мин.) или щелочной метиленовый синий по Леффлеру(3-5 мин.). Простая окраска позволяет быстро и хорошо ознакомиться с общей морфологией микробов, поэтому этот способ применяется в лабораториях наиболее часто.

Сложные методы – это те, при которых на один и тот же препарат воздействуют несколькими разными по химическому составу и цвету красителями, а также могут использоваться протравы и дифференцирующие веществ. Сложные методы позволяют выявить определенные структуры клеток и дифференцировать один вид микроорганизмов от другого, а также окрасить микробы, не красящиеся простыми методами. К сложным методам относятся следующие: метод Грама, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешки, Рома- новского-Гимзы.

ЗАНЯТИЕ № 2.

ТЕМА: СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ ОБЯЗАТЕЛЬНЫХ СТРУКТУР БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ. СУЩНОСТЬ И ТЕХНИКА ОКРАСКИ ПО МЕТОДУ ГРАМА. СТРОЕНИЕ И ЗНАЧЕНИЕ КАПСУЛЫ. СУЩНОСТЬ И ТЕХНИКА ОКРАСКИ ПО БУРРИ-ГИНСУ.

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОБЯЗАТЕЛЬНЫЕ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.

Для этого надо знать:

1.Структура бактериальной клетки изучена при помощи электронной микроскопии и благодаря технике приготовления ультратонких срезов.

К обязательным или постоянным структурам бактериальной клетки относятся: клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), цитоплазма, нуклеоид, мезосомы, рибосомы. К необязательным или дополнительным структурам бактериальной клетки относятся: капсула, жгутики, фимбрии (пили), споры, плазмиды, включения.

2.Клеточная стенка покрывает клетку снаружи. Это прочная и упругая поверхностная структура. Клеточная стенка придает определенную форму бактериальной клетке, обеспечивает механическую защиту, препятствует проникновению вредных веществ, участвует в поддержании осмотического давления,

втранспорте веществ, в питании и делении клетки, обусловливает антигенные свойства.

Химический состав и строение клеточной стенки бактерий значительно отличается от эукариотических клеток. Основу ее составляет пептидогликан (муреин). Именно пептидогликан обеспечивает механическую прочность и упругость клеточной стенки, что связано с особенностями его строения.

10

	Пептидогликан
1) тетрапептид	+	2) гетерополисахарид (гликан)
	ковалентная связь
L-аланин;		N-ацетилглюкозамин;
D-глутаминовая кислота;		N-ацетилмурамовая кислота;
D-аланин;

LL-диаминопимелиновая кислота (характерна только для бактерий)

Гетерополисахарид образует параллельно расположенные цепи, связанные между собой путем образования поперечных сшивок между тетрапептидами. В результате формируется прочная волокнистая структура. У раз-

ных групп бактерий клеточная стен-

ка отличается по химическому составу и строению. Это является важным систематическим признаком. Различ-

ное строение клеточной стенки -яв ляется основой разного отношения бактерий к окраске по Граму. По

этому признаку бактерии делят на грамположительные и грамотрицательные.

3.Грамположительные бактерии имеют толстую клеточную стенку (от 15 до 80 нм). Она состоит из многослойного пептидогликана, который составляет 40-90 % вещества клеточной стенки, а также в ней присутствуюттейхоевые кислоты и небольшое количество белков, липидов и полисахаридов.

4.Грамотрицательные бактерии имеют тонкую клеточную стенку(10-15 нм). В ней можно выделить три слоя: а) однослойный пептидогликан (2-3 нм), составляющий всего 5-10 % и находящийся в основании клеточной стенки; б) наружная мембрана – волнообразная структура, которая соединяется с пептидогликаном при помощи молекул липопротеидов( при этом общее количество липидов в клеточной стенке составляет10-20 %); наружная мембрана имеет такое же строение, как и ЦПМ: двойной слой фосфолипидов, в котором мозаично располагаются белки и липополисахариды; в) липополисахаридный слой, не закрывающий полностью фосфолипидный слой наружной мембраны.

Липополисахариды клеточной стенки состоят из: а) липида А, закрепленного в фосфолипидном слое наружной мембраны, который придает токсические свойства бактериям (является эндотоксином); б) полисахарида, который состоит из ядра(основной части) и специфического олигосахарида(О- специфическая цепь), построенного из 3-4 остатков сахаров, повторяющихся несколько раз. Полисахарид определяет антигенные свойства бактерий(серовар). Всю толщу наружной мембраны пронизывают белки– порины, ограничивающие гидрофильные каналы, служащие для диффузии веществ.

Между клеточной стенкой и ЦПМ находится периплазматическое про-

11

странство, в котором находятся экзоферменты.

5.ЦПМ бактериальной клетки имеет типичное трехслойное строение; ее основу составляет двойной слой фосфолипидов, покрытый с двух сторон белками. Белки могут частично или полностью погружаться в липидный слой или пронизывать его насквозь.

ЦПМ выполняет следующие функции: а) участвует в регуляции осмотического давления и водно-солевого обмена; б) участвует в активном транспорте

различных веществ при помощи пермеаз и за счет создания градиента концентрации ионов на мембране при помощиNa+, K+-АТФазы; в) участвует в метаболических процессах (таких как синтез веществ клеточной стенки, окислительное фосфорилирование), т.к. в мембране находятся белки-ферменты; г) участвует в делении клетки (репликация ДНК, деление нуклеоида); д) участвует

вспорообразовании у спорообразующих бактерий.

6.Цитоплазма – сложный зернистый коллоидный раствор, заполняющий полость клетки, в которой находятся органеллы. В растворе содержатся белки, ферменты, РНК, ДНК, пигменты и другие органические, а также неорганические вещества. Вода составляет 70-80 % цитоплазмы. Цитоплазматический раствор (цитозоль) это не только место хранения биомолекул, в нем протекают и некоторые важнейшие метаболические процессы (гликолиз, синтез жирных кислот, некоторых аминокислот и др.). Цитоплазма объединяет в одно целое нуклеоид и другие органоиды клетки, обеспечивает их взаимодействие и деятельность клетки как единой целостной живой системы.

7.Нуклеоид – эквивалент ядра, содержит одну молекулу ДНК, представляющую собой двойную спираль, замкнутую в кольцо и плотно упакованную в

виде клубка (М.в. 2-3 ´ 109), а также РНК и негистоновые белки; не имеет мембраны, ядрышка, не делится митозом.

Нуклеоид участвует в хранении и передаче наследственной информации и является как бы одной кольцевой хромосомой, поэтому бактериальные клетки гаплоидны. В зависимости от фазы развития в клетке может быть от1 до 2-4 нуклеоидов.

В других участках цитоплазмы могут находиться особого рода молекулы ДНК – плазмиды, отвечающие за передачу ряда признаков (например, лекарственной устойчивости); они не являются жизненно необходимыми.

8.Рибосомы – рибонуклеопротеидные частицы, участвующие в биосинтезе белка; размер составляет 20 нм; имеют округлую или слегка удлиненную форму; состоят из двух субъединиц (малой и большой); их коэффициент седиментации в отличие от рибосом эукариот составляет70 S. Некоторые антибиотики избирательно связываются с рибосомами бактерий, блокируя бактериальный синтез и не оказывая влияния на синтез белка эукариотических клеток. В цитоплазме клетки содержится до10000 рибосом (что и придает ей зернистость); они могут объединяться по 10-20 рибосом, образуя полисомы.

9.Мезосомы – производные ЦПМ, образуются путем ее впячивания внутрь клетки (инвагинации) и последующего закручивания; имеют форму клубков, петель и пузырьков (везикулярное строение), пластинок (ламеллярное строение), трубочек (тубулярное строение); они остаются связанными с ЦПМ и

12

образуют связь с нуклеоидом.

Основные функции: участвуют в делении клетки, в секреции веществ, в спорообразовании, обеспечивая эти процессы энергией. Полагают, что в мембранах мезосом находятся ферменты дыхания, а у фотосинтезирующих бактерий – и пигменты фотосинтеза. Т.о., мезосомы участвуют в организации и координации определенных ферментных систем в клетке.

Задача 2. ОБЪЯСНИТЬ ПОНЯТИЯ ПРОТОПЛАСТЫ, СФЕРОПЛАСТЫ И L-ФОРМЫ.

Для этого надо знать:

1.При нарушении синтеза клеточных стенок бактерий под влиянием фермента лизоцима или антибиотика пенициллина, которые нарушают синтез пептидогликана, а также под влиянием защитных факторов макроорганизма образуются клетки с измененной, часто шаровидной формой.

2.Протопласты – это бактерии, полностью лишенные клеточной стен-

ки, а сферопласты – бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Они становятся осмотически хрупкими, более проницаемыми, менее биохимически активными и не способными к делению. После удаления ингибитора синтеза клеточной стенки они могут реверсировать, т.е. приобретать клеточную стенку и восстанавливать исходную форму.

3. Бактерии сферопластного и протопластного типов, утратившие способность к синтезу пептидогликана под влиянием антибиотиков или других факторов, но способные к размножению, называются L-формами.

L-формы получены у многих разнообразных бактерий– палочек, кокков и др. При этом они становятся морфологически неразличимыми, их внешний вид одинаков – шаровидные клетки разной величины, в том числе и проходящие через бактериальные фильтры, осмотически чувствительные, у крупных клеток часто имеются вакуоли.

Нестабильные L-формы сохраняют некоторые элементы клеточной стенки и способны к реверсии в исходный вид. Стабильные L-формы не способны к реверсии.

Задача 3. ОБЪЯСНИТЬ СУЩНОСТЬ МЕТОДА И ТЕХНИКУ ОКРАСКИ ПО ГРАМУ.

Для этого надо знать:

1.Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диагностическое значение при исследовании бактерий и широко используется в микробиологии. Различают грамположительные и грамотрицательные бактерии.

2.Сущность окраски по Граму. Различное отношение бактерий к окраске по Граму определяется различным строением и химическим составом клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Т.к. грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке мало липидов, красители хорошо впитываются клеточной стенкой, при этом комплекс генцианового фиолетового и йода прочно связывается с большим количеством пептидогликана и присутствующими тейхоевыми кислотами. После обработки

13