Конспект_лекцій_Заг.вірусологія_0

глікопротеїнів для спрямування віріону та інші, нестандартні клітинні мішені. Прикладом таких маніпуляцій може бути заміна гена, кодуючого оболонковий білок лентівірусів, на ген глікопротеїну G вірусу везикулярного стоматиту.

Для полегшення візуалізації та підтвердження бажаної експресії транспортованого у складі вірусного вектора гена у вірусний геном включають також послідовність зеленого флуоресцентного білка (Green Fluorescent Protein, GFP). При вдалій трансфекції експресія цього білка буде відбуватись одночасно з експресією транспортованого гену, а для вірусінфікованої клітини спостерігатиметься зелена біолюмінесценція в ультрафіолетовій області спектру.

Віруси як вектори для систем білкової експресії у клітинах ссавців, рослин і комах

Віруси виявляються високоефективними реплікуючими системами, а вірусна генна експресія може бути адаптована до еукаріотичних систем. Вірусні гени зазвичай містять надзвичайно сильні промотори (наприклад, негайний / ранній промотор цитомегаловірусу, CMV immediate/early promoter), малі інтрони (наприклад, CMV intron), їх регуляторні елементи часто конститутивні і потребують лише зв’язування фактору клітини господаря (наприклад, промотор/енхансер свинячого цирковірусу, porcine circovirus (PCV) capsid promoter / enhancer). Тому на сьогодні у біотехнологічних дослідженнях широко використовуються вірусні промотори, енхансери, сигнали поліаденілювання, інтрони, точки ori, IRES елементи.

Віруси у розробці та доставці вакцин і біотехнологічних препаратів.

Віруси можуть бути використані у боротьбі як проти аутологічних, так і гетерологічних вірусів. Проти аутологічних вірусів використовують атенуйовані чи інактивовані віруси, вірусні субодиниці (звичайно структурні вірусні білки чи ДНК опосередковані вакцини), а також перехресну реактивацію при вивченні спорідненості штамів вірусу.

Проти гетерологічних вірусів використовують вірусні структурні білки чи так звані «вірусоподібні частинки» («virus-like particles» VLPs), які створюються для перенесення епітопів (білків, розташованих на поверхні) гетерологічних патогенів для вироблення на них імунної відповіді або вакцини-реплікони, які являють собою енкапсидовану ДНК опосередковану вакцину. Вірусоподібні частинки являють собою мультибілкові структури, які володіють структурною та конформаційною подібністю до автетичних нативних вірусів, проте позбавлені вірусного геному. Ці частинки потенційно виявляються безпечнішими та дешевшими для вакцинації. Деякі профілактичні вакцини на основі вірусоподібних частинок на сьогодні комерціалізовані та випускаються фармацевтичними компаніями, наприклад

GlaxoSmithKline`s Engerix® (вірус гепатиту В) та Cervarix® (папіломавірус людини), Merck and Co., Inc.`s Recombivax HB® (вірус гепатиту В) та

81

Gardasil® (папіломавірус людини).

Інші потенційні вакцини на основі вірусоподібних частинок проходять преклінічні випробування і будуть використані для вакцинації проти вірусу грипу, парвовірусу та вірусу Норволк.

Можливість специфічної доставки не лише генів та вакцин, але й інших ліків та різноманітних молекул у клітини-мішені, активізувала інтенсивні дослідження та розробку неорганічних, органічних, біологічних чи гібридних наночастинок з діагностичною і терапивтичною метою при багатьох патологіях. На сьогодні таку можливість перетворення вірусних частинок на наноносії чи наноконтейнери для спрямованої доставки ліків можна вважати цілком доведеною численними експерементальними дослідженнями.

Місцями приєднання малих молекул на поверхнях капсиду можуть виступати тіолові, амінні, карбоксильні чи інші функціональні групи нативних чи модифікованих вірусних білків. У випадку приєднання молекули до функціональних груп, розміщених на зовнішній поверхні капсиду, вірус виступатиме наноносієм, але не наноконтейнером.

Віруси як специфічні контрастуючі агенти для візуалізації.

In vivo візуалізація на сьогодні широко використовується у біомедицині для діагностики та/чи оцінки терапевтичного лікування. Будь який вид молекулярної візуалізації вимагає накопичення відповідного контрастуючого агента у відповідному місці (мішені). Таким чином багато різних наночастинок, включаючи природні та модифіковані вірусні частинки можуть селективно накопичуватись у визначених клітинах і тканинах, де згодом можуть діяти як контрастуючі агенти та посилювати специфічність і чутливість існуючих способів in vivo візуалізації.

Дисплей пептидів та білків – розробка промислових, фармацевтичних, біомедичних засобів

Дисплей – метод вивчення білок-білкових, білок-пептидних та ДНКбілкових взаємодій, в якому використовуються віруси для того, щоб співвіднести білки та їх генетичну інформацію. Найбільш поширеним варіантом на сьогодні є фаговий дисплей, в якому здебільшого використовуються філаментні (витягнуті) фагм М13, Т4, Т7 і фаг λ. Суть методу ґрунтується на фізичній інтеграції генотипу та фенотипу пептиду чи білка у модифікований віріон фага. Послідовність ДНК, що кодує поліпептид, "зшивається" з геном вірусного білка, використовуючи техніку рекомбінантних ДНК. Внаслідок цього ген поліпептиду може експресуватись, а сам поліпептид розташовуватися на поверхні віріону, будучи ковалентно приєднаним як видовження на кінці капсидного білка.

Приєднання різноманітних пептидів та білків (отриманих зі спеціалізованих білкових комбінаторних бібліотек) та вибір варіантів з потрібними властивостями такими як висока спорідненість до певних лігандів, хімічна та конфірмаційна стабільність або навіть модифікована

82

ензиматична активність, дозволять проводити селекцію білків за заданими властивостями та створювати бібліотеки фагового дисплею.

Загалом селекція лігандів з бібліотек фагового дисплею проводиться на основі афінності та звідності пептидів та білків. На сьогодні розірізніють 4 основні типи селекції:

1.селекція за афінністю щодо простої мішені, як наприклад імобілізовані білки;

2.селекція за афінністю щодо складної мішені типу клітинної поверхні;

3.селекція після проникнення фага у відповідну клітину-мішень;

4.функціональна селекція, яка проводиться після специфічного опосередкованого фагом перенесення гену.

Віруси як актибактеріальні агенти

Фагова терапія або більш точніше терапевтичне використання ліричних фагів з метою лікування бактеріальних інфекцій на сьогодні розглядається як один з багатообіцяючих підходів у вирішенні антибіотикорезистентності бактерій. Відкриті у 1915 році, ці віруси використовують як антибактеріальні агенти ще задовго до відкриття антибіотиків. Водночас, неадекватне розуміння біології та генетики фагів на той час знижувало ефективність фагової терапії, що в кінцевому випадку привело до втрати найкового інтересу в цьому напрямку. Проте інтерес до фагової терапії за останнє десятиліття надзвичайно зріс.

Ефективність природних та модифікованих фагів в антибактеріальніц терапії доведена при їх використанні проти антибіотикорезистентних штамів родів Staphylococci, Streptococci, Escherichia, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Shigella, Serratia, Klebsiella, Enterobacter, Campylobacter, Yersinia, Acinetobacter, та Brucella. Використання фагів з лікувально-профілактичною метою має надзвичайні переваги, оскільки може бути використано у боротьбі проти штамів бактерій множинною резистентністю до антибіотиків. Слід зауважити, що такий вид антибактеріальної терапії надзвичайно дієвий, швидкий, та специфічний, оскільки не буде відбуватися знищення нормальної мікрофлори організму. Внесення фагу можна вважати само обмежуючою інфекцією, оскільки вона зникне сама по собі як тільки буде знищено всі патогенні бактерії.

Водночас перед дослідниками постає цілий ряд методичних труднощів, викликаних штамовою специфічністю фагів. Необхідно генерувати, зберігати та архівувати великий банк колекцій фагових серотипів, застосування яких потребує точної діагностики або необідно вводити коктейль з різних типів фагів для уникнення ухиляння бактерій від терапії.

Фаги для профілактики і лікування інфекційних захворювань випускають моно- і полівалентними. Їх не можна замінити діагностичними фагами, так само як і діагностичні фаги не можна використовувати замість лікувально-профілактичих. Лікувально-профілактичними фагами є моно валентні стафілофаги, стрептококовий фаг, фаг піоціанеус, фаги протейний і

83

колі-протейний, колі-фаг, полівалентний дизентерійний, полівалентні сальмонельозні.

Водночас властивість фагів вражати визначений вид бактерій використовується у фаготипуванні бактерій. Для індикації бактерій виготовляють так звані видові і типові фаги: черевно-тифозні, Vi-фаги, дизентерійні індикаторні, паратифозні, В-типові, сальмонельозний індикаторний, стафілококові типові.

84

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1.Бойко А.Л. Основи екології та біофізики вірусів. – К.: Фітосоціоцентр,

2003.

2.Гудзь С.П., Перетятко Т.Б., Павлова Ю.О. Загальна вірусологія:навч. посіб. – Львів: Видавничий центр ЛНУ ім.. І.Франка, 2010. – 264 с.

3.Карташева И.А. Сельскохозяйственная фитовирусология: уч. пособ. – М.: Колос; Ставрополь: АГРУС, 2007. – 168 с.

4.Мельничук М.Д. Фітовірусологія. Навчальний посібник. – К.: ПоліграфКонсалтинг, 2005. – 200 с.

5.Ташута С.Г. Загальна вірусологія. Посібник. – Київ, 2004. – 327 с.

6.Шмараков І.О., Марченко М.М., Співак М.Я. Основи вірусології. Підручник. 2-ге вид, перероб. і доп. – Х.: Мачулин, 2013. – 336 с.

85