66.Какие ферментативные свойства бактерий изучаются на средах Гисса?

67.Что такое чистая культура?

68.Почему выделение чистой культуры является основой бактериологической работы?

69.Какие существуют методы выделения чистой культуры?

70.На чем основаны биологические методы выделения чистой культуры?

71.На чем основаны механические методы выделения чистой культуры?

72.В чем заключается работа 1-ого дня по выделению чистой культуры аэробов?

73.В чем заключается работа 2-ого дня по выделению чистой культуры аэробов?

74.В чем заключается работа 3-его дня по выделению чистой культуры аэробов?

75.По каким признакам проводится идентификация чистой культуры?

ЗАНЯТИЕ № 7.

ТЕМА: РОСТ, РАЗМНОЖЕНИЕ И ДЫХАНИЕ БАКТЕРИЙ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБОВ

(II ЭТАП).

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕХАНИЗМ И СКОРОСТЬ РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1.Размножение – увеличение числа особей. Бактерии размножаются путем: а) деления клетки пополам (бинарного деления); б) почкования; в) фрагментации нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты).

2.Механизм бинарного деления заключается в следующем: перед делением происходит репликация ДНК с участием ферментов– ДНК-полимераз. Затем образовавшиеся две молекулы ДНК расходятся за счет увеличения размеров растущей клетки, и наступает деление самой клетки. При этом у грамотрицательных бактерий деление клетки осуществляется за счет образования перетяжки, а у грамположительных – перегородки при участии мезосом.

Клетки после деления расходятся в результатеаутолиза – расщепления сердцевины перегородки под действием ферментов. Если аутолиз протекает неравномерно, то клетки остаются частично связанными и расходятся не полностью. Они могут располагаться под углом друг к другу, как у дифтерийной палочки.

После некоторого числа генераций клетки стареют и погибают.

3.Скорость размножения различна у разных видов бактерий, чаще – очень высокая (в 100 раз выше, чем у клеток культуры тканей млекопитающих); у E. coli при благоприятных условиях время генерации составляет20 мин., у Clostridium perfringens и Streptococcus faecalis – 15 мин., а у Mycobacterium tuberculosis – 14-15 час. Скорость раз-

множения ограничена рядом факторов и зависит от характера среды, возраста, температуры, аэрации, наличия питательных веществ и накопления продуктов обмена.

Задача 2. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОСОБЕННОСТИ РОСТА И РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ В ЖИДКИХ И НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.

Для этого надо знать:

1.Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не

17

изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Такое культивирование называется периодическим, а культура – периодической. Если производить непрерывную подачу свежей питательной среды и отток такого же объема культуральной жидкости, то такая культура называется непрерывной.

2.Рост и размножение периодической культуры в жидкой питательной среде имеет несколько фаз, что можно изобразить в виде кривой зависимости логарифма числа клеток от времени.

I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения(4-5 часов); происходит адаптация к условиям размножения и увеличение размеров клеток.

II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий (5-6 часов); клетки делятся с постоянной скоростью, и логарифм числа клеток линейно зависит от времени; в этот период бактерии обладают высокой химической и биологической активностью, но слабой резистентностью.

III фаза – фаза стационарного роста – период равновесия межу делящимися, находящимися в покое и отмершими клетками; количество живых клеток остается без изменения и составляет максимальный уровень в единице объема(М-концентрация); продолжительность этой фазы выражается в часах и зависит от вида бактерий, особенностей культивирования; М-концентрация также зависит от вида бактерий и условий среды.

IV фаза – фаза гибели – период логарифмического снижения количества живых клеток (от 10 часов до нескольких недель); происходит отмирание клеток с постоянной скоростью.

V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток– период, когда остав-

шиеся в живых клетки переходят в состояние покоя.

3.Характер роста бактерий в жидких питательных средах может быть следующим: а) поверхностным – образование пленки (возбудители холеры и туберкулеза, сенная палочка); б) диффузным – равномерное помутнение среды(представители сем.

Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus); в) придонным – образование осадка (Bacillus anthracis).

4.При росте бактерий на плотной питательной среде образуются колонии. Колонии – это макроскопические скопления микробов одного вида, образовавшиеся из одной клетки. Колонии бывают разными по размеру, форме, цвету, поверхности, форме края, консистенции, структуре.

5.По размеру колонии бывают: а) крупные – d > 5 мм; б) средние – d = 2-4 мм; в) мелкие – d = 1-2 мм; г) карликовые (точечные) – d < 1 мм.

Форма бывает правильная круглая, неправильная, ризоидная, розеткообразная, звездчатая, древовидная и т.д.

Колонии могут быть бесцветными или имеют определенный цвет(белый, желтый, оранжевый, красный, золотистый, розовый), что определяется пигментами бактерий.

Поверхность может быть гладкая, морщинистая, блестящая, складчатая, сухая, влажная, слизистая, шероховатая, исчерченная, бугристая, выпуклая или плоская.

Края – ровные, фестончатые, зазубренные, волнистые, бахромчатые (их лучше изучать под микроскопом с малым увеличением).

Консистенция – слизистая (колония прилипает к петле), волокнистая (снимается

18

вся колония), мягкая, плотная, врастающая в агар, хрупкая (разрушается при прикосновении петли).

Структура – прозрачная, непрозрачная, зернистая, однородная (гомогенная) или различная в центре и по периферии (гетерогенная). Структуру лучше изучать с помощью стереоскопического микроскопа или под лупой.

6.Внешний вид колонии характерен для определенного вида бактерий и может изменяться в зависимости от условий. Колонии, имеющие ровные края и гладкую поверхность – колонии S-формы, а колонии с неровными краями и шероховатой поверхностью

–колонии R-формы. Внешний вид колоний у некоторых бактерий очень характерен и является дифференциальным признаком. Например, колонии возбудителя чумы имеют вид смятого кружевного платочка; микоплазмы образуют колонии, напоминающие яич- ницу-глазунью.

Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОБРАЗОВАНИЕ МИКРОБАМИ ПИГМЕНТОВ И ДРУГИХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ.

Для этого надо знать:

1.Некоторые микроорганизмы (бактерии и грибы почвы, воды и воздуха) вырабатывают пигменты – красящие вещества, которые участвуют в дыхании, как переносчики Н2, защищают от ультрафиолетовых лучей, участвуют в реакциях синтеза, оказывают антибиотическое действие. При выращивании этих микроорганизмов жидкая среда или колонии, образующиеся на плотных средах, окрашиваются в определенный цвет. Красный цвет имеют колонии Serratia marcescens; розовый – розовый микрококк; золотистый – S. aureus; синий – Pseudomonas aeruginosa, фиолетовый – хромобактер фиолетовый; желтый или оранжевый – микобактерии туберкулеза.

2.В морской воде (чаще всего) встречаются светящиеся бактерии. У этих микроорганизмов энергия окислительно-восстановительных реакций превращается в люминес-

ценцию (Photobacterium phosphoreum).

3.Некоторые бактерии обладают способностью синтезировать витамины, аминокислоты, антибиотики, летучие и ароматические вещества.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ АЭРОБНЫЙ И АНАЭРОБНЫЙ ТИПЫ ДЫХАНИЯ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Дыхание (биологическое окисление) – совокупность окислительновосстановительных реакций, идущих с образованием АТФ. Окисление – отдача водорода или электронов донорами. Восстановление – присоединение водорода или электронов акцепторами. Донорами являются сахара, спирты, органические кислоты, жиры, аминокислоты и др. Эти вещества называются субстратами дыхания. Акцепторами водорода могут быть кислород и другие вещества.

2.При аэробном типе дыхания акцептором водорода является кислород. Микроорганизмы с таким типом дыхания являются аэробами.

При анаэробном типе дыхания акцептором водорода являются другие соединения. Микроорганизмы с этим типом дыхания называются анаэробами.

3.Если в окислительно-восстановительных реакциях и донорами и акцепторами являются органические соединения (т.е. происходит неполное окисление), то такой про-

19

цесс называется брожением. Он протекает в анаэробных условиях.

При брожении чаще всего происходит расщепление глюкозы и других углеводов, но могут быть использованы также аминокислоты, жирные кислоты.

По конечному продукту различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожения. Молочнокислое брожение характерно для родов Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, маслянокислое – для рода Clostridium, пропионовокислое – для рода Propionibacterium. Спиртовое брожение осуществляется дрожжами (микроскопические грибы). Образование кислот в результате брожения в среде можно определить при помощи индикатора.

4. К анаэробам относятся:

а) облигатные анаэробы – клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка; они растут только в бескислородных условиях, кислород для них токсичен, т.к. отсутст-

вуют ферменты каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза, которые инактивируют токсичные формы кислорода и имеются у аэробных бактерий; для облигатных анаэробов характерно сульфатное дыхание, при котором акцептором водорода являются сульфаты, восстанавливающиеся до H2S;

б) факультативные анаэробы – большинство патогенных и сапрофитных бактерий (E. coli и др.); они растут как при наличии, так и при отсутствии кислорода; для них характерно нитратное дыхание, при котором акцептором водорода являются нитраты, восстанавливающиеся до N2 и NH3. Среди них имеются аэротолерантные формы, которые растут при наличии кислорода, но ни используют его.

5.Облигатные аэробы могут расти только при наличии достаточного количества кислорода в среде. К ним относятся бруцеллы, микрококки, микобактерии туберкулеза (для роста необходимо около 20 % кислорода).

6.Между аэробным и анаэробным типами дыхания нет резкой границы. При от-

сутствии кислорода дрожжи, например, способны расщеплять глюкозу до спирта и СО,

2

а при аэрации глюкоза ими расщепляется до СОи Н О (происходит полное окисление

2 2

глюкозы). При аэробном расщеплении выделяется значительно больше энергии, т.е. оно энергетически более выгодно, чем анаэробное расщепление.

С6Н12О6 ® 2 С2Н5ОН + 2СО2 + 31, 2 ккал С6Н12О6 + 6 О2 ® 6СО2 + 6Н2О + 688,5 ккал

Способностью переключаться с анаэробного дыхания на аэробное обладают и бактерии - факультативные анаэробы.

Задача 5. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ БЕСКИСЛОРОДНЫХ УСЛОВИЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ.

Для этого надо знать:

1.Для культивирования анаэробов необходимо создать условияанаэробиоза – пониженного содержания кислорода в среде и окружающем пространстве. Для этого используются физические, химические и биологические методы.

2.Физические методы основаны на физических и механических способах и приемах создания бескислородных условий. Для этого:

20