Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии
.pdf
{ |
(8 ,. |
|
|
|
|
..,....'F. |
|
|
|
||
|
|
|
~~,.., |
.-.f 'I(('~ |
|
|
|
||
|
|
|
~~-~,.~ « |
: !",. |
.......Es |
Еа |
|||
|
|
|
|
W |
f" |
|
|
|
|
|
|
|
|
•.. |
~~~(; f |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Б |
В |
(8 |
,,8 ... |
|
|
|
||
|
|
|
|
||||||
А |
|
Г |
|
|
|
Д |
|||
Рис. 46. Строение. некоторых фермеНТОБ-МУЛЬТИМеров:
А-молежула rлутаматдегидрогеназы, составленная из 6 субъедипиц (M=S6000), распплшкеппых по граним правильноro тетраздра; молеЖУЛRpная масса фермента 336000; Б-модель молекулы РНК
полимеразы из шти субъедипиц; две типа а (М- по 40 000), две типа 1\ (1\- М = 150000 и 1\'- М = 155 000) и a-фаJ<ТОР (М=~OOO); В-схема строения половипы молекулы каталазы; каждая субъединица пред
ставлена дважды изогнутой палочковидной частицeil; r - полиферментный комплекс, ускоряющий реакцию окислительного деICарбоICСИЛИРОванlUI (см. с. \01, 160, 352-354); Д-аспартаТ-lCарбаМJUlТ
рапсфераза, составленная из 6каталитических (bl=33S00, обозначены С,-С.) в 6регуляторных (М= 17 000, обозначены R,-R.; R. и R. не видны) субъедвниц
Значения молекулярных масс ферментов колеблются в nrn:роких пределах:
от нескольких тысяч до нескольких МЙллионов. В природе насчитывается
несколько десятков ферментов, обладающих сравнительно небольnrn:ми моле
кулами (до 50 тыс.). Строение некоторых из них показано на рис. 34. Однако
больnrn:нство ферментов представлено белками более высокой молекулярной массы, построенными из субъединиц (рис. 46). Так, каталаза (М=252000)
содержит в молекуле шесть протомеров с М=42000 каждый. Молекула
фермента, ускоряющего реакцию синтеза рибонуклеиновых кислот (РНК-по
лимераза, М=475000), состоит из 5 неравных субъединиц. Полная молекула
глутаматдегидрогеназы, ускоряющей процесс окисления глутаминовой кисло
ты (М= 336 000), построена из 6 субъединиц С М = 56 000.
Способы компоновки протомеров в мультимеры разнообразны. Некото рые из них показаны на рис. 46. Крайне важно, что построенный из субъеди
ниц фермент проявляет максимальную каталитическую активность именно
ввиде мультимера: диссоциация на протомеры резко снижает активность
фермента. Не все ферменты-мультимеры построены исключительно из ката литически активных протомеров. Наряду с каталитическими в их составе
отмечены регуляторные субъединицы, как, например, у аспартат-карбамил трансферазы (рис. 46).
Среди Ферментов-мультимеров безусловно преобладают димеры и тетраме
ры (их несколько сотен), в меньшей мере распространены гексамеры и октамеры
(несколько десятков) и необыкновенно редко встречаются тримеры и пентамеры.
Молекулы Ферментов-мультимеров в ряде случаев составлены из субъединиц
двух типов, обозначаемых условно как субъединицы типа А и В. Они сходны друг
с другом, но отличаются по некоторым деталям первичной и третичной
структур. В зависимости от соотношения протомеров типа А и В в мультимере последний может существовать в виде нескольких изомеров, которые назьmают
изозвмами. Так, при четырех субъединицах возможны 5 изозимов:
1 |
JI |
III |
IV |
V |
АААА |
АААВ |
ААВВ |
АВВВ |
ВВВВ |
Это явление хорошо изучено у фермента, ускоряющего в мышцах превра щение молочной кислоты в пировиноградную и обратно:
Ою!сление
СНз-СН-СООН --- _ + _ I СНз-С-СООН
1 |
Восстановление |
11 |
ОН |
|
О |
МОЛОЧВaJI кислота |
|
Пнровивоградаа. |
|
|
кислота |
100
Так как окисление молочной кислоты (acidum lacticum) сопровождается
отнятием атомов Н, этот фермент называют лактатдегидрогеназоЙ. Молеку ла лактатдегидрогеназы (М= 140000) составлена из четырех субъединиц
(М=З5000), которые условно обозначают Н и М (от англ. hеаrt-сердце и musс/е-мышцы), так как из сердца и скелетных мышц выделены 1 и V ти пы лактатдегидрогеназы. Следовательно. изозимы лактатдегидрогеназы
таковы:
1 |
II |
III |
IV, |
V |
НННННННМ ННММ НМММ мммм
Они отличаются друг от друга по степени активности, некоторым физическим свойствам (например, молекулярной массе, электрофоретиче
ской подвижности), локализации в органах и тканях и т. п. В зависимости
от возраста, физиологического состояния и других причин в организме
устанавливается то или иное соотношение изозимов, которому соответст
вует определенный уровень активности фермента в целом. Изменение соот
ношения изозимов во всем организме или в отдельных тканях и органах
представляет, таким образом, один из способов регуляции действия фер
ментов.
В настоящее время интерес к изозимам резко повысился. Оказалось, что кроме генетически детерминированных изозимов существует большая группа
ферментов, обладающая множественными формами, возникающими в резуль
тате их посттрансляЦионной модификации (см. гл. УН). Множественные
формы ферментов и ИЗОзимы в частности используются сейчас для диагности ки болезней в медицине, прогнозирования продуктивности животных, подбора
родительских пар при скрещивании для обеспечения максимального гетерози
са в потомстве и т. п.
Значение пространственной организации ферментов особенно ярко вы
является при изучении строения так называемых мульmuэнзuмов, т. е.
ферментов, обладающих способностью ускорять одновременно несколько
химических реакций и осуществлять сложные превращения субстрата. Примером может служить мультиэнзим, ускоряющий реакцию окисли тельного декарбоксилирования пировиноградной кислоты (см. гл. VIII).
Этот многоферментный комплекс с М =4500000 состоит из трех видов
ферментов. Первый из нИХ (Е1) ускоряет реакцию декарбоксилирования
пировиноградной кислоты. В состав комплекса входит 12 димерных
молекул этого фермента (М = 192 000), изображенных на рис. 46, Г в виде
крупных белых шаров, расположенных попарно по периметру рисунка.
Второй и третий ферменты. катализирующие окислительно-восстанови
тельные процессы при окислении пировиноградной кислоты, сосредоточены
внутри мультиэнзимного комплекса. Один из них (Ез) представлен шестью
димерными |
молекулами (М=112000), другой |
(Е2)-24 протомерами |
(М=70000) |
(см. рис. 46, заштрихованные крупные и мелкие шары со- |
|
ответственно). |
. |
|
в тех случаях, когда мультиэпзимный комплекс обслуживает единый, многоступенчатый процесс биохимических превращений, его называют мета
болоном (от слова метаболизм-обмен веществ). Таковы метаболоны глико лиза (см. гл. VHI), биосинтеза ряда аминокислот (см. гл. УН), цикла дикарбо новых и трикарбоновых кислот (см. гл. VHI) и др.
В результате слаженного во времени и пространстве действия всех
трех видов входящих в его состав ферментов· мультиэнзим с огромной скоростью осуществляет превращение пировиноградной кислоты. Именно
101
в кооперативном характере каталитического процесса и кроется главное от
личие биокатализаторов от катализаторов неорганической природы, именно
поэтому интенсивность биокатализа в десятки, сотни и тысячи раз превос
ходит мощность действия неорганических катализаторов.
Сравнительно недавно выявлена еще одна своеобразная черта в строении
ферментов: некоторые из них являются полифункциональными, т. е. обладают
несколькими энзиматическими активностями, но всего лишь одной полипеп тидной цепью. Дело в том, что эта единая цепь при формировании третичной
структуры образует несколько функционально и стерически обособленных
глобулярных участков-доменов, каждый из которых характеризуется своей
каталитической активностью. В последующих главах будут приведены соот
ветствующие примеры.
При изучении мультиэнзимных комплексов и полифункциональны,," фер ментов удалось понять наиболее важную особенность ферментативного
катализа, а именно-эстафетную передачу промежуточных продуктов реак ции от одного компонента каталитической системы к другому без их
высвобождения.
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
Механизм действия однокомпонентных и двухкомпонентных ферментов
однотипен, так как активные центры в их молекулах функционально сходны
между собой.
Ведyuцую роль в механизме ферментативного катализа играет образо вание фермент-субстратных комплексов, на существование которых впервые
указал Д. Браун (1902). На первой фазе ферментативного катализа между
субстратом (или субстратами) и ферментом возникает соединение, в кото
ром реагенты связаны друг с другом ионной, icовалентной или иного типа связью. Затем (вторая фаза) субстрат под действием присоединенного к не
му фермента претерпевает изменение, делающее его более доступным для соответствующей химической реакции. На третьей фазе происходит сама химическая· реакция и, наконец, образовавшиеся продукты реакции на чет вертой фазе освобождаются из фермент-продуктного комплекса. Если обо
значить фермент Е, субстрат S, активированный субстрат S' и продукт
реакции Р, то указанная последовательность процессов выразится нижесле дующей схемой:
I 11 111 lV
E+S~ES~ES'~EP~E+P.
Эта схема была первоначально разработана В. Генри (1903), затем
л. Михаэлисом иМ. Ментен (1913) и подтверждена прямым выделением ES-,
ES' и ЕР-комплексов.
Одним из примеров ферментативного катализа, осуществляемого в со
ответствии с приведенной схемой, может служить реакция гидролиза аце
тилхолина. Это соединение служит медиатором (посредником) при передаче
нервных импульсов: в ответ на выделение окончанием нервного волокна
ацетилхолина следует ответная реакция возбуждения нервной клетки. Что бы этот процесс протекал непрерывно, после каждого акта передачи нерв
ного импульса вызвавшая возбуждение порция ацетилхолина (1-2 мкг) должна быть полностью разрушена. Это достигается посредством реакции
гидролиза ацетилхолина при участии фермента ацетилхолинэстеразы. lИд-
102
r |
в |
Рис. 47. Механизм действия ацетилхолииэстераэы: |
|
A-artИ8ныll центр фермента; |
Б-фермент-субстраТВWil I:омnnеас; B-ОО.ЦroТОIlП 1: преобразо_ИRlO |
(птиаиро_ввс) субстрат&; г-I:ОМIIЛCI:C продупов peuцп 1: ферментом (по_е...... 8 те"""е) |
|
ролиз осуществляется с |
огромной скоростью: 1-2 мкг ацетилхолина за |
0,1-0,2 мс: |
|
+
-_О СНз-СООН+НО-СН2-СН2- N(СНз)з
Yl:cycвaв |
XQJIIIII |
DCIIOтa
Ацетилхолинэстераза-одпокомпонентный фермент. В ее активном центре
сосредоточены по меньшей мере 4 аминокислотных радикала-глу. сер. гис
и тир, обеспечивающие последовательное осуществление перечисленных выше
этапов ферментативного катализа.
Сначала между ферментом (ацетилхолинэстераза) и субстратом (аце
тилхолин) возникает фермент-субстратный комплекс. он образуется за
счет электростатического· взаимодействия между отрицательно заряженной
103
ионизированной СООН-группой радикала 2ЛУ и положительно заряженным
атомом N молекулы ацетилхолина (рис. 47, 1, Б). После образования фер-.
мент-субстратного комплекса вступают в действие остальные аминокислот ные радикалы активного центра ацетилхолинэстеразы. В первую очередь замыкается связь между углеродом поляризованной CO-ГРУIПIы ацетильного
радикала холина и кислородом ОН-группы остатка сер. Затем возникает
водородная связь между кислородом сложноэфирной связи В молекуле ацеmл
холина и ОН-группой радикала тир (рис. 47, Il, В).
Расположение молекулы ацетилхолина и радикалов сер и тир в активном
центре фермента таково, что образование упомянутых связей ослабляет связь между СО-группой и атомом кислорода сложноэфирной связи в молекуле
ацетилхолина (эффект «дыбы»). В результате для ее разрыва требуется
гораздо меньше энергии, Т. е. энергетический барьер оказывается сниженным
вследствие активации молекулы ацетилхолина (ЕS'-комплекс). Поэтому под _ влиянием радикала 2ис, оттягивающего на себя протон от ОН-группы сер,
упрочняется сложноэфирная связь между радикалом сер и ацетильной
ГРУIПIой с одновременным разрывом сложноэфирной связи в молекуле
ацетилхолина и переходом протона от радикала тир к остатку холина
(рис. 47,111, Г). Последний высвобождается из активного центра (рис. 47,IV), а его место занимает молекула водыI. Она 6бразует связь с карБонильныIM
кислородом ацетильной группы и кислородом тир (на рис. 47 этот этап не
показан), после чего протон от остатка 2ис возвращается к кислороду
ОН-группы сер, а протон воды-к радикалу тир. Одновременно выделяется второй продукт реакции-уксусная кислота и регенерируется свободный
активный центр ацетилхолинэстеразы (рис. 47, lV, А), готовый к новому акту
катализа. |
. |
' |
в процессе образования фермент-субстратного комплекса и на дальнейших
фазах ферментативного катализа происходят неоднократные изменения тре тичной структуры фермента, приводящие к последовательному сближению
с субстратом и ориентации в пространстве тех активных групп, которые
взаимодействуют друг с другом на различных этапах преобразования субстра та. Изменение третичной структуры белка невозможно без участия всей или
почти всей полипептидной цепи, образующей белковую молекулу. Следова
тельно, в каталитическом акте принимает участие по существу вся или почти
вся молекула фермента.
Отдельные этапы взаимодействия фермента и субстрата при фермента тивном катализе все более проясняются. В частности, установлено, что за
стадией адсорбции субстрата в активном центре фермента наступает «уз
навание» субстратным центром фермента той части молекулы субстрата, которая непосредственно не подвергается химическому преобразованию. За
счет возникающих при этом многоточечных контактов, реализующихся
в виде сил слабого взаимодействия (гидрофобные, водородныIe и др.), связь
. субстрата с ферментом упрочняется. Одновременно с этим в активном
центре фермента «стабилизируется» та часть субстрата, которая в дальней
шем участвует в химической реакции,- она фиксируется в напряженной
конфигурации, близкой к переходному состоянию субстрата при превраще
нии его в продукт. В результате реагирующий фрагмент молекулы субстрата и каталитические группы фермента образуют продуктивный комплекс, где уже частично осуществлены электронно-копформационные переходы, необ
ходимые для протекания собственно химической стадии ферментативного процесса. Это приводит к понижению энергии активации, необходимой для осуществления химической реакции, благодаря энтропийному эффекту вслед ствие иммобилизации, закрепления, жесткой ориентации субстрата в актив-
104
iюм центре фермента. Таким образом, каждое звено в многостадийной
химической реакции, ускоряемой ферментом, создает почти оптщальные
условия для прохождения ее следующего этапа. Как следствие, химическая
реакция при ферментативном катализе идет в десятки, сотни тысяч раз
быстрее.
Рассмотрение тонкого механизма ферментативного катализа позволяет
понять специфику действия ферментов, отличающую их от катализаторов
неорганического происхождения. Уникальная структура и взаимодействие ка
талитического, субстратного и аллостерического центров фермента обеспечи
вает кооперативное осуществление многостадийных процессов. Именно упо рядоченность реакций в пространстве и времени, их кооперативный характер
отличают действие биокатализаторов, обеспечивая высокую специфичность
и скорость процесса в целом.
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
Под ферментативной кинетикой в широком смысле понимают зави
симость скорости реакции, ускоряемой ферментом, от химической природы
реагирующих· веществ (субстраты, фермент) и условий их взаимодействия
(концентрация, температура, .,Н среды, наличие активаторов или инги
биторов и т. п.). Однако зависимость скорости ферментативного процесса
от температуры, рН среды и влияния ингибиторов и активаторов в зна
чительной мере' связана с изменением свойств фермента как белкового
тела. Поэтому здесь будет освещен только вопрос о закономерностях,
определяемых природой и концентрацией реагирующих веществ и их из
менением.
Как показано выше, первой фазой биокаталитического процесса является
образование фермент-субстратного комплекса:
~+1
E+SI ) ES.
"-1
Эта равновесная система может быть охарактеризована соответствующей
константой· равновесия. Величину, обратную ей, называют константой дис
социации фермент-субстратного комплекса или субстратной константой
и обозначают Ка:
Ка=[Е] [S] I [ES].
Она зависит от природы субстрата и фермента и отражает степень их
сродства. Так, для сахаразы (фермент, ускоряющий реакцию гидролиза са
харозы) Ks =0,0167M, т. е. концентраЦJ:iЯ фермент-субстратного комплекса превышает концентрацию свободных фермента и субстрата примерно
в60 раз. Чем ниже значение К&, тем выше, следовательно, сродство фермента
ксубстрату.
Так как концентрация фермент-субстратного комплекса изменяется вслед
ствие перехода последнего в продукт реакции с регенерацией свободного
.фермента:
~+Z
ES-E+P,
то значение К& находят из соотношения констант скоростей прямой (k+1)
и обратной (k_ 1 ) реакций, т. е.
105
К указанному выводу можно прийти, приравнивая скорости прямой и обрат
ной реакций, что характерно для равновесного состояния системы:
V1 =k+~rftlrSl; v2=k_ 1 rES]. Если Vl =V2. то тогда k+ 1 [Е] [S]=k_ 1 [ES], т. е. [EJ ISJ7 [ES]=k_ 1 (k+1 =Ks•
Таким образом, субстратная константа, или константа диссоциации, фер
мент-субстратного комплекса (К.) характеризует биокаталитичеСJ:ИЙ про цесс с точки зрения сродства фермента и субстрата и соотношения кон стант скорости реакций распада и становления фермент-субстратного ком
плекса.
Так как одновременно с диссоциацией фермент-субстратного комплекса на
исходные вещества происходят превращения субстрата в продукт и распад
комплекса фермент-продукт на составляющие его компоненты:
для полной характеристики ферментативного процесса введено понятие о кон
станте Михаэлиса (К",), которая представляет отношение констант скоростей
всех трех реакций, осуществляющихся в процессе ферментативного катализа: К",= (k -1 +k + 2) / k + 1. к". всегда несхолько BЫIlle по числовому значению, чем
Ks• Так, Ks для комплекса сахаразы и сахарозы равно O,OI67M, а К", составляет
О,О280М.
Скорость химической реакции, ускоряемой ферментом (как и скорость обычной химической реакции), измеряют количеством молей субстрата, пре
вращаемых в единицу времени. Однако принципиально важно, чтобы при этом . поддерживались стандартные условия для проявления активности фермента:
температура 250 С, оптимальное значение рН и, что особенно существенно, полное насыщение фермента субстратом. Скорость ферментативной реакции, измеренной при соблюдении перечисленных условий, обозначают V и называ ют максимальной скоростью ферментативной реакции. Она определяется ков
центрацией ~~Meвтa и константой скорости распада комплекса фермент-про
дукт: V=k+2 Е].
Скорость ерментативной реакции, наблюдаемую при отсутствии пол
ного насыщения фермента субстратом, обозначают v. Она в каждый дан
0,1 |
0,2 |
0,3 |
0,+ |
Концентр(]цuя |
С!lбстрата [SJ,11110ЛЬ |
||
Рис. 48. Зависимость сжорости фермента ТИВНОЙ реакции от ICОlЩентрации субстрата при ПОСТОЯЮlОЙ ICОlЩентрации фермента
По дocrижении COCТO!IНBK васьпцеВИА фермента субсч>а
том скорость фермевтатввноil peIIIЩIIII достигает маК cntaJJЪBoro значсllИJl V в Ч'RВaII вдет парамcnьно 0С8
абсцисс
ный момент проп~~ональна концент-
рации фермент-су |
ашого комплек- |
са: v=k+2[ES]. Так как [ES]=
=k+1/k-l[Е][S], а k+1/k-l=l/KII, т. е.
[ES1=[E]rS]/K... то v=k+1[E][S]/KII.
Таким о~разом,наблюдаемаяскорость
ферментативнойреакции зависит отконцен трации ферментаисубстратаи ихсродства. Численно К'" равна той концентрации суб страта (в молях на литр), при которой v составляет 1/2V (рис. 48).
Концентрацию фермента и субстрата
выражают обычно в мшсромолях на литр.
Однако ввиду того, что точная молек:у лярная масса большинства ферментов и число каталитических (активных) цент
ров в их молек:улах неизвестны, применя
ют условный способ выражения абсоJПOТ ного :количества фермента. За единицу лю-
106
бого фермента (обозначаемую на русск. и нем. Е, а на англ., франц., итал.
и исп. U) принимают то его количество, которое в стандартных условиях
,катализирует превращение 1 мкмолъ субстрата в 1 мин. Эта величина (1 мкмоль/мин) является также единицей активности фермента. Указанная стан
дартная система обозначения количества фермента бьmа введена в 1961 г.
Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и прочно
вошла в ферментологию. Ею пользуются и поньmе. Как отмечено выше,
согласно этой системе скорость ферментативной реакции выражали числом
микромолей субстрата, превращаемых в 1 мин.
В 1972 Г., в связи с переходом на выражение скорости биокаталитических превращений в молях субстрата, преобразуемого в течение 1 с, было пред
ложено вместо старой, безымянной единицы ферментативной активности (Е или u) ввести новую единицу-катал (символ-кат), обозначающую количе
ство фермента, способное в течение 1 с обеспечить превращение 1 моля суб
страта (в стандартных условиях). Так как единица ферментативной активности в 1 кат, соответствующая скорости реакции 1 моль/с, мало реальна (превра
щения ИдУт с гораздо меньшей скоростью), каталитическую активность в но
вой системе едщlИЦ выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат)
и пикокаталах (окат), чему отвечают скорости реакций в микромолях, нано-
.молях и пикомолях В секунду соответственно. Старая единица (Е или U) равна
16,67 нкат. В течение ближайших лет предполагают осуществить переход на
выражение ферментативной активности вкаталах.
Концентрацию фермента в растворе в указаlШЫХ единицах (Е) выражают числом их в 1 мл раствора. В случае сухого препарата фермента приводят данные о количестве Е на 1 мг. Если в препарате фермента определено
содержание белка, то высчитывают удельную активность ферментного препа
рата, выражаемую числом Е на 1 мг белка. При наличии данных о числе
Е в 1 мг чистого фермента говорят об удеJJЬНОЙ активности фермента. Если
известна молекулярная масса фермента, то |
легко рассчитать число Е на |
1 ~моль его, т. е. молекулярную актнвность |
фермента. Следовательно, речь |
Идет уже не о выражении концентрации фермента, а о выражении активности
фермента либо числом микромолей субстрата, превращенных в 1 мин 1 мг фермента (удельная активность фермента), либо числом молекул субстрата, превращенных в 1 мин одной молекулой фермента (молекулярная актив
ность).
Если известно, сколько активных центров находится в молекуле фермента,
активность его характеризуют числом молекул субстрата, превращенныIx при
посредстве одного активного центра. Так, молекулярная активность каталазы
равна 5 млн., тогда как активность ее каталитического центра (их в молекуле
каталазы 4) составляет всего 1 млн. 250 тыс. молекул Н2О2•
свойcrВА ФЕРМЕНТОВ
Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Вместе с тем биокатализаторы характеризуются рядом специфических качеств, тоже выте кающих из их белковой природы. Эти качества отличают ферменты от ката лизаторов обычного типа. Сюда относятся термолабилъность ферментов,
зависимость их действия от значения рН среды, специфичность и, наконец, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.
Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с ОДIЮЙ
стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоких значениях к денатурации белка и снижению каталитической функции,
•
107
v.НКНОЛЬ/НUН
0,10
о 10 |
20 80 lНl |
50 60 t=C |
|
Рис. 49. Влияние температуры на |
Рис. 50. Влияние рН среды на ак |
||
активность |
фермента |
(пояснение |
тивность фермента |
втексте)
ас другой стороны, оказьmает влияние на скорость реакции образования фермент-субстраmого комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилemno катализа.
Зайисимость каталитической активности фермента от температуры вы
ражается типичной кривой (рис. 49). По характеру кривой видно, что до некоторого значения температуры (в среднем до 500 С) каталитическая ак тивность растет, причем на каждые 100 С примерно в 2 раза повышается . скорость преобразования субстрата. В то же время постепенно возрастает количество инактивированноro фермента за счет денатурации его белковой
части. При температуре выше 500 С денатурация ферментного белка резко
усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся КОJШчеством превращенного суб
страта, падает.
Детальные исследования роста активности ферментов с повышением тем
пературы, проведенные в последнее время, показали более сложный характер
этой зависимости, чем указано выше: во многих случаях она не отвечает
правилу удвоения активности на каждые 100 С в основном из-за постепенно
нарастающих конформационных. изменений в молекуле фермента. .
Температура, при которой каталитическая активность фермента максима
льна, назьmается его температурным оптимумом.
Температурный оптимум для разJШчных ферментов неодинаков. В общем
для ферментов животного происхождения он лежит между 40 и 500 С, а расти тельного-между 50 и 600 с. Однако есть ферменты с более высоким темпера
турным оптимумом, например у папаина (фермент растительного проИсхож.,
дения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум находится при 800 с. В то же время у каталазы (фер~ент, ускоряющий распад Н2О2 дО "20 И 02) оптималь ная температура действия находится между О и 100 С, а при более ВЫСоких
температурах происходит энергичное окисление фермента и его инактивация. Зависимость активности фермента от значения рН среды была установлена свыше 50 лет назад. Для каждого фермента существует оптимальное значение
рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большин ство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от
нейтральной точки. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работа
ют лишь некоторые ферменты (табл. 10).
•
108
Таблица 10
Оптимальные значении рН среды дли некоторых ферментов
ФермеНl |
|
Характер катализируемой реакции |
рН |
|
|
|
|
Пепсин |
Гидролиз белка |
1,5-2,5 |
|
Липаза (из семин клещевины) |
Гидролиз жиров |
4,7-5,0 |
|
Уреаза |
» |
мочевины |
7,0 |
Трипсин |
» |
белка |
7,8 |
Арrиназа |
» |
арrинина |
9,5-9,9 |
|
|
|
|
Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концент
рации водородных ионов сопровождается более или менее равномерным
падением активности фермента. На рис. 50 представлена кривая, выражающая типичную зависимость каталитического действия фермента от рН среды.
Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях
рН в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами
полипептидной цепи белковой части фермента и т. п. Кроме того, рН среды
влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного |
комплекса |
и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние |
фермента, |
определяя соотношение в нем катионных и аНйОННЫХ центров, что сказывается
на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслу
живает особого внимания, так как определенная третичная структура белка
фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса.
СпециФичность-одно из наиболее выдающихся качеств ферментов. Это
свойство их было открыто еще в прошлом столетии, когда бьmо сделано
наблюдение, что очень близкие по структуре вещества- пространственные изомеры (tX- и J3-метилглюкозиды) расщепляются по эфирной связи двумя
совершенно разными ферментами:
II-Метилrлюкозид |
/l-Метилrлюкозид |
(rидролизуетси по эфирной |
(rидролизуетси по эфирной |
сви]и ферментом из солода) |
свизи ферментом из семин |
|
ropbKoro миндали) |
Таким образом, ферменты могут различать химические соединения, от
личающиеся друг от друга очень незначительными деталями строения, та
кими, например, как пространственное расположение метоксильного радикала
и атома водорода при l-M углеродном атоме молекулы метилглюкозида.
По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической
литературе, фермент подходит к субстрату, как КЛЮЧ к замку. Это знаменитое правило бьmо сформулировано Э. Фишером в 1894 г. исходя из того, что специфичность действия фермента предопределяется cтpomM соответствием геометрической структуры субстрата и активного центра фермента.
В 50-е годы нашего столетия это статическое представление было заменено
гипотезой д. Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента.
109