42.Опишите механизм работы сред Гисса.

43.Почему набор сред Гисса с углеводами получил название "пестрого ряда"?

44.Какой "пестрый ряд" характерен для E. coli?

45.Опишите состав полужидких сред Гисса.

46.Какой индикатор добавляют в полужидкие среды Гисса?

47.Как и почему изменяется цвет индикатора в полужидких средах Гисса?

48.Перечислите дифференциально-диагностические среды, в состав которых входит лактоза.

49.Опишите механизм работы среды Эндо.

50.Для идентификации каких микроорганизмов чаще всего используются среды Эндо, Левина, Плоскирева?

51.По какому признаку определяется ферментация лактозы на молочных средах?

52.Какая среда используется для изучения интенсивного кислотообразования?

53.Какой индикатор добавляется в среду Кларка, и как изменяется его цвет?

54.По какому признаку можно обнаружить наличие амилазы у бактерий?

55.Что такое протеолитические свойства?

56.Какие среды используют для изучения протеолитических свойств бактерий?

57.Какие конечные продукты образуются при расщеплении белков бактериями?

58.Какой фермент присутствует у бактерий, способных разжижать желатин?

59.Каким образом способность разжижать желатин используется для идентификации бактерий?

60.Как определяют образование индола при расщеплении белков бактериями?

61.Как определяют образование H2S при расщеплении белков бактериями?

62.Как определяют образование аммиака при расщеплении белков бактериями?

63.Как выявляют способность бактерий расщеплять казеин?

64.Объясните суть методов выделения чистых культур бактерий.

65.Какие условия необходимо создать при выделении чистой культуры анаэробов?

66.В чем заключается работа 1-ого дня по выделению чистой культуры анаэробов?

67.В чем заключается работа 2-ого дня по выделению чистой культуры анаэробов?

68.В чем заключается работа 3-его дня по выделению чистой культуры анаэробов?

69.Какие методы посева используются для получения изолированных колоний анаэробов?

70.Как производится посев по методу Цейсслера?

71.Куда помещают чашки Петри после посева по методу Цейсслера?

72.Как производится посев по методу Вейнберга?

73.Как производят посев почвенной взвеси с использованием трубок Виньяля-Вейона?

74.По каким свойствам проводят исследование и идентификацию чистой культуры анаэробов?

ЗАНЯТИЕ № 9.

ТЕМА: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ, РИККЕТСИЙ И ХЛАМИДИЙ. СПОСОБЫ ИНДИКАЦИИ ВИРУСОВ В ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУРАХ.

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОПИСАТЬ СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ.

Для этого надо знать:

1.Культивирование вирусов необходимо для диагностики инфекционных заболеваний, для изучения патогенеза и иммунитета, для получения диагностических и вакцинных препаратов.

2.Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, поэтому их невозможно культивировать на искусственных питательных средах. Вирусы культивируют на уровне организма или в живых клетках. При этом используют клетки с повышенным метаболизмом.

30

3. Существуют три способа культивирования вирусов:

а) на лабораторных животных: применяют подкожный, интраназальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, субдуральный и др. методы заражения чувствительных к определенным вирусам животных: белых мышей (вирусы бешенства, энцефалита, гриппа), хорьков (вирусы гриппа), кроликов (вирус бешенства, натуральной оспы), обезьян (вирус полиомиелита); выбор метода зависит от тропизма вируса: например, респираторными вирусами заражают интраназально(закапывают вируссодержащий материал в нос), нейротропными – в головной мозг и т.д. Индикация (обнаружение) вируса проводится по развитию типичных признаков заболевания. На первых этапах развития вирусологии этот метод был единственным методом для изучения свойств и размножения вирусов. В наше время он используется для изучения патогенеза и иммунитета. Применение его ограничено, т.к. животные невосприимчивы к вирусам человека.

б) в куриных эмбрионах (метод Гудпасчура): исследуемый материал вводят в разные полости и ткани эмбриона; куриный эмбрион – очень удобный объект, т.к. защищен от попадания микроорганизмов из окружающей среды(стерильный) и других факторов; в нем отсутствуют скрытые вирусные инфекции; техника работы с ним проста; можно накопить большое количество вирусов. Но не все вирусы(вирус полиомиелита, вирус ящура) способны размножаться в куриных эмбрионах; невозможно обнаружить микроб без предварительного вскрытия эмбриона; в нем очень много белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку микроорганизмов при изготовлении различных препаратов.

в) в тканевых культурах: для их приготовления используют самые различные ткани человека, животных, птиц; чаще всего – эмбриональные и опухолевые ткани, обладающие повышенной метаболической активностью. Метод выращивания различных клеток вне организма на искусственных питательных средах разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток, при этом для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную к нему культуру клеток и создать стандартные условия.

Задача 2. ОПИСАТЬ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ В КУРИНОМ ЭМБРИО-

НЕ.

Для этого надо знать:

1.Для культивирования вирусов используют эмбрионы в возрасте от8 до 12 дней. Для выращивания эмбрионов оплодотворенные яйца помещают в термостат при38° С, в котором находится посуда с водой для создания влажности. Два раза в день яйца вынимают для проветривания. Периодически яйца просматривают в овоскоп на жизнеспособность. Живые эмбрионы отличаются подвижностью, пульсацией сердца, хорошо контурируемыми сосудами. Перед заражением эмбрион осматривают в овоскоп и намечают границы воздушного мешка, а также расположение зародыша.

2.Для предотвращения инфицирования эмбриона посторонними микробами заражение проводят в асептических условиях с использованием стерильного инструмента (ставят в стаканчик со спиртом) в помещении, облученном бактерицидными лампами. Скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают70 % спиртом, обжигают, смазы-

31

вают 2 % йодом, вторично протирают спиртом и обжигают. Вируссодержащий материал обрабатывают антибиотиками для удаления бактериальной флоры.

3. Существует несколько способов заражения куриного эмбриона. Чаще всего материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку и в желточный мешок.

При заражении в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц или скальпеля. Туберкулиновым шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Прокол в скорлупе заливают расплавленным парафином.

При заражении на хорион-аллантоисную оболочку ножницами вскрывается скорлупа над воздушной камерой, пинцетом приподнимается подскорлуповая оболочка и шприцем на оболочку наносят0,2-0,5 мл вируссодержащего материала при вертикальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, края которого замазывают парафином.

Заражение в амниотическую полость осуществляется длинной иглой через отверстие в воздушной камере. Иглу вводят в темной комнате под контролем овоскопа. При попадании иглы в полость эмбрион сдвигается. Заражение приводит к непосредственному контакту вируса с тканями эмбриона, поэтому в данном случае вирус размножается не только в полости, но и в тканях зародыша.

При заражении в желточный мешок вируссодержащий материал вводят иглой длиной 3-4 см, которой проделывают отверстие в воздушной камере. Иглу ведут к центру с небольшим отклонением книзу при горизонтальном положении эмбриона. Отверстие в скорлупе запаивают каплей парафина.

После инфицирования эмбрионы помещают в термостат при 37°С.

4.Через 48-72 часа (срок максимального накопления вирусов) производят вскрытие зараженных эмбрионов. Перед вскрытием эмбрионы оставляют на ночь при 4° С. После обработки скорлупы спиртом и 2 % раствором йода ее рассекают ножницами немного выше очерченной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость. Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматривают хорион-аллантоисную оболочку. Затем пастеровской пипеткой прокалывают эту оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, дважды промывают физиологическим раствором, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

5.О репродукции вируса судят по специфическому характеру поражений на хори- он-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, по РГА – реакции гемагглютинации (склеивание эритроцитов).

Особенно четко очаги поражения на хорион-аллантоисной оболочке появляются в месте заражения в виде геморрагий, белесоватых очагов (вирус кори или гриппа вызывает образование оспин на оболочке).

По РГА устанавливают присутствие вируса в аллантоисной жидкости. РГА основана на способности некоторых вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов и,

32

изменяя их поверхность, вызывать склеивание. РГА ставят на стекле или в пробирках: готовят двукратное разведение вируссодержащего материала, добавляют 1 % взвесь отмытых куриных эритроцитов и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 30-40 минут после оседания эритроцитов в контрольной пробе, в которую вместо вируссодержащего материала добавляют аллантоисную жидкость незараженного эмбриона. При гемагглютинации образуется зернистый осадок с фестончатыми краями, а в контроле – осадок в виде диска с ровными краями. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контроле указывает на присутствие вируса в исследуемой жидкости.

Задача 3. ОПИСАТЬ ТКАНЕВЫЕ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ.

Для этого надо знать:

1.Бывают культуры растущих тканей и переживающих тканей (утративших способность к росту), которые выращивают в жидкой среде или с плотным покрытием.

2.В зависимости от техники изготовления существуют три основных типа растущих тканевых культур:

а) однослойные тканевые культуры – клетки прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя, стелющегося по поверхности стекла лабораторной посуды;

б) культуры суспензированных клеток – клетки растут и размножаются во взвешенном состоянии при интенсивном перемешивании среды; их используют для большого накопления вирусов;

в) органные культуры или культуры фиксированных кусочковкусочки органов животных и человека, выращиваемых вне организма и сохраняющие свойственную им структуру.

3.Однослойные культуры – основные культуры, используемые в современной лабораторной и производственной вирусологической практике. По числу жизнеспособных генераций они подразделяются на:

а) первичные (первично-трипсинизированные) – клетки этой культуры используются в течение одной генерации, т.е. каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани; культуру готовят путем измельчения ткани, разъединения клеток при обработке тканей трипсином, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их размножение; при оседании клетки ткани легко и довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, на которой растут и распространяются в виде монослоя; чаще всего используют эмбриональные ткани(клетки типа фибробластов, почечная ткань эмбриона человека и обезьян, амниона человека, фибробласты куриного эмбриона, эмбриона мыши), а также ткани взрослого человека нормального или опухолевого происхождения;

б) перевиваемые – эти культуры можно поддерживать путем непрерывных перевивок, т.к. клетки хорошо адаптированы к условиям постоянного существования in vitro; их готовят из линий клеток, которые хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых клеток. Получено около 200 штаммов таких клеток: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы

33