическую ионизацию при атмосферном давлении, при которой эффект матрицы отсутствует.

4.Применение изотопно-меченных внутренних стандартов (молекул анализируемых веществ, в которых несколько атомов заменены на стабильные изотопы дейтерия, углерода (13С), азота (15N) или кислорода (18О)) для расчёта концентраций. Данные молекулы элюируются вместе с аналитом, поэтому компоненты биологической пробы не влияют на относительную эффективность ионизации, и соотношение откликов аналит/внутренний стандарт остаётся постоянным.

Таким образом, использование вышеперечисленных мер, а также правильное изучение эффекта матрицы в рамках валидации методики позволит избежать получения ложных результатов.

Нестабильность лекарственных веществ и их метаболитов в биологических жидкостях после отбора у добровольцев является фактором риска, которыйможетпривестикполучениюошибочныхрезультатов.Дляснижения данного риска перед проведением клинической части необходимо предпринять меры для предотвращения разложения лекарственных веществ и их метаболитов, содержащих потенциально нестабильные функциональные группы, в биологических пробах. Примерами легкоразлагающихся соединений являются фенолы, тиолы, подверженные процессам окисления, и сложные эфиры, лактоны, коньюгаты лекарственных веществ (глюкурониды, сульфаты и т.д.), подверженные процессам гидролиза. Известны случаи деградации лекарственных препаратов под действием ультрафиолетового излучения. Замедлить разложение изучаемых соединений в биологических объектахможнопутёмподбораантикоагулянта(вт.ч.ингибиторовферментов), комбинации антикоагулянта и раствора стабилизатора (антиоксидантов,буферныхрастворов,растворовкислотиоснованийдлякоррекциирН).

204

Глава 3. Фармацевтическая разработка лекарственных препаратов

Использование глубокой заморозки до температуры от минус 80 до минус 130°С продлевает срок хранение образцов до 6 мес. и более [226]. После выбора способа стабилизации сотрудникам биоаналитической лаборатории необходимо составить рекомендации для персонала клинического центра по отбору образцов. В табл. 16 представлены основные примеры лекарственных препаратов и способы их стабилизации.

Табл. 16. Основные способы стабилизации лекарственных веществ и их метаболитов в биологических жидкостях [226]

	Процесс	Примеры лекарственных	Способ стабилизации
		препаратов
	Окисление	Двухатомные фенолы (ме-	Добавление к биологической жидкости
		тилдопа, леводопа, допа-	растворов антиоксидантов (аскорбино-
		мин, адреналин, N-оксиды	вой кислоты, натрия метабисульфита
		(хлорпротиксен)	и т.д.)
		Тиолы (каптоприл, прасу-	Дериватизация сразу после отбора проб
		грел, омапатрилат)
	Гидролиз	Глюкурониды (телмисар-	Коррекция рН биологической пробы до
		тан, диклофенак, микофе-	значений ниже 6,0 (ацилглюкурониды);
		ноловая кислота)	подбор антикоагулянта; использование
			техники сухих пятен крови и плазмы
		Сложные эфиры, лактоны	Коррекция рН до кислых значений),
		(статины, осельтамивир,	использование ингибиторов эстераз
		ацетилсалициловая кис-	(фторида натрия, смеси фторида натрия
		лота)	и оксалата калия, параоксона, и т.д.)
	Разложение под	Витамины группы D,	Хранение проб и стандартных рас-
	действием уль-	нифедипин, монтелукаст,	творов в светонепроницаемой таре,
	трафиолетового	нитраты	использование для освещения лаборато-
	излучения		рии ламп, не выделяющих ультрафиоле-
			товое излучение

Таким образом, предупредить риск получения ошибочных результатов исследований биоэквивалентности можно на этапе разработки биоаналитическойметодики. Подтверждение селективности методики по отношению к метаболитам лекарственного вещества, а также подтверждение отсутствия их обратной конверсии в процессе хранения устраняет возможность получения завышенных результатов. Стабильность изучаемых веществ в биологических жидкостях гарантирует достоверность значений фармакокинетических параметров. Нивелирование эффекта матрицы обеспечивает правильность и прецизионность методики.

3.9.4.2. Влияние состава и технологии производства на биофармацевтические свойства воспроизведённого препарата

На скорость и полноту всасывания действующего вещества из лекарственной формы влияют физико-химические свойства активных фармацев-

205

Промышленная фармация. Путь создания продукта

тическихсубстанций,составвспомогательныхвеществ,атакжетехнология производства. Среди наиболее критичных для биодоступности параметров АФС можно выделить полиморфизм, степень измельчения, форму частиц, остаточную влажность [212, 213].

Полиморфизм – способность вещества существовать в нескольких кристаллических формах с различными физико-химическими свойствами [213]. Так, конформационные модификации ритонавира отличаются растворимостью в воде. Возможно также образование кристаллогидратов (псевдополиморфизм). Например, безводная форма формотерола фумарата является аморфной, а дигидрат имеет кристаллическую структу-

ру [192].

От степени измельчения АФС зависит также полнота её всасывания. Для плохо растворимых в воде лекарственных веществ, например, апрепитанта и валсартана, при увеличении размера частиц значительно уменьшается растворимость. Микронизация таких субстанций увеличивает их биодоступность, что следует учесть при разработке воспроизведенных препаратов. Различия в степени измельчения и размере частиц влияют на технологические характеристики: у субстанций могут отличатся сыпучесть,прессуемость,удельнаяповерхностьинасыпнаямасса.Избыточная влажность гранулята может привести к повышению прочности таблетки и снизить её распадаемость [213].

Технология производства лекарственного препарата в значительной степени влияет на его фармакокинетические параметры. Применение разных способов грануляции, например, влажной и сухой, или отличия в параметрах грануляциив псевдосжиженном слоеили грануляциисбольшим усилием сдвига при разработке дженерика, приводят к получению частиц с разной морфологией (формой, размером и т.д.), что сказывается на их растворимости, а также распадаемости лекарственной формы. При сушке гранулятамогутвозникнутьразличныеполиморфныемодификациисдругими биофармацевтическими свойствами. Любое изменение параметров техпроцесса может повлиять биодоступность лекарственного препарата, поэтому должно контролироваться путём проведения ТСКР [213].

Биодоступность и скорость всасывания действующего вещества напрямую зависит от вспомогательных веществ. Внесение изменений в состав оригинального препарата повышает риск получения отрицательных результатов исследования БЭ [56, 195]. Так, в составе воспроизведённого препарата микофенолата натрия (таблетки, покрытые оболочкой в дозировке 360 мг) содержание разрыхляющих веществ было в 3 раза выше, а связующих – в 3 раза ниже, чем у референтного препарата «Майфортик». Это привело к более быстрому высвобождению АФС с достижением более высокого уровня максимальной концентрации микофеноловой кислоты в плазме, и как следствие, неэквивалентным результатам [206]. ТСКР в данном случае был неинформативен, так как для данных ЛП предлагается использовать только одну среду растворения, фосфатный буферный раствор с рН 6,8

206

Глава 3. Фармацевтическая разработка лекарственных препаратов

(после кислотной стадии в 0,1 н растворе хлористоводородной кислоты), которая не обладает достаточной дискриминирующей способностью: МФК при данных условиях легко растворяется [280].

3.9.4.3. Последствия неправильного выбора дизайна исследований биоэквивалентности

На правильность результатов исследований БЭ в значительной степени влияет дизайн исследования, выбор которого определяется такими особенностями фармакокинетики лекарственного препарата, как высокая вариабельность ФК параметров, длительность периода полувыведения, терапевтическая широта, наличие энтерогепатической рециркуляции действующего вещества или его эндогенных концентраций.

Величина периода полувыведения имеет важное значение при расчёте продолжительности отмывочного периода для исследований с перекрёстным и репликативным дизайном. Слишком короткий срок между приёмами тестируемого и референтного ЛП может привести к эффекту переноса действующего вещества с предыдущего этапа, и, как следствие, исключению данных добровольца из статистических расчётов и снижению статистической мощности исследования [212, 213]. Для препаратов, имеющих период полувыведения более 24 часов [309], рекомендуется применять параллельный дизайн. Это значительно сокращает продолжительность исследования, поскольку при этом не требуется длительный отмывочный период. Однако, в ходе таких исследований могут быть получены менее точные данные изза гетерогенности групп добровольцев по таким параметрам, как возраст, пол, индекс массы тела, интенсивность метаболизма. Поэтому необходимо обращать внимание на сопоставимость значений данных параметров в ходе скрининга и при формировании групп.

В случае наличия энтерогепатической рециркуляции лекарственного вещества(например,препаратымикофеноловойкислотыиуродезоксихолевой кислоты) при выборе временных точек и продолжительности исследования следует учитывать прирост его концентрации в терминальной части фармакокинетической кривой. Если частота отбора проб будет недостаточной, то нарастание концентрации не будет зафиксировано, и полученный фармакокинетический профиль не будет объективно отражать динамику изменения содержания препарата в крови или плазме [206, 208, 213].

При исследованиях биоэквивалентности аналогов эндогенных соединений в биологических жидкостях могут содержаться данные вещества в определённой концентрации, что приведёт к погрешности в расчётах фармакокинетических параметров лекарственного препарата. Поэтому перед приёмом ЛП у каждого добровольца следует измерить фоновую концентрацию. При необходимости количественное определение выполняют в нескольких временных точках для изучения суточных колебаний с учётом циркадных ритмов и гомеостатических механизмов биосинтеза и выведения изучаемого вещества [213]. В некоторых случаях возможно исследова-

207

Промышленная фармация. Путь создания продукта

ние биоэквивалентности после приёма сверхтерапевтических доз для разграничения эндогенного уровня от концентрации, обусловленной приемом ЛП. Поступление определяемых веществ и их предшественников с пищей должно строго контролироваться [143].

Улекарственных препаратов с высоковариабельной фармакокинетикой наблюдаются значительные различия в скорости и степени абсорбции лекарственного вещества после приема в одинаковой дозе у одного и того же субъекта. Это связано со следующими особенностями ЛП: значительный пресистемныйметаболизмвстенкекишечникаи/илиприпервомпрохождениичерезпечень(например,мебеверин[375]),плохаярастворимостьвводе

инизкая биодоступность субстанции, особенности состава лекарственной формы. При изучении биоэквивалентности таких ЛП в случае применения стандартного перекрёстного дизайна объём выборки может превышать 40 человек [147]. Так, открытое рандомизированное, двухэтапное исследование сравнительной фармакокинетики таблеток микофенолата натрия в дозировке было выполнено на 48 здоровых добровольцах. При этом величина

коэффициента внутрисубъектной вариабельности параметра Cmax превышала45%[206].ДлясокращенияколичествасубъектовтакихЛПцелесообразно использовать повторный дизайн с тремя (каждый субъект получает тестируемыйилиреферентныйпрепаратподвараза)иличетырьмяпериодами приема препаратов (каждый субъект получает тестируемый и референтный препарат по два раза). При составлении протокола стоит также обосновать расширениеграницбиоэквивалентности,таккакпристандартныхпределах 80,00–125,00 % присутствует значительный риск получения отрицательных результатов [111, 147, 213].

Улекарственных препаратов с узким терапевтическим диапазоном, в отличие от других ЛП, минимальная токсическая и минимальная терапевтическая различаются менее чем в 2 раза. Поэтому допустимые пределы признания БЭ на территории Европы [320] и Евразийского экономического союза [111] сужены до 90,00–111,11% из-за риска возникновения серьёзных нежелательных реакций. Для таких ЛП также целесообразно применять репликативный дизайн для подтверждения сходства в вариабельности фармакокинетических параметров тестируемого и референтного препарата [148, 213].

Создание воспроизведённых препаратов является одним из основных направленийфармацевтическойразработки.Дляподтверждениясходствапоказателейкачества,эффективностиибезопасностидженерикаиоригинального (референтного) препарата существуют три вида исследований: фармацевтической, фармакокинетической и терапевтической эквивалентности. При изучении таких лекарственных форм, как порошки, растворы для приёма внутрь, инъекционные растворы без модифицированного высвобождения, газы, лекарственных форм для местного действия достаточно подтверждения фармацевтической эквивалентности. Для большинства препаратов для перорального приёма, суппозиториев с резорбтивным эффектом, инъекционных растворов с модифицированным высвобождением проводят испытания

БЭ. При этом, возможна полная или частичная замена фармакокинетическо-

208

Глава 3. Фармацевтическая разработка лекарственных препаратов

го исследования in-vivo на ТСКР и использование процедуры «биовейвер» для ЛП, содержащих субстанции I и IIIкласса по БСК. КИ терапевтической эквивалентности не требуются для регистрации воспроизведённого ЛП и носят, как правило, пострегистрационный характер. Основными причинами получения небиоэквивалентных ЛП являются отличия физико-химических свойств АФС, состава вспомогательных веществ и технологии производства тестируемого и референтного препарата. Недостоверные результаты испытаний БЭ могут быть получены из-за ошибок при разработке биоаналитической методики и некорректном выборе дизайна исследования.

3.10. Подготовка регистрационного досье на лекарственный препарат

Современный путь создания и исследования эффективности и безопасности препарата осуществляется в соответствии с Надлежащими практиками (GLP, GCP, GMP), что обеспечивает гармонизацию процессов и валидность данных на международном уровне. Одним из важнейших завершающих процессов по выводу лекарственного препарата на фармацевтический рынок является подготовка и подача регистрационного досье – комплекта документов, содержащего всю информацию о лекарственном средстве.

Формирующийся общий рынок лекарственных средств на территории ЕАЭС основывается на принципах гармонизации и унификации требований законодательства государств-членов в сфере обращения лекарственных средств, в том числе на этапе регистрации препаратов [57]. Согласно Правилам регистрации и экспертизы лекарственных средств для медицинского применения (утверждены Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 №78) определены единые требования к порядку регистрации, подтверждения регистрации (перерегистрации), внесения изменений в регистрационное досье и экспертизы лекарственных препаратов (ЛП). В целях формирования общего рынка ЛС в рамках ЕАЭС определены требования к документам и данным регистрационного досье в формате общего технического документа, предоставляемого на регистрацию ЛП. Таким образом, определен стандарт предоставления информации о ЛП, согласованный на международном уровне и гармонизированный с требованиями регуляторных органов развитых стран [78, 219].

Интересен международный опыт интеграции данных о лекарственных препаратах. Регистрационное досье в формате общего технического документа основано на практике применения за рубежом ряда международных стандартов и спецификаций.

Общийтехническийдокумент–ОТД(англ.CommonTechnicalDocument, CTD) является одним из стандартов для обмена информацией о лекарственном препарате. Данный документ был разработан для досье при регистрациипрепаратовиприменяетсявЕвропе,ЯпониииCШA.Онбылразработан

209

Промышленная фармация. Путь создания продукта

EMA(EuropeanMedicinesAgency,Европейскоеагентствополекарственным средствам), FDA (Food and Drug Administration, Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств, CШA) и Министерством здравоохранения, труда и социального обеспечения (Ministry of Health, Labour and Welfare, Япония). ОТД включает в себя 5 модулей. Использование модульной системы позволяет более гибко и эффективно пользоваться инструментами по регистрации и внесению пострегистрационных изменений в данные о лекарственных препаратах.

Первый модуль является специфичным для страны, где используется документ, сформированный с соблюдением данного стандарта. Модули 2, 3, 4

и5 предназначены для использования во всех странах, принявших данный формат для обмена информацией.

Модуль №1 содержит административную информацию, такую как формы заявлений, информацию по качеству и информацию по производству, информацию относительно фармаконадзора, а также информацию о специалистах по качеству, доклиническим и клиническим данным. Содержимое

иформат этого модуля задаются регуляторными органами каждой из стран. Модуль №2 содержит выдержки из остальных модулей общего техниче-

скогодокумента.Вданноммодулеприводятсярезюмехимическойибиологической документации, доклинических и клинических данных, представленных в модулях 3–5 регистрационного досье лекарственного препарата и заключениях специалистов, подготовивших резюме по качеству, доклиническим и клиническим данным. Эти заключения относятся к трем следующим модулям документа: заключение по качеству, заключение по доклиническим исследованиям и заключение по клиническим исследованиям.

Модуль №3 содержит подробную информацию по качеству препарата. Это химические, фармацевтические и биологические данные об активных фармацевтических субстанциях и лекарственном препарате, включающие информацию о разработке, производственном процессе, характеристиках и свойствах,примесях,методикахитребованияхкконтролюкачества,стабильности,атакжеописаниесоставаиупаковкилекарственногопрепарата.Также в этот модуль включаются резюме относительно стабильности и выводы.

Сведения о ЛП включают описание и состав ЛП, сведения о фармацевтической разработке, используемые вспомогательные вещества. Сведения о процессе разработки состава, физико-химические и биологические свойства,данныеоразработкепроизводственногопроцесса,разработкесистемы упаковки/укупорки, микробиологические характеристики, совместимость с другими ЛП.

Также указываются производители используемых компонентов, состав на серию, описание производственного процесса и его контроля, контроль критических этапов и промежуточной продукции, валидация процесса и/или его оценка. Информация о том, как проводится контроль вспомогательных веществ, спецификации, аналитические методики, валидация аналитических методик, обоснование спецификаций, указываются вспомогательные веще-

210