meditsin1128_1

лизации ферментов в БС.

Рис. 3.12. Схематическое изображение методов иммобилизации ферментов в БС: а – ковалентное связывание с поверхностью электрода, б – сшивание, в – адсорбция на носителе (электроде), г – ковалентное связывание и пришивание к подложке (электроду), д – захват носителем (в пленке полимера).

Недостатком БС является трудность их изготовления. Но успехи в области развития средств микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций БС к новым решениям. Оказалось перспективным использовать так называемую планарную технологию (фотолитографию, полупроводниковую технику покрытия и т.д.), по которой можно изготовить биочип, объединяющий сенсорную систему, трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь (АЦП) микропроцессор для измерения аналитического сигнала и расчета результатов анализа.

“Молекулярный дизайн” при конструировании БС будущего может составить реальную конкуренцию их объемному варианту.

Таблица 3.8. Примеры ферментных электродов и область их применения

	Фер-	Индикаторный	Определяемое		Область применения
	мент	электрод	вещество
					Клиническая диагностика,
	Уреаза	Аммонийный,	Мочевина (субстрат),
		Газочувстви-	Фториды, тяжелые		экология
		тельный СО2 и NH3	металлы		Фармацевтическая	про-
	Пеницилли-	рН-метрический	Пенициллин
	наза				мышленность
	Оксидаза L-	Аммонийный	L-аминокислоты:		Пищевая промышленность,
	аминокислот		цистеин, лейцин,		производство биопрепаратов,
			тирозин,	триптофан,	санитарная экспертиза и дру-
			фенилаланин, метионин и		гие
			другие

161

	Фер-	Индикаторный			Определяемое			Область применения
	мент	электрод			вещество
								Клинический анализ, про-
	Оксидаза D-	Аммонийный,			D-аминокислоты:
	аминокислот	Газочувстви-			фенилаланин,		тирозин,	изводство	биохимических
		тельный NH3			метионин,	,лей-цин,		препаратов, пищевая про-
					триптофан и другие			мышленность
	Моноамин-	Газочувстви-			Биогенные амины: се-			Клиническая		диагностика,
	оксидаза	тельный NH3			ротонин, тирамин, адре-			фармацевтическая и пищевая
					налин, триптамин, норад-			промышленность, санэкспер-
					реналин,	бензиламин;		тиза, сельское хозяйство
					про-изводные бензимида-
					золов, гидразина, акриди-
					ны, атропин, метацин и
					другие			Химико-токсикологический
	Холинэстера-	рН-метричес-			Cубстраты - холиновые
	зы: ацетилхо-	кий,	редокс-		и тиохолиновые		эфиры	анализ, сельское хозяйство,
	линэстераза,	метрические:		пла-	уксусной про-пионовой и			ветеринария
	бутирихолин-	тиновые,	стеклян-		масляной кислот; атро-
	эстераза	ный ЭО-01, газо-			пин, эзерин, прозерин,
		чувствитель-ный			пестициды	антихолинэ-
		CO2			стеразного действия, ио-
					ны Ме			Медицина,		производство
	Аспарагиназа	Аммонийный			Аспарагин
								биопрепаратов,		пищевая
								пром-ть
	Глюкозокси-	Иодидный,		рН-	Глюкоза			Медицина
	даза	метрический						Сельское хозяйство, вете-
	Нитритре-	Аммонийный			Нитриты
	дуктаза + ме-							ринария, токсикология, сан-
	тилвиологен							экспертиза, экология
	Нитратре-	Газочувстви-			Нитраты			Сельское хозяйство, вете-
	дуктаза	тельный NH3						ринария, токсикология, сан-
								экспертиза, экология
	Креатиназа	Газочувстви-			Креатинин			Клинический анализ, про-
		тельный NH3						изводство биохимпрепаратов

2.5.2. Типы биосенсоров мочевины

Содержание мочевины в крови является важным клиническим параметром, характеризующим функционирование почек. В норме концентрация мочевины (СО(NH2)2) лежит в интервале 3,6–8,9 мМ, что составляет 3,6–8,9 ммоль/л; где М – молярная концентрация. В источнике представлена таблица мембранных биосенсоров мочевины.

Во всех известных биосенсорах мочевины использована реакция гидролиза, катализируемая высокоспецифичным ферментом – уреазой:

СО(NH2)2 + 2H2O → NH3 + NH4+ + HCO3

(3.1)

Уреаза — растительный ферментный препарат, не уступающий лучшим зарубежным аналогам. Диагностическое средство, предназначенное для сни-

162

жения содержания мочевины в крови и определения мочевины в биологических жидкостях.

Уреаза иммобилизованная — иммобилизованная форма фермента для использования ее в системе ферментного электрода (биосенсора) для аналитических и диагностических целей, а также для определения и разложения мочевины в биологических жидкостях и применения в аппарате «искусственная почка».

Некоторые из перечисленных в табл. 3.8 ферментных электродов выпускаются для продажи. Так, фирма Owens - Illinois (Kimble) создала прибор для определения мочевины на основе иммобилизованной уреазы и аммиачного газочувствительного электрода. По приобретенному патенту фирма Technicon продает этот прибор в Европе. Непосредственно ферментные электроды для определения мочевины, креатинина, аминокислот, спиртов, глюкозы и некоторых других веществ изготовляет по специальному запросу фирма Universal Sensors (New Orlean, USA). У нас в стране ферментные элек-

троды для оценки общей токсичности воды и определения фосфорорганических пестицидов и других веществ антихолинэстеразного действия изготовляются по предварительным заказам на экологическом факультете Казанского государственного университета.

Амперометрические биосенсоры:

Вамперометрических ферментных электродах чаще всего индикаторным электродом является платиновый электрод. Селективность амперометрического биосенсора (АБС) определяется природой материала электрода, точнее, его поверхности, а следовательно, и величиной потенциала, при ко-

тором происходят электрохимические реакции с участием анализируемого компонента. Чувствительность АБС составляет порядка 10-9 М. Несмотря на высокую чувствительность АБС обладают относительно большим временем измерения 2-3 мин.

Потенциометрические биосенсоры:

Впотенциометрических ферментных (биоспецифических) электродах индикаторными электродами служат обычно ионоселективные или (реже) редоксметрические электроды. Как уже говорилось выше, выбранный индикаторный электрод должен обладать избирательностью к ионам продукта или субстрата ферментативной реакции. Кроме того, он должен иметь низкий предел обнаружения потенциалопределяющего иона, проявлять стабильность в работе и быть нечувствительным к слою иммобилизованного фермента (биопрепарата).

Впотенциометрических индикаторным электродом является стеклянный и другие рН - метрические, а также газочувствительные электроды. Кроме того, применяются и другие ионоселективные электроды (ИСЭ): аммонийный, нитратный, холиновый и т.д. Стеклянный рН-метрический элек-

трод не случайно нашел широкое применение в конструкциях ферментных и других биосенсоров. Его уникальная избирательность к ионам Н+ и ОН-,

163

низкий предел обнаружения, высокая стабильность в работе, возможность в некоторых случаях стерилизовать поверхность электрода сделали этот ИСЭ незаменимым для самых различных исследований, в том числе биологических объектов. С позиции сочетания с ферментными препаратами рН- метрический электрод почти универсален, т.к. в большинстве ферментативных реакций происходит изменение рН.

рН – чувствительные ионоселективные электроды:

Потенциометрические биосенсоры (ПБС) основаны на ионоселективных электродах, дающих селективный отклик на присутствие определяемых ионов или молекул вещества в растворах. Аналитическим сигналом в них является потенциал. И, что самое главное они функционируют обратимо, и при измерении потенциала на электроде не нарушается электрохимическое равновесия электрод (биосенсор) – раствор, чего нельзя сказать об амперометрических биосенсорах, отклик которых определяется электролизом, т.е. потреблением вещества. Однако расход определяемого вещества за время формирования отклика настолько ничтожен, что не вызывает изменения концентрации определяемого компонента при повторных измерениях. ПБС менее чувствительны, чем АБС. Высокой селективностью обладают уреазные сенсоры на основе газовых аммиачных электродов.

Преобразователь мочевины, подходящий для быстрого, непрерывного определения мочевины в жидкостях, был разработан Guilbault G.G. и

Montalvo J.G.

Преобразователь мочевины называется электродом мочевины потому, что сделан на полимеризованной желатиновой мембране иммобилизированного фермента на стеклянном электроде, который определяет ионы аммония. Для мочевины специфично получение иммобилизации фермент (уреазы) в слое акриламидного геля толщиной 60-350 μм на поверхности стеклянного электрода. Когда электрод мочевины помещен в контакт с раствором, который содержит мочевину, субстрат распространяется в слой геля с иммобилизированным ферментом. Фермент катализирует (ускоряет) разложение мочевины до иона аммония как показано в уравнении:

СО(NH2)2 + H2O → 2NH4+ + CO2

(3.2)

Ион аммония, произведенный на поверхности электрода определяется рН

– чувствительным электродом, который измеряет активность этого одновалентного катиона способом, аналогичным pH определению со стеклянным электродом.

Потенциал этого электрода измерен. Время для 98 % установившегося ответа равняется 25 – 60 сек, в зависимости от толщины мембраны геля. Для проведения измерения достаточно 175 мг исследуемого раствора.

Кривая ответа, т.е. зависимость выходного напряжения с датчика от концентрации мочевины, или типичная кривая калибровки представлена на

164

рН – чувствительные полевые транзисторы:

Довольно широкое распространение получили миниатюрные устройства, основанные на полевых транзисторах. В них металлический контакт затвора транзистора заменен химически чувствительным слоем и электродом сравнения. В этом случае затвор представляет собой металлический слой, покрытый чувствительным материалом.

Взаимодействие определяемого компонента с материалом затвора вызывает изменение электрического поля в области затвора и, следовательно, порогового потенциала и тока в транзисторе, что и обуславливает аналитический сигнал. Чувствительность рН – чувствительных полевых транзисторов составляет порядка 10-4 – 10-5 М.

U, мВ

180

150

120

90

60

30

357	35,7	3,57	0,35	0,035 КМ , моль/л
		Рис. 3.13. Кривая калибровки.

Существуют устройства состоящие из фоточувствительной мембраны, которая содержит иммобилизованную уреазу, катализирующая гидролиз мочевины до аммиака и углекислоты (см. реакция гидролиза ). В таких устройствах регистрация потенциала светочувствительной мембраны осуществляется с помощью полевого транзистора, такой подход значительно миниатюризирует биосенсор (рис. 3.14). Время измерения при использовании полевых транзисторов составляет около 5 мин.

Появляющиеся в результате биохимической реакции ионы аммония влияют на амплитуду фотоответа сенсора, что составляет основу определения мочевины. Калибровочная зависимость такого биосенсора представлена

на рис. 3.15.	Свет	1
	6

2

5

165

Рис. 3.14. Схематическое представление сенсора на основе транзистора. 1-электрод сравнения, 2-фоточувствительная мембрана с ионофором, 3- сденозащитный экран, 4-внупренний электролит, 5-герметизирующее кольцо, 6-внешний раствор содержащий измеряемое соединение.

U, мВ

35

30

25

20

15

10

5

0

7

6

5

4

3 2

1 lg[(NH2)2CO]

Рис. 3.15. Зависимость величины фотоответов биосенсора от концентрации мочевины.

Удобство в использовании биосенсоров заключается в том, что их элементы: чувствительная мембрана, пленка с иммобилизованным ферментом и пр.; являются легко заменяемыми компонентами, в следствии чего возможна их оперативная замена и быстрая настройка для анализа широкого спектра биологически активных соединений.

3.Газовый анализатор

3.1.Исследование физико-химического состава содержимого

брюшной полости

В последнее время повысился интерес к прецизионному исследованию продуктов жизнедеятельности. Установлено, что по хромато-масс- спектрометрическому анализу слюны, кала, влагалищных смывов, выдыхаемого воздуха можно диагностировать многие заболевания, в частности стоматологические, гинекологические, легочные, психические.

Кишечные газы являются одним из наиболее доступных биологических материалов, однако, они еще недостаточно используются для диагностики заболеваний. Состав кишечных газов имеет также существенное значение для космической медицины. Исследование кишечных газов было проведено на хромато-масс-спектрометре LKB-2091 (Швеция), соединенном с ЭВМ, включающей компьютер PDP 11/34 (США), дисплей и графопострои-

166

тель. Пробы кишечных газов отбирали во фторопластовые мешочки. На основании проведенных исследований за норму может быть принято следующее содержание специфических химических соединений в кишечных газах (концентрации приведены к 760 мм.рт.ст. и 37 0C). Из предельных углеводородов в существенных количествах представлены (в скобках - концентрация в микрограммах на 1л) этан (2056), пропан (1485), пентан (677), изопентан

(597), 2-метилпентан (97,4), 3-метилпентан (86,1), гексан (55,1), 2-

метилгексан (47,2), 3-метилгексан (45,2), октан (52,1), 2,2,5-триметилгексан (40,9), гептан (37,9), нонан и его изомеры (25,9), ундекан и его изомеры (18,6),додекан и его изомеры (14,4), тридекан и его изомеры (8,12), 2,2,5- триметилгептан (31,6). Из предельных углеводородов обнаружены этилен

(857), бутилен (176), изопрен (541), гептен-1 (39,9), 3-метилбутен-1 (30,5),

децен-1 (34,0), диизоамилен (30,2), ундецен-1 (25,9), додецен-1 (18,6), триде- цин-1 (7,82), 4-метилоктадиен-1,7 (6,34), децин-3 (3,37). Идентифицированы следующие нафтеновые соединения: циклобутан (43,9), циклопентан (48,5), метилциклопентан (50,2), циклогексан (57,4), триметилциклопентан (45,5), 1,3-диметилциклогексан (36,9), этилциклогексан (60,7), триметилциклогексан (74,6), пропилциклогексан (31,9), амилциклогексан (24,2), индан (11,5), гексагидроиндан (6,04). Выявлены соединения, принадлежащие к ароматическим углеводородам: бензол (446), толуол (114), этилбензол (140), ксилол

(48,5), стирол (0,26), н-пропилбензол (13,5), 1-метил-3-этилбензол (23,3), 1-

метил-4-этилбензол (26,9), 1-метил-2-этилбензол (26,3), бутилбензол (2,57), 1,2,4-триметилбензол (2,07), 1-метил-4-изопропилбензол (1,94), 1-метил-3- изопропилбензол (2,08), 1,3-диметил-5-этилбензол (1,50), 1,2-диметил-4- этилбензол (2,55), 1,3-диметил-2-этилбензол (2,36), 1,2,3,4-тетраметилбензол (1,38), нафталин (2,15), 2-метилнафталин. Представляет существенный интерес идентификация в кишечных газах значительного количества специфических кислородосодержащих соединений: альдегидов - формальдегида (28,3), ацетальдегида (195), 2-метилпропаналя (44,9), 3-метил-бутаналя (30,8), пентаналя (27,9), 2,4,-гексадиеналя (24,9), гексаналя (26,1), фурфураля (23,6), гептаналя (24,6), октаналя (25,9), бензальдегида (16,4), нонаналя (7,23), деканаля (4,92), ундеканаля (4,19); кетонов - ацетона (409), метилэтилкетона (1960), 2-бутанона (44,2), метилциклобутилкетона (25,2), 2-гексанона (26,6), 4-гептанона (17,9), 3-октен-2-она (10,3), 2-деканона (7,49), 2-ундеканона (6,11), 3-метилциклопентанона (3,43); спиртов - метанола (53,8), этанола (850), пропанола (328), изопропанола (449), бутанола (246), циклогексилового спирта (317), изоамилового спирта (278), бензилового спирта (176), 3- метил-1-бутанола (276); эфиров - этилацетата (94,7), диэтилового эфира (176), 1,4-диоксана (80,4), бутилацетата (64,4), изобутилацетата (28,5), изоамилацетата (56,8), этилгексаноата (23,5), этилоктаноата (20,8), дифенилового эфира (30,5), этилбутаноата (17,9), 3-метил-2-бутилацетата (21,7), а также других кислородосодержащих соединений - оксида углерода (4049), фенола

(93,7), фурана (234), n-крезола (558), ментола (35,6), муравьиной (1531) и ук-

сусной (2039) кислот. Из азотосодержащих углеводородов представлены следующие соединения: метиламин (746), изопропиламин (581), пирролидин

167

(0,199), индол (0,068), скатол (0,042), 2,2-дипиридил (2,68), н-метилпиррол

(3,22), метилпинеразин (3,73), ацетонитрил (27,4), метакрилонитрил (2,62); из серосодержащих - метилмеркаптан (4,46), этилмеркаптан (10,1), диметилдисульфид (6,14), метил-н-пропилсульфид (6,99), амилмеркаптан (0,50), 2,3,4- тритиопентан (2,83), амилтиозоцианат (3,66), этиленсульфид (4,22); хлорсодержащих - хлороформ (32,2), трихлорэтилен (20,1), тетрахлорэтилен (18,1), хлорбензол (19,6), хлористый метил (27,5), четыреххлористый углерод (3,37), дихлорметан (19,9), 1,1,1-трихлорэтан (6,47). Хромато-масс- спектрометрический анализ кишечных газов может быть эффективно использован для диагностики заболеваний.

Поскольку многие из указанных веществ имеют специфический запах, то экспериментально были определены пороги обонятельного ощущения для каждого из веществ в отдельности. Результаты эксперимента обрабатывали методом пробит-анализа.

В эксперименте участвовали 28 лиц в возрасте 20-55 лет, не имеющих функциональных нарушений со стороны органов обоняния, полости рта и дыхательных путей.

Результаты эксперимента показали, что пороговая концентрация для интересующих нас газов, сероводорода на уровне 0,021 мг/м3, аммиака - 0,206 мг/м3, паров ацетона - 0,409 мг/м3.

3.2. Обзор принципов и схем обработки данных

Наибольшую активность в период с 1980 по 2000 гг. в сфере разработки измерителей концентрации проявила Россия, а пик патентования прихо-

дится на 1990-1993 гг.

В настоящее время ведущими признаны следующие фирмы:

1.Россия – Малое государственное предприятие "Практик - НЦ"", Нижегородское производственное предприятие "ЭКО - плюс", фирма "Геба", АОЗТ "Сенсорные системы", ОАО "Украинский НИИ аналитического приборостроения".

2.Япония – FIGARO ING.

3.Германия – SIMENS, FRIEDRICH-SCHILLER-UNIVERSITAET JENA.

4.PTC (WO) - AROMASKAN, MATSUSHITA ELEKTRIC INDASTRIAL CO, MINNESOTA MINNING & MANUFACTURING COMPANI, CAPTER SENSOR & ANALYSERS LTD

5.EP - MIKROSTRUKTURTECHNIK-MBH, UNITED KINDOM ATOMIK ENERGY AUTOHORITY, DRAEGERWERK AKTIENGESELLSCHAFT.

Основными задачами, стоящими перед разработками в настоящее время, являются:

-повышение точности измерений;

-расширение диапазона измерений и функциональных возможно-

168

стей;

-повышение чувствительности и селективности;

-повышение надежности и срока службы;

-увеличение помехозащищенности;

-упрощение конструкции и способа изготовления;

-уменьшение погрешности измерения;

-повышение быстродействия;

-уменьшение энергопотребления;

-удешевление;

-увеличение быстродействия;

-улучшение весо-габаритных показателей;

-повышение стабильности параметров;

-снижение рабочей температуры;

-повышение достоверности анализа;

-обеспечение экспрессного анализа;

Приведенные данные позволяют сделать вывод, что в настоящее время основной тенденцией в развитии методов и средств измерения концентрации является повышение чувствительности и селективности.

3.3. Выбор типов первичных преобразователей

Обнаружение различных газов осуществляется с помощью газовых датчиков. В присутствии определенных газов они вырабатывают электрические сигналы, которые более или менее специфичны для различных веществ. При этом используются различные физические и химические эффекты. Кроме этих простых и надежных газовых детекторов для более ответственных применений существуют еще оптические фотометры, превосходящие газовые детекторы по селективности и точности. Правда, они гораздо дороже и сложнее по устройству.

Для простых применений, когда можно обойтись умеренной точностью

иселективностью, применяют следующие устройства:

•термокондуктометрические ячейки (СО2, SO2, SF6);

•термохимические (каталитические) ячейки (СО, взрывоопасные и горючие газы);

•полупроводниковые датчики (спирты, Н2S, углеводороды, токсичные газы);

•топливные ячейки (кислород).

Термокондуктометрические ячейки.

Принцип действия этих датчиков состоит в следующем: Исследуемая проба газа диффундирует в измерительную камеру, в ко-

торой имеется платиновая или никелевая проволочная спираль, нагретая до температуры примерно на 40ОС выше окружающей. Если состав газов изменится, то изменится также теплоотвод от нагретой спирали к стенкам ячейки. Охлаждение или нагрев спирали ведет к изменению ее сопротивления, кото-

169

рое сопоставляется в измерительном мосте со вторым - эталонным - сопротивлением, расположенным в сравнительной камере.

Одинаковый тепловой эффект может быть обусловлен смешением различных газов, но в соответственно разных количествах, применение датчика ограниченно только анализом бинарных смесей из трех и более данный способ непригоден.

Топливные ячейки.

Для оценки натекания воздуха по содержащемуся в нем кислороду применяют датчики с топливной ячейкой. В присутствии кислорода происходит окисление активной поверхности электропроводящего материала, находящегося между электролитом и атмосферным воздухом. В результате возникает электрический сигнал, который может быть измерен.

Термохимические (каталитические) ячейки.

Термохимическая ячейка имеет две измерительные платиновые спирали, включенные в измерительный мост. Одна спираль покрыта слоем активного катализатора, а вторая - слоем пассивного катализатора. Находящийся в атмосфере монооксид углерода (СО) будет реагировать с кислородом воздуха на активном катализаторе, образуя диоксид углерода (СО2). Выделяющаяся в результате этой реакции тепловая энергия вызывает повышение сопротивления активной спирали, а в итоге - разбаланс моста. С помощью такого датчика можно обнаруживать незначительные концентрации СО.

Полупроводниковые датчики.

В самых простых и дешевых газовых датчиках используется изменение электрического сопротивления некоторых полупроводниковых материалов, возникающее вследствие адсорбции газа.

Устройство датчика состоит из керамической основы, на которой находятся два электрода, между которыми наносится полупроводящий оксид металла. Если газ проходит над этим активированным слоем оксида металла, то проводимость последнего меняется. С помощью мостовой схемы это изменение проводимости преобразуется в изменение напряжения.

Наиболее значительным производителем полупроводниковых газовых датчиков является японская фирма Figaro Eng. Inc.

Фирма Figaro Engineering Inc. является одним из мировых лидеров по производству датчиков детектирования и определения концентрации газов и газовых примесей в составе воздуха. Весь производственный процесс, включающий разработку новых типов датчиков, их изготовление и тестирование, имеет международный сертификат качества ISO 9001, который гарантирует потребителям хорошие технические параметры датчиков, а также их надежность и стабильность в эксплуатации. Объем производимой продукции Figaro на сегодняшний день составляет 1 миллион датчиков в месяц. Среди потребителей датчиков Figaro такие известные мировые компании как BMW, Mitsubishi Heavy Industries, General Motors, Daikin и др.

Принцип действия датчика на основе оксида металла основан на изменении электропроводности полупроводниковой пленки вследствие адсорбции газа на ее поверхности. На трубчатую подложку из оксида алюминия нанесен

170