шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д. Работа по получению этих культур менее трудоемка, клетки их одинаковы и стабильны в своих свойствах; они способны размножаться в течение длительного срока в лабораторных условиях и сохранять свои свойства в замороженном состоянии (t° = -70° C) в течение многих лет;

Первичные и перевиваемые линии клеточных культур могут быть контаминированы микоплазмами и неизвестными вирусами, среди которых встречаются онкогенные (вирус SV40 в культуре почечных клеток обезьян). Возможность внесения в организм человека вместе с вакциной онкогенных вирусов резко ограничивает использование перевиваемых линий клеточных культур в производстве вирусных вакцин и требует проведения соответствующих контролей.

в) полуперевиваемые – клетки этих культур способны размножаться в течение50 пассажей (перевивок), сохраняя исходный диплоидный набор, типичный для соматических клеток используемых тканей; для их приготовления используют диплоидные клетки человека (фибробласты человеческого эмбриона, диплоидные клетки легких человека).

Диплоидные клетки не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых; они нашли широкое применение в вирусологии, особенно в производстве вакцин.

3.Для выращивания клеточных культур необходимы клеточные среды сложного состава (минеральные соли, глюкоза, аминокислоты, витамины, кофакторы; вносят сыворотку крови и буферные растворы, антибиотики для предотвращения бактериального загрязнения). К ним относятся среда 199, среда Игла, среда Тироде.

4.Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики во избежание заноса в них различных микроорганизмов из окружающей среды. Для предотвращения загрязнения культуры бактериальной флорой к ней добавляют антибиотики (пенициллин, стрептомицин).

5.После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток, которая начинает

расти и размножаться, и изучения ее под микроскопом(´8) культуру заражают 1 мл вируссодержащего материала. Пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой и в наклонном положении помещают в термостат при 37° С на 5-7 суток.

Задача 4. ОПИСАТЬ СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ В ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЕ.

Для этого надо знать:

1.После внесения вируса (заражения) в тканевую культуру он проникает в клетки,

вкоторых интенсивно репродуцируется, повреждая клетки.

2.Репродукцию вирусов в культуре клеток можно обнаружить по следующим при-

знакам:

а) цитопатическое действие (ЦПД) – наблюдаются морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток), при этом часть из них погибает и отслаивается от поверхности стекла, в результате вместо сплошного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточные островки; ЦПД

обнаруживается микроскопически (´8) и служит не только для обнаружения, но и для идентификации вирусов, поскольку характер цитопатических изменений для разных ви-

34

русов неодинаков; например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток;

б) образование включений в клетках культуры – в ядре или цитоплазме образуются скопления вирусных частиц, имеющие различную форму и размеры(от 0,25 до 25 мкм); они могут быть выявлены в препаратах, приготовленных из ткани и окрашенных по Романовскому-Гимзе или флюорохромами;

в) способность к гемадсорбции – инфицированная культура клеток способна адсорбировать эритроциты, что хорошо видно под микроскопом; вирусы выходят на поверхность клеток, в которых они репродуцировались и связывают эритроциты, что позволяет судить о репродукции вирусов даже при отсутствии ЦПД; взвесь эритроцитов добавляют в культуру и после некоторого контакта промывают физиологическим -рас твором; на поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;

г) реакция гемагглютинации – скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок под влиянием вирусов, содержащих в своей оболочке гемагглютинин (см. выше); их обнаруживают в культуральной жидкости клеточной культуры;

д) "цветная" реакция – клетки выращиваются на среде с индикатором (метиленовым красным), который изменяет цвет(с красного на желтый) под влиянием кислых продуктов метаболизма при росте незараженных клеток; при репродукции вируса нарушается нормальный метаболизм, рН не сдвигается и сохраняется первичный(красный) цвет среды.

Задача 5. ОПИСАТЬ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕТРАЦИИ ВИРИОНОВ.

Для этого надо знать:

1.Проводят определение количества вирионов в 1 мл среды (титр вируса).

2.Используется 2 метода:

а) титрование по ЦПД: клетки культуры заражают 10-кратным разведением вируса; после 6-7-дневной инкубации просматривают на наличие ЦПД; за титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в50 % зараженных культур; титр выражают количеством цитопатических доз (ЦПД50);

б) метод "бляшек": культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара, что ограничивает распространение вирусов после выхода их из клетки, и инфицируются только соседние клетки; после инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются"стерильные пятна" – просветленные участки определенной формы – участки погибших клеток в сплошном монослое клеточной культуры – "бляшки". Считается, что одна "бляшка" – потомство одной вирусной частицы; она хорошо заметна в виде светлого круглого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным; титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, форма и сроки появления отличаются у разных видов вирусов и штаммов, что используется для идентификации.

35

Задача 6. ОПИСАТЬ ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РИККЕТСИЙ И ХЛАМИДИЙ.

Для этого надо знать:

1.Риккетсии и хламидии – бактерии – облигатные внутриклеточные паразиты. В отличие от вирусов размножаются простым делением, содержат оба типа НК(ДНК и РНК) и многие ферменты, необходимые для энергетического и пластического метаболизма. Риккетсии по типу дыхания – аэробные микроорганизмы, активно окисляют глутаминовую кислоту и не расщепляют глюкозу, имеют высокопроницаемую оболочку, что позволяет им получать из клетки-хозяина необходимые ферменты и метаболиты. Хламидии – энергетические паразиты клетки-хозяина, у них отсутствуют энергодающие ферментные системы.

2.Искусственные питательные среды даже самого сложного состава не могут удовлетворить потребности риккетсий и хламидий. Для их размножения необходимы живые метаболизирующие клетки, в отличие от вирусов, эти клетки должны обладать пониженной метаболической активностью.

3.Для выделения и культивирования риккетсий и хламидий применяются: а) тканевые культуры (описаны выше); б) куриные эмбрионы; в) восприимчивые лабораторные животные.

4.Культивирование риккетсий проводят на переживающих тканях в жидкой среде

Мейтлендов (раствор Тироде и сыворотка) при 37° С 10-14 дней или на Тиродесывороточном агаре с добавлением на поверхность измельченной эпителиальной ткани при 37° С 6-10 дней.

В тканевых культурах, пораженных риккетсиями, на 3-8-ой день отмечается большое количество коккобациллярных форм, заполняющих целиком цитоплазму или ядро клеток, которые затем гибнут. Хламидии обнаруживают в препаратах клеток, окрашенных по Романовскому-Гимзе, в которых наблюдают различные формы размножающихся организмов.

5.Для выделения риккетсий и хламидий широко используется их культивирование

в8-12-дневном курином эмбрионе; материал вводят в полость желточного мешка или на

хорион-аллантоисную оболочку. Зараженные яйца помещают в термостат при 37° С на 6- 7 дней. Этот метод используется для массового накопления риккетсий при изготовлении риккетсиозных препаратов (вакцин, диагностических антигенов).

6.Для получения большого количества риккетсий их культивируют в организме чувствительных лабораторных животных– заражают интраназально белых мышей, в легких которых накапливается необходимое количество риккетсий.

7.Риккетсии выращивают по методу Вейгля и Мосинга: платяных вшей заражают взвесью риккетсий путем введения в кишку через анальное отверстие с помощью специальных капилляров. Пшеничнов и Райхер разработали метод культивирования риккетсий на личинках вшей, которых кормят дефибринированной кровью с риккетсиями через мембрану кожи трупа.

Вопросы и упражнения для самоподготовки.

1.Где происходит размножение вирусов? Чем это объясняется?

36

2.Для чего применяют культивирование вирусов?

3.Почему вирусы не могут расти на искусственных питательных средах?

4.Назовите три основных способа культивирования вирусов.

5.Каким образом производят культивирование вирусов на животных?

6.Какие животные используются для культивирования вирусов?

7.Отчего зависит выбор метода заражения животных вирусами?

8.Как проводится индикация вирусов при их культивировании в организме животных?

9.Для чего используют, в основном, культивирование вирусов в организме животных?

10.Чем ограничивается метод культивирования вирусов в организме животных?

11.Почему куриный эмбрион очень удобен для культивирования вирусов?

12.Какими способами производят заражение куриных эмбрионов вирусами?

13.Каким образом соблюдаются асептические условия при заражении куриных эмбрионов?

14.Опишите заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость.

15.Опишите заражение куриного эмбриона на хорион-аллантоисную оболочку.

16.Опишите заражение куриного эмбриона в желточный мешок.

17.Опишите заражение куриного эмбриона в амниотическую полость.

18.Как проводится индикация вирусов при их культивировании в курином эмбрионе?

19.При помощи какой реакции можно установить присутствие вируса в аллантоисной жидкости куриного эмбриона?

20.Как проводится реакция гемагглютинации?

21.Для чего используется РГА?

22.Опишите положительный и отрицательный результат РГА.

23.Как производится вскрытие куриного эмбриона?

24.В чем недостатки метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах?

25.Что такое тканевая культура?

26.Какие ткани используются для приготовления тканевых культур?

27.В каких тканевых культурах проводится культивирование вирусов?

28.В чем заключается преимущество использования тканевых культур для культивирования вирусов?

29.Назовите три типа растущих тканевых культур.

30.Что такое однослойная тканевая культура?

31.Что такое культура суспензированных клеток?

32.Что такое органные культуры?

33.Какие тканевые культуры используются наиболее часто для культивирования вирусов?

34.Каким образом подразделяются однослойные тканевые культуры?

35.Что такое первичные культуры тканей?

36.Из каких тканей готовят первичные культуры тканей?

37.В чем заключаются преимущества и недостатки первичных тканевых культур?

38.Что такое перевиваемые культуры тканей? В чем преимущество перевиваемых тканевых культур?

39.В чем заключаются недостатки перевиваемых тканевых культур?

40.Назовите основные штаммы клеток для приготовления перевиваемых тканевых культур.

41.Из каких тканей готовят перевиваемые культуры?

42.Что такое полуперевиваемые тканевые культуры?

43.В чем преимущество полуперевиваемых тканевых культур?

44.Почему работу с тканевыми культурами необходимо проводить в строго асептических условиях?

45.Какие используются питательные среды для выращивания тканевых культур?

46.Как проводится выращивание тканевых культур?

47.По каким признакам судят о репродукции вирусов в тканевых культурах?

48.Что такое ЦПД?

49.Для чего используют ЦПД?

50.Почему ЦПД можно использовать для идентификации вирусов?

37

51.Почему наблюдается ЦПД при выращивании вирусов в тканевых культурах?

52.Для чего используется выявление вирусных включений в клетках культуры тканей?

53.Каким образом выявляют вирусные включения в клетках культуры?

54.Почему гемадсорбция является признаком присутствия вирусов в тканевой культуре?

55.Как проводится реакция гемадсорбции?

56.Что наблюдается при положительной реакции гемадсорбции?

57.Опишите использование цветной реакции для индикации вирусов в тканевых культурах.

58.О чем свидетельствует изменение цвета среды с культурой клеток?

59.Изменяется ли цвет среды при заражении культуры клеток вирусами и почему?

60.О чем свидетельствует сохранение первоначального цвета среды с культурой клеток?

61.Какие вирусы можно обнаружить в культуральной жидкости по РГА ?

62.Что используется для проведения реакции гемагглютинации?

63.Что такое титр вируса?

64.Какие методы используются для определения титра вируса?

65.Опишите титрование вируса по ЦПД.

66.Опишите титрование вируса методом "бляшек".

67.В каких единицах выражают титр вируса?

68.Почему для роста и размножения риккетсий и хламидий необходимы живые метаболизирующие клетки?

69.Какие методы применяются для культивирования риккетсий и хламидий?

70.Для чего используется культивирование риккетсий и хламидий?

71.Какие тканевые культуры используются для культивирования риккетсий?

72.Как проводится культивирование риккетсий в куриных эмбрионах?

73.Как проводится культивирование риккетсий в организме животных?

74.Как проводится культивирование риккетсий по методу Вейгля и Мосинга?

75.Как проводится культивирование риккетсий по методу Пшеничнова и Райхера?

38

Учебное издание

Е.Г. Доркина

Общая микробиология. Часть 2. Физиология микроорганизмов. Методические указания для самостоятельной (внеаудиторной) работы студентов 1 курса (очная форма обучения) по дисциплине С2.Б.11 – Микробиология

Технический редактор: Браташова Т. М.

Подписано в печать «___»__________ 2013 г.

Формат 60´84 1/16 Бумага кн.-журнальная. Печать ротапринтная. Усл.-печ. л.____

Уч.-изд. л. ___

Тираж ____ экз. Заказ №_____

Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357532 г. Пятигорск, пр. Калинина, 11.

39