- •ЗАНЯТИЕ № 6.
- •ТЕМА: ТИПЫ И МЕХАНИЗМЫ ПИТАНИЯ БАКТЕРИЙ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБОВ (1-ЫЙ ЭТАП).
- •Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.
- •Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 2. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ФУНКЦИИ ОСНОВНЫХ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.
- •Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ТИПЫ ПИТАНИЯ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ПОЛУЧЕНИЕ ЭНЕРГИИ У ФОТОАВТОТРОФОВ, ХЕМОАВТОТРОФОВ, ХЕМО(ОРГАНО)ГЕТЕ-РОТРОФОВ.
- •Задача 5. ДАТЬ ПОНЯТИЯ ПРОТО- И АУКСОТРОФНОСТИ.
- •Задача 6. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕНОСА ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В БАКТЕРИАЛЬНУЮ КЛЕТКУ.
- •Задача 7. ОПИСАТЬ УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 8. ПРИВЕСТИ КЛАССИФИКАЦИЮ И ДАТЬ ХАРАКТЕРИСТИКУ РАЗЛИЧНЫМ ПИТАТЕЛЬНЫМ СРЕДАМ.
- •Задача 9. ОПИСАТЬ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД.
- •Задача 10. ДАТЬ ПОНЯТИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ, КОЛОНИИ, КЛОНА, ШТАММА.
- •Задача 11. ОПИСАТЬ ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ.
- •Вопросы и упражнения для самоподготовки.
- •ЗАНЯТИЕ № 7.
- •Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.
- •Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕХАНИЗМ И СКОРОСТЬ РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 2. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОСОБЕННОСТИ РОСТА И РАЗМНОЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ В ЖИДКИХ И НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.
- •Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ОБРАЗОВАНИЕ МИКРОБАМИ ПИГМЕНТОВ И ДРУГИХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ.
- •Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ АЭРОБНЫЙ И АНАЭРОБНЫЙ ТИПЫ ДЫХАНИЯ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 5. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ БЕСКИСЛОРОДНЫХ УСЛОВИЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ.
- •Вопросы и упражнения для самоподготовки.
- •ЗАНЯТИЕ № 8.
- •ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АЭРОБОВ (III ЭТАП). МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ.
- •Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.
- •Задача 1. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 2. ПРИВЕСТИ КЛАССИФИКАЦИИ ФЕРМЕНТОВ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 3. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ПО БИОХИМИЧЕСКИМ (ФЕРМЕНТАТИВНЫМ) ПРИЗНАКАМ.
- •Задача 4. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ САХАРОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР.
- •Задача 5. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ.
- •Задача 6. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В МЕДИЦИНЕ И ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ.
- •Задача 7. ОХАРАКТЕРИЗОВАТЬ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ.
- •Для этого надо знать:
- •Вопросы и упражнения для самоподготовки.
- •ЗАНЯТИЕ № 9.
- •ТЕМА: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ, РИККЕТСИЙ И ХЛАМИДИЙ. СПОСОБЫ ИНДИКАЦИИ ВИРУСОВ В ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУРАХ.
- •Задачи для самоподготовки с алгоритмами решения.
- •Задача 1. ОПИСАТЬ СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ.
- •Задача 3. ОПИСАТЬ ТКАНЕВЫЕ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ.
- •Задача 4. ОПИСАТЬ СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ В ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЕ.
- •Задача 5. ОПИСАТЬ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕТРАЦИИ ВИРИОНОВ.
- •Задача 6. ОПИСАТЬ ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РИККЕТСИЙ И ХЛАМИДИЙ.
б) облегченная диффузия – происходит при большей концентрации веществ вне клетки при участии пермеаз;
в) активный транспорт – осуществляется против градиента концентрации с затратой энергии при помощи транспортных белков;
г) транслокация химических групп – в процессе переноса через мембрану молекула вещества химически изменяется, т.к. в исходном виде эти вещества не проходят через мембрану (например, фосфорилирование глюкозы).
Задача 7. ОПИСАТЬ УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ.
Для этого надо знать:
1.Для изучения разнообразных свойств микроорганизмов в лабораторных условиях их искусственно выращивают, т.е. культивируют.
2.При культивировании микробам должна быть обеспечена возможность расти, размножаться и проявлять свою жизнедеятельность. Для этого необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий.
3.Состав и свойства питательных сред должны соответствовать биологическим свойствам тех микроорганизмов, для выращивания которых они предназначены.
В качестве источника азота используются минеральные и органические соединения; для патогенных бактерий используют такие источники органических соединений, как мясо, рыба, плацента, кровь, дрожжи, кукуруза, ячмень. Так как все эти вещества должны быть в легко усвояемом для микробов виде, белки подвергают частичному расщеплению (протеолизу) и получают пептоны – смесь полипептидов и аминокислот.
В качестве источника углеродаиспользуют углеводы, спирты, органические кислоты.
Требования к питательным средам:
а) среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли (натрия, калия и т.д.), факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов;
б) среды должны иметь определенное значение рН(отрицательный lg [Н+]); для большинства патогенных микробов оптимальным является рН7,2-7,4; исключение: холерный вибрион (рН 8,0-8,6), туберкулезная палочка (рН 6,2-6,8); сапрофиты растут в условиях с более широким диапазоном рН – от 2 до 8,5;
в) среды должны обладать буферностью– содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы рН среды при выращивании микроорганизмов не изменялось;
г) среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl;
д) среды должны быть стерильными для обеспечения возможности получения чистой культуры;
е) среды должные содержать достаточное количество доступной Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии; (за этим особенно необходимо следить при культивировании на плотных средах; чтобы избежать высыхания, разливать среды в чашки Петри или скашивать
7
в пробирках следует в день посева; при культивировании микробов, особенно чувствительных к отсутствию влаги (например, гонококка) в термостат ставят открытый сосуд с водой);
ж) среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным -по тенциалом, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом rH2; для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;
з) среды должны быть прозрачными– удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами;
и) среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота (т.е. суммарного азота NH2-групп аминокислот и низших полипептидов) –0,8-1,2 г/л; содержание общего азота – 2,5-3,0 г/л; содержание хлоридов в пересчете на NaCl – 0,5 %; пептона – 1%.
4. Условия культивирования:
а) температура: для холодолюбивых (психрофильных) микробов – 6-20° С; для средних (мезофильных) – 34-37° С; для теплолюбивых (термофильных) – более 37° С (до
70-75° С);
б) аэрация для аэробов; доступ О обеспечивается путем пассивной и активной
2
аэрации.
При пассивной аэрации микробы потребляют О , растворенный в среде, а также
2
находящийся над средой и поступающий в пробирку через ватно-марлевую пробку; при этом культивирование осуществляют на поверхности или в тонком слое среды, куда
проникает О воздуха, на плотных или жидких средах в сосудах, закрытых ватно-
2
марлевыми пробками или в чашках Петри.
При активной аэрации производят постоянное перемешивание культуры, что обеспечивает ее соприкосновение с воздухом; применяют при глубинном культивировании, когда микроорганизмы выращивают в больших объемах среды; чтобы обеспечить достаточное снабжение О2 таких культур, их помещают в специальные качалки; если же объем среды больше 10 и 100 л (в реакторах), то через культуру продувают стерильный воздух;
в) создание бескислородных условий для анаэробов; для этого используются физические, химические и биологические методы, которые будут описаны далее.
5. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают в пробирках, чашках Петри, во флаконах с питательными средами. Время выращивания для большинства составляет 18-24 часа, но могут быть и отклонения, так Mycobacterium tuberculosis выращивают около 3-х недель.
Задача 8. ПРИВЕСТИ КЛАССИФИКАЦИЮ И ДАТЬ ХАРАКТЕРИСТИКУ РАЗЛИЧНЫМ ПИТАТЕЛЬНЫМ СРЕДАМ.
Для этого надо знать:
1. По консистенции среды делят на:
а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ), сахарный МПБ; применяют для изучения физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, для накопления их биомассы или продуктов обмена;
б) полужидкие: мясопептонный агар (МПА) и др.; применяют обычно для хранения культур;
8
в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок; применяют для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета микроорганизмов и т.д.;
г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором; применяют для хранения посевного материала и культур– продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности;
д) сухие – гигроскопические порошки с влажностью до10 %, выпускаемые промышленностью; они могут быть различного назначения (простые, специальные, элективные, дифференциально-диагностические); имеют ряд преимуществ: стандартность, простота хранения и транспортировки, простота приготовления; их хранят в герметически закрытой посуде, в темноте; они должны хорошо растворяться в воде при комнатной температуре.
В качестве уплотнителя сред обычно используют агар(0,5-2 %), реже – желатин (10-15 %) или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гели, плавящиеся при температуре 100° С и уплотняющиеся при 45° С. К полужидким средам агар добавляют в количестве0,5 % (0,3-0,7 %), к плотным – 1,5-2 %. Выпускают в виде бесцветных пластинок или порошка.
2. По составу среды делят на:
а) естественные – натуральные продукты животного или растительного происхождения: молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови;
б) искусственные – среды, приготовленные по специальным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;
в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях, способных обеспечить азотное, углеродное, минеральное питание; состав их всегда точно известен и постоянен, поэтому они широко используются для изучения метаболизма и генетики бактерий.
3. По назначению среды делят на:
а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА, питательный агар (ПА), сусло-агар, сусло жидкое, питательный желатин; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; они служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;
б) специальные (сложные) – используют для выделения и культивирования тех микроорганизмов, которые не могут расти на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ, кровяной МПА, асцитический МПБ, сывороточный агар;
в) элективные (избирательные) – используют для выделения определенного вида из мест естественного обитания и для получения накопительных культур; на этих средах преимущественно растет определенный вид, другие не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера(для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифопаратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);
Среды обогащения – используются при незначительном количестве возбудителя в патологиче-
9
ском материале; на этих средах выделяемый вид микроба растет быстрее и интенсивнее других, рост которых подавляется ингибиторами: среда Мюллера, среда Лейфсона. Последняя содержит селенит натрия, который подавляет жизнедеятельность кишечной флоры, не препятствуя размножению шигелл и сальмонелл при посеве испражнений больных дизентерией или брюшным тифом.
г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается таким образом, чтобы четко выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.
Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.
Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.
Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий(возбудителей брюшного тифа, паратифов).
Перечисленные среды широко используются для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae. Они позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянного обитателя кишечника – кишечной палочки. E. coli способна расщеплять входящую в состав этих сред лактозу, т.к. вырабатывает фермент галактозидазу, в отличие от патогенных представителей семейства. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты (например, ацетальдегид), которые изменяют цвет индикатора, присутствующего в среде.
При росте на среде ЭндоE. coli образует красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы (возбудители брюшного тифа и дизентерии) образуют на этих средах бесцветные колонии, т.к. не сбраживают лактозу.
Т.о., на одной и той же дифференциальнодиагностической среде отмечается различный характер роста разных видов бактерий из-за различия в ферментативной активности, что позволяет отличить один вид от другого.
Среды Гисса служат для выявления различий в сахаролитических свойствах микробов с целью их идентификации. Они состоят из ПВ, 1% какого-либо углевода (глюкоза, лактоза, маннит, мальтоза, сахароза), индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный едким натром). Эти среды могут готовиться полужидкими с теми же сахарами, но с индикатором ВР (водный голубой краситель + розоловая кислота). В зависимости от ферментации того или иного углевода определенным видом микроорганизмов изменяется цвет среды с этим углеводом. В результате получается "пестрый ряд", характерный для данного вида бактерий.
В настоящее время дифференциально-диагностические среды выпускаются в виде сухих порошков.
4. Консервирующие среды применяются для первичного посева и транспортировки
10