Информацию для пополнения знаний-умений можно найти в следующих учебниках:

1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология, Под ред. Л.Б. Борисова, А.М.Смирновой - М.: Медицина, 1994. - С. 233 - 241.

2.Микробиология, под ред А.А. Воробьева и др. -М. Медицина, 1994.-С. 144-148, 149-153.

3.Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология.- К.: Высшая школа, 1992.- С. 176-181,173-176.

4.Руководство к лабораторным работам по микробиологии. Под ред. Л.Б.Борисова. - М.: Медицина, 1984.-С. 107 - 122.

Теоретические вопросы, на основе которых возможное выполнение целевых видов деятельности:

1. Антигенные свойства вирусов.

2. Серологические реакции, которые используются в вирусологии. Реакция вируснейтрализации, механизм, принципы использование, диагностическая ценность.

3. Реакция торможения гемагглютинации, ее механизм, условия постановки, принципи использования, диагностическая ценность.

4. Реакция связывания комплемента, ее суть, оценка. Особенности постановки.

5. Реакции с меченными антителами.

Литература для усвоения знаний-умений по данной теме:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под ред. Л.Б.Борисова, А.М.Смирновой. М.: Медицина,1994. с.188, 233-241

2. Микробиология, под ред А.А. Воробьева и др. -М. Медицина, 1994.-С 175-181.

3.Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология.- К.: Высшая школа, 1992.- С. 173-176, 192-204.

4.Руководство к практическим занятиям по микробиологии. /Под ред. Л.Б.Борисова. М.: Медицина, 1984. с. 107-122, 235.

Ориентировочная основа действия при выполнении практической работы.

1. Провести идентификацию вируса гриппа с ХАЖ (хорионалантоисная жидкость) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Диагностические сыворотки тип А и В взятые в разведениях от 1:10 к разведению, которое отвечает титру вируса (например 1:160). К ним прибавляется неизвестный вирус, который содержится в ХАЖ (0,2 мл). После инкубации на протяжении 60 минут в термостате при t 37⁰С во все лунки прибавляется суспензия эритроцитов 0(1) группы – 0,4 мл. Инкубация 30-60 минут. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации к титру вируса. Данные занести в протокол, сделать вывод о типе вируса.

2. Провести идентификацию вируса в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток (демонстрация). Испражнение больного обрабатывают антибиотиками по 1000 ЕТ в 1 мл в растворе Хенкса при 4^ос на протяжении суток, после чего проводят контрольный посев на стерильность. При отсутствии роста бактерий суспензией испражнений заражают по 2 пробирки с первичной культурой клеток и перевиваемой культурой клеток. На второй-третий день после инкубации зараженных клеточных культур при 35^ос наблюдается полная или частичная дегенерация клеток. При отсутствии ЦПД исследования прекращают, при наличии - проводят идентификацию вируса. Исследуемый вирус титруют в той клеточной культуре, на которой он был выделен. Вируссодержащая жидкость смывается с поливалентными диагностическими сыворотками и засевается на культуру клеток. Учет через 2 дня инкубации в термостате по ЦПД. Данные занести в протокол. Если нейтрализация исследуемого вируса произошла, то применяют реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками к каждому серотипу данного вируса.

З. Провести серологическую диагностику вирусной инфекции в реакции непрямой гемагглютинации (демонстрация). РНГА происходит тогда, когда к эритроцитам, сенсибилизированным антигеном, т.е. несущим на себе адсорбированый антиген, прибавляют иммунную сыворотку, соответствующую антигену. РНГА с эритроцитами проводят с известным антигеном для выявления антител или с известными антителами для выявления антигена. РНГА относится к парным сывороткам, полученным в начале и в конце заболевание. К 05, мл сыворотки, разбавленной от 1:10 до 1:1280 в лунку планшета прибавляют 0,25 мл эритроцитарного диагностикума. На 2 часа ставят в термостат при 37 ^ос. В качестве положительного контроля используют нормальный иммуноглобулин человека (НИЛ). В качестве отрицательного контроля используют диагостикум без сыворотки. Титром гемагглютинации является разведение сыворотки, которое вызывает склеивание эритроцитов при полном осветлении надосадочной жидкости. Результаты исследований занести в протокол. Наличие агглютинации эритроцитов "++". Отсутствие агглютинации признак - минус. Титром вируса является наибольшее разведение сыворотки, где наблюдается агглютинация эритроцитов.

Рассмотреть принцип современных методов диагностики вирусных и бактериальных инфекций в реакциях с использованием меченных Апt и Аng - РИФ, РИА, ИФА, иммуноблотинг (демонстрация).

Реакция иммунофлюорисценции — РИФ (метод Кунса) — основана на том, что Апg, обработанный имунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способен светится в ультрафиолетовых лучах люминесцентного микроскопа (прямой - метод). Реакция Кунса может быть использована как для выявления антигенов, так и для определения антител. Разновидность — косвенный метод Кунса (РНИФ). Применяются одна универсальная флюоресцирующая сыворатка-антиглобулиновая. На образованном комплексе (специфические антитела - исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, которые вызывают свечение при люминесцентной микроскопии. Иммуноферментний анализ (ИФА) — выявления Апg с помощью соответствующих ему Апt, конъюгированных с ферментом — меткой (пероксидазою, в-галактозидазою, щелочной фосфатазой). После соединение Ang с меченной ферментом имунной сывороткой в смесь прибавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и продукты его деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген изменяет цвет - интенсивность крашение прямо пропорциональна количеству молекул, которые связались, Апg и Апt.

Наиболее распространенный твердофазный ИФА — вариант иммунологического теста, когда один из компонентов имунной реакции (Аng или Апt) сорбированный на твердом носители, например в лунках микропанелей из полистирола. При определении Апt в лунки с сорбированным Аng последовательно прибавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каждый раз после добавление дежурного компонента из лунок удаляют реагенты, которые не связались, путем тщательного промывания. При позитивном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать как Апg, так и Аnt. Тогда в лунку с сорбированными Аnt вносят искомый Аng, прибавляют имунную сыворотку против Аng, меченную ферментом, а потом смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определение гормонов, ферментов, лекарственных препаратов, других биологически-активных веществ, которые содержаться в исследуемом материале в минимальных концентрациях 1010— 1012г/л. Радиоиммунологический анализ (РИА) — высокочувствительный метод, основанный на реакции Аng + Аnt с использованием антигенов или антител, меченных радионуклеидом(125И, 14С, 3Н, 5ИСг и др).

Посля их взаимодействия отделяют радиоактивный иммунный комплекс, который образовался, и определяют его радиоактивность в соответствующим счетчиком ( ß или γ излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству молекул Аnt или Аng, которые связались. Показание к применению те же, что и для ИФА. Метод представляет определенную экологическую опасность. Иммуноблотинг — высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, потом переносят его с геля (блот — пятно) на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и обнаруживают с помощью ИФА. Иммуноблотинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекциях и др. В протоколе схематично изобразить механизм РИА и ИФА, подписать названия реагентов, указать тип патологического материала.