52.Почему аэробное дыхание является энергетически более выгодным?

53.Объясните взаимосвязь между аэробным и анаэробным типами дыхания?

54.Какие микроорганизмы называются облигатными анаэробами?

55.Какие микроорганизмы называются факультативными анаэробами?

56.Что такое сульфатное дыхание?

57.Что такое нитратное дыхание?

58.Приведите примеры облигатных и факультативных анаэробов?

59.Что такое аэротолерантность?

60.Какие ферменты защищают бактерии от активных форм кислорода?

61.У каких бактерий отсутствуют каталаза, супероксиддисмутаза и пероксидаза?

62.Какие бактерии называются облигатными аэробами?

63.Какие условия необходимы для культивирования анаэробов?

64.Какие существуют методы создания анаэробных условий?

65.Перечислите физические методы создания бескислородных условий?

66.Какие вещества добавляются в среды для связывания кислорода при выращивании анаэробов?

67.Какая среда используется для выращивания анаэробов?

68.Опишите состав среды Китта-Тароцци.

69.Как осуществляется приготовление среды Китта-Тароцци?

70.Для чего используется среда Китта-Тароцци?

71.Какими способами осуществляется посев в глубину плотных питательных сред?

72.Что такое анаэростат?

73.Каким образом создаются бескислородные условия в анаэростате?

74.В чем суть химических методов создания бескислородных условий?

75.В чем суть метода Фортнера?

ЗАНЯТИЕ № 8.

ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБОВ (III ЭТАП). МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ.

Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.

Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1.В бактериальной клетке протекают многочисленные химические реакции, совокупность которых обеспечивает обмен веществ и энергии между бактериальной клеткой

иокружающей средой, что является основой жизнедеятельности. Обмен веществ складывается из анаболических (синтетических) реакций и катаболических (распад веществ) реакций. Все эти реакции катализируются ферментами.

2.Ферменты – это биологические катализаторы. По химической природе они являются белками. Они обладают специфичностью действия, т.е. распознают свои, соответствующие им, субстраты и вступают с ними во взаимодействие. Ферменты отличаются чрезвычайно высокой активностью катализа(увеличивают скорость реакции в млрд. раз). Активность ферментов зависит от температуры, рН среды и других факторов. Оптимальное значение рН и температуры для роста микроорганизмов определяется -сум марным влиянием этих факторов на сотни ферментативных реакций в клетке. Ферменты локализуются в клетке в соответствии с локализацией тех процессов, в которых они уча-

23

ствуют (компартментализация), и связаны с определенными структурами клетки. В ЦПМ находятся окислительно-восстановительные ферменты, участвующие в дыхании, и транспортные ферменты, участвующие в питании (пермеазы). В клеточной стенке и лизосомах находятся ферменты, участвующие в делении клетки и аутолизе. С нуклеоидом связаны ферменты, участвующие в репликации ДНК.

Задача 2. ПРИВЕСТИ КЛАССИФИКАЦИИ ФЕРМЕНТОВ БАКТЕРИЙ.

Для этого надо знать:

1. Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

-1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные ре-

акции;

-2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных функциональных групп (радикалов) и молекулярных остатков от одних соединений к другим;

-3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления(реже синтеза) веществ на более простые соединения с участием воды (т.е. реакции гидролиза);

-4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;

-5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;

-6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых.

2.Ферменты бактерий классифицируют также на экзо- и эндоферменты. Эндоферменты катализируют метаболические процессы внутри кле.ткиЭкзо-

ферменты выделяются бактериями в окружающую среду. Эти ферменты: а) участвуют во внеклеточном переваривании; они расщепляют макромолекулы питательных веществ до простых соединений (глюкозы, аминокислот, жирных кислот), которые могут проходить через оболочку клетки и с помощью пермеаз ЦПМ передаваться в цитоплазму клетки для участия в метаболизме; б) выполняют защитную функцию; например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий; они разрушают ткани и клетки, обусловливают распространение в инфицированной ткани микроорганизмов и их токсинов; к ним относятся:

-гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту – составную часть основного вещества соединительной ткани;

-дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток;

-фибринолизин – расщепляет коллаген;

-плазмокоагулаза – свертывает плазму крови;

-нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту;

-лецитовителлаза – расщепляет лецитин.

3. Ферменты бактерий классифицируются также на конститутивные и индуцибель-

ные.

Конститутивные ферменты синтезируются в клетке с постоянной скоростью (непрерывно) вне зависимости от наличия субстратов в питательной среде.

24

Индуцибельные (адаптивные) ферменты синтезируются в клетке только при наличии в среде субстрата данного фермента. Так, у E. coli увеличивается содержание b- галактозидазы при выращивании на среде с лактозой, т.е. происходит индукция синтеза фермента.

Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ПО БИОХИМИЧЕСКИМ (ФЕРМЕНТАТИВНЫМ) ПРИЗНАКАМ.

Для этого надо знать:

1.Ферментный состав микроорганизмов определяется геномом и является достаточно постоянным признаком, поэтому его определение важно для дифференциации и идентификации микроорганизмов. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

2.Различия в ферментном составе гидролаз определяют различия таких биохимических свойств бактерий, как: а) сахаролитические свойства – способность разлагать сахара; б) протеолитические свойства – способность расщеплять белки.

Эти свойства выявляются по конечным продуктамрасщепления: образование щелочей, H2S, NH3 при расщеплении белков; образование кислот, СО2, Н2 при сбраживании углеводов.

3.Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н2О2 с образованием водорода и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н2О2.

Цитохромоксидаза – фермент, обеспечивающий перенос электронов на кислород

впроцессе аэробного дыхания. Активность ЦО учитывается при дифференциации бактерий сем. Enterobacteriaceae. Для обнаружения ЦО полоску фильтровальной бумаги сма-

чивают реактивом (1 % спиртовой р-р a-нафтола и 1 % р-р N-диметил-р- фенилендиамин дигидрохлорида в соотношении 2:3) и наносят суточную культуру микроорганизмов. О наличии ЦО судят по синему окрашиванию.

4. Таксономическим признаком для микроорганизмов служит также способность восстанавливать нитраты в нитриты(для определения нитритов используют реактив Грисса), наличие бутандиолового брожения на среде Кларка, для выявления которого используется реакция Фогеса-Проскауэра на ацетоин– промежуточный продукт брожения.

Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ САХАРОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР.

Для этого надо знать:

1.Сахаролитические свойства – это способность микроорганизмов ферментировать определенные углеводы с образованием органических кислот(молочной, уксусной, муравьиной) и газа (СО2 и Н2). Для многих микроорганизмов они служат таксономическим признаком.

2.Для определения сахаролитических свойств используются дифференциально-

25

диагностические среды – жидкие и полужидкие среды Гисса.

В эти среды добавляют углеводы(лактозу, глюкозу, мальтозу и т.д.) и различные индикаторы. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа– регистрируется также появление газообразных продуктов.

3.Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. При сбраживании сахара бактериями цвет среды в присутствии индикатора Андреде(интервал рН 7,2-6,5) изменяется от соломен- но-желтого (первоначальный цвет) до ярко-розового (красного). Если кроме кислоты происходит также образование газа, он скапливается в поплавке. При отсутствии ферментации цвет среды не изменяется.

Поскольку определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, то наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван"пестрым рядом". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Используют короткий и длинный "пестрый ряд". К первому относятся среды Гисса

сглюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и спиртом маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с моносахаридами (арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой и т.д.), полисахаридами (инулином, крахмалом, гликогеном и т.д.) и спиртами (глицерином, дульцитом, инозитом).

4.Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % МПА, 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды розоватосерый. При ферментации сахара цвет среды становится голубым, а при наличии и газообразования по ходу посева видны пузырьки газа, а сам агар разрывается.

Наиболее часто среды Гисса используют для дифференциальной диагностики бактерий кишечно-тифозной группы(для отличия патогенных представителей кишечнотифозного семейства от нормальных представителей, например E. coli).

5.Для изучения бактерий кишечной группы широкое использование получили дифференциально-диагностические среды, содержащие лактозу – среды Эндо, Левина и Плоскирева. Благодаря наличию у E. coli фермента, расщепляющего лактозу, колонии этого микроба изменяют цвет среды в присутствии того или иного индикатора(на среде Эндо колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет; на среде Левина – в темно-фиолетовый, на среде Плоскирева – в красный). До посева бактерий индикатор фуксин в среде Эндо обесцвечен сульфитом натрия и находится в лейкосоединении. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид. Он взаимодействует с сульфитом натрия, рвется двойная связь, соединяющая его с фуксином, и фуксин восстанавливается.

6.Ферментация лактозы может быть изучена при посеве культуры на молоко: обезжиренное молоко подщелачивают 10 % р-ром карбоната натрия и добавляют в качестве индикатора лакмусовую настойку, разливают по пробиркам и стерилизуют дробным методом. При росте микробов на молоке можно наблюдать подкисление или подщелачивание, свертывание или пептонизацию.

7.Для обнаружения интенсивного кислотообразования, характерного для броже-

26