ЗАХОДИ БЕЗПЕКИ
Заходи	безпеки під час виконання лабораторних робіт з дисципліни
“Загальна	біотехнологія” збігаються з розділом“Загальні положення”

“Інструкції з техніки безпеки під час роботи в лабораторних приміщеннях кафедри біотехнології мікробного синтезу”, узгодженої з начальником відділу охорони праці і техніки безпеки НУХТ та затвердженої ректором НУХТ.

Особливу увагу під час виконання					лабораторних робіт із		загальної
біотехнології треба приділяти розділу3 названого видання, де визначаються
правила	безпеки	під	час	роботи	з	електроприладами, також	із
легкозаймистими та горючими рідинами.

Лабораторна робота №1 Аналіз сировини та допоміжних матеріалів

Мета роботи: Дослідити фізико-хімічні, органолептичні та мікробіологічні показники меляси.

Матеріали та обладнання: Меляса бурякова, прилад Чижової, папір фільтрувальний, реактиви Герлеса І та Герлеса ІІ, NH4H2PO4, NaHSO3, кислота соляна, розчини Фелінга І та Фелінга ІІ, колби, пробірки, бюретки, сахариметр, поляризаційні трубки.

Основні відомості

Бурякова меляса є продуктом переробки цукрових буряків в цукровому

виробництві.
Бурякова меляса виробляється відповідно до вимог стандарту
ДСТУ 3696-98 (ГОСТ 30561-98) "Меляса				бурякова", і "Технічні умови"		та
згідно	з "Інструкцією	по	веденню	технологічного	процесу	цукрового

виробництва".

За органолептичними показниками бурякова меляса повинна відповідати вимогам, зазначеним у таблиці 1.1.

			Таблиця 1.1
	Органолептичні показники (згідно ДСТУ 3696-98 (ГОСТ 30561-98))
	Назва показника	Характеристика	Метод
			випробування
	Зовнішній вигляд	Густа в'язка непрозора рідина	7,2
	Колір	Від коричневого до темно-бурого	7,2
	Запах	Властивий буряковоцукровій мелясі без	7,2
		стороннього запаху
	Смак	Солодкий з гіркуватим присмаком	7,2
	Розчинність у воді	Повна, розчиняється у будь-яких	7,2
		співвідношеннях у гарячій і холодній воді

За фізико-хімічними показниками бурякова меляса повинна відповідати

3

вимогам, зазначеним у таблиці 1.2.

			Таблиця 1.2
	Фізико-хімічні показники меляси
	Назва показника	Норма	Метод випробування
	Масова частка сухих	75,0	7,3
	речовин, %, не менше
	Масова частка сахарози, %,	43,0	7,4
	не менше
	Масова частка суми цукрів,	44,0	7,5
	що зброджуються, %, не
	менше
	Величина рН	6,5-8,5	7,6

Примітка. Масова частка суми цукрів, що зброджуються, регламентується для бурякової меляси, яка використовується для виробництва етилового спирту.

За мікробіологічними показниками бурякова меляса повинна відповідати вимогам, зазначеним у таблиці 1.3.

Таблиця 1.3

	Мікробіологічні показники меляси
	Назва показника	Норма	Метод
			випробування
	Загальна кількість
	мезофільних аеробних і	1,0×105
	факультативно-анаеробних		7,7
	мікроорганізмів, КУО в 1 г,
	не більше
	Плісняві гриби, КУО в 1 г,	1,5×104	7,7
	не більше

Вміст токсичних елементів і пестицидів у буряковій мелясі не повинен перевищувати допустимих рівнів, встановлених «Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов», СанПиН 42-123-4540 і наведених у таблиці 1.4.

4

Таблиця 1.4

Допустимі рівні вмісту токсичних елементів і пестицидів

(ДСТУ 3696-98 (ГОСТ 30561-98))

	Назва показника	Норма	Метод випробування
	Вміст токсичних елементів,
	мг/кг, не більше:
	ртуть	0,02	ГОСТ 26927
	миш'як	1,0	ГОСТ 26930
	мідь	25,0	ГОСТ 26931
	свинець	1,0	ГОСТ 26932
	кадмій	0,05	ГОСТ 26933
	цинк	50,0	ГОСТ 26934
	Вміст пестицидів, мг/кг,
	не більше:
	гексахлоран ГХЦГ	0,005	СанПиН 42-123-4540 [3]
	гамаізомер
	фостоксин	0,01	СанПиН 42-123-4540 [3]
	ДДТ	0,005	СанПиН 42-123-4540 [3]

Визначення концентрації сахарози

Вміст сахарози в малясі визначають по методу прямої і інверсійної поляризації. Для освітлення розчину застосовують реактив Герлеса, який складається з двох реактивів: Герлеса І та Герлеса .ІІПерший являє собою розчин нітрату свинцю, другий – розчин гідроксиду натрію.

Реактиви:

- Реактив Герлеса І – 340 г нітрату свинцю (Pb(NO3)2) переносять в мірну колбу на 1 л, розчиняють в дистильованій воді, доводять до мітки водою і перемішують;

- Реактив Герлеса ІІ – 32 г гідроксиду натрію переносять в мірну колбу на 1 л, розчиняють в дистильованій воді, охолоджують, доводять до мітки водою і перемішують.

Обидва розчина зберігають в окремих склянках.

-Дигідроортофосфат амонію NH4H2PO4.

-Гідросульфат натрію NaHSO3.

-Розчин соляної кислоти– одна частина соляної кислоти з відносною густиною 1,185 і 5 частин дистильованої води – за об’ємом.

Хід роботи:

Нормальну наважку маляси(26,0 г) за допомогою теплої дистильованої води переводять в мірну колбу на100 мл, охолоджують до 20°С, додають для освітлення 15 мл кожного з розчинів Герлеса, додають їх в4-5 прийомів, причому після кожного додавання розчину І додають таку ж кількість розчину ІІ. Суміш перемішують легкими обертальними рухами колби протягом 1,5-2 хв,

5

після цього знову в тій же послідовності додають освітлювач. Вміст колби доводять до мітки дистильованою водою(при t=20 °С), збовтують і після 2-5 хв, фільтрують і поляризують в трубці довжиною 200 мм.

Покази сахариметра дають процентний склад сахарози, яка визначається в малясі.

Визначення вмісту різноманітних цукрів в розчинах. Метод Бертрана

Метод ґрунтується на здатності цукрів, що мають вільні альдегідні або кетонні групи (глюкоза, фруктоза), в певних умовах відновлювати лужні розчини оксиду міді(II). Оксид міді (I), який при цьому утворюється, може бути врахований масовим або об’ємним методом. Метод дає гарні результати при вмісту глюкози в досліджуваному розчині від 10 до 90 мг.

При кип’ятінні лужного розчину оксиду міді(I) з розчином цукру утворюється осад оксиду міді(II), який обробляється підкисленою сірчаною кислотою розчином сульфату оксиду заліза(III). При цьому оксид міді(II)

перетворюється в окислену форму, а оксид заліза (III) відновлюється: Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 +2FeSO4 +H2O. Кількість відновленого заліза визначають титруванням розчину перманганатом калію: 10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 +K2SO4 +2MnSO4 + 8H2O.

Титр перманганату калію встановлюють по щавлевій кислоті(5C2H2O4 + 2KMnO4 +3H2SO4 = 10CO2 + 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O) або по міді – 1 см3 точно

0,1 н розчина KMnO4 відповідає 6,36 мг Cu..

Необхідні реактиви. Розчин Фелінга I – 40 г сульфату міді розчиняють в1

дм3 дистильованої води; розчин			Фелінга II – 150 г гідроксиду натрію і200 г
сегнетової	солі	розчиняють	1в дм3	дистильованої	води; 0,1 н. розчин
перманганату калію – 3,16 г KMnO4 розчиняють в 1 дм3					гарячої дистильованої
води, після охолодження до20°С доводять до мітки						водою; залізоаміачні
квасци –	100 г	залізоаміачних	квасців	розчиняють	500в	см3 води, водний

розчин квасців переносять в мірну колбу на1 дм3 і обережно вливають 100 см3 концентрованої сірчаної кислоти, після охолодження доводять об’єм до мітки.

		Хід роботи:	см3
В	конічну	колбу 100–на150		вносять	піпеткою
20 см3	досліджуваного розчину цукру(в пробі повинно міститися50-60 мг
цукру;	якщо його більше,	то виконують необхідні		розведення). До	розчину

добавляють 20 см3 розчину

Фелінга I і 20 см3 розчину Фелінга II, перемішують, кип’ятять на протязі 3 хв (з моменту появи перших пухирців), накривши колбу часовим склом. Рідина після кип’ятіння повинна мати синій колір; якщо синє забарвлення відсутнє, то в пробі містилось більше 100 мг цукру; визначення слід повторити, розбавивши цукровий розчин.

Осаду оксиду міді(II), що утворився, дають відстоятися і обережно по паличці зливають рідину на фільтр через одне і теж місце краю колбочки. При цьому фільтр, вставлений в колбу Бунзена, повинен бути приєднаний до вакуум-насоса. Осад намагаються по можливості не переносити на фільтр.

6

Після зливу синьої рідини осад в колбі промивають струменем гарячої свіжо прокип’яченої води, яку також зливають на фільтр, залишаючи над осадом невелику кількість води для уникнення його окислення на повітрі. Осад, стінки колби і фільтра ретельно промивають водою до зникнення лужної реакції на лакмус. Потім фільтр знімають з колби Бунзена і переносять його на таку ж, але чисту колбу. До осаду оксиду міді(II) доливають 5-10 мл залізоамонійних квасців, перемішують і зливають на фільтр. Слід добитися повного розчинення осаду, при цьому поверхневий шар азбесту можна злегка скаламутить при виключеному вакуум-насосі. Після цього колбу і фільтр промивають холодною свіже прокип’яченою водою до зникнення в промивних водах кислої реакції на лакмус. Утворений оксид заліза(III) титрують 0,1 н розчином KMnO4 до переходу зеленого кольору в рожевий. Одна зайва крапля розчинуKMnO4 дає стійке рожеве забарвлення.

Таблиця 1.5

Співвідношення між вмістом глюкози (в мг) і кількістю відновленої міді (в мг) при визначенні редукуючих речовин за методом Бертрана перманганат ним методом

Мідь	Глюкоза	Мідь	Глюкоза		Мідь	ГлюкозаМідь	Глюкоза
2	0,98	27	13,35	53	26,79	78	39,72
3	1,37	28	13,85	54	27,30	79	40,83
4	1,82	29	14,37	55	27,84	80	41,39
5	2,27	30	14,90	56	28,10	81	41,94
6	2,94	31	15,40	57	28,37	82	42,50
7	3,43	32	15,90	58	28,90	83	43,05
8	3,92	33	16,40	59	29,42	84	43,51
9	4,41	34	16,90	60	29,95	85	44,18
10	4,90	35	17,40	61	30,50	86	44,80
11	5,40	36	17,90	62	31,05	87	45,33
12	5,92	37	18,42	63	31,58	88	45,89
13	6,37	38	18,95	64	32,11	89	46,44
14	6,87	39	19,45	65	32,67	90	47,00
15	7,35	40	19,95	66	33,21	91	47,55
16	7,84	41	20,47	67	33,74	92	48,11
17	8,33	42	21,00	68	34,25	93	48,67
18	8,92	43	21,53	69	34,83	94	49,22
19	9,31	44	22,05	70	35,39	95	49,78
20	9,80	45	22,58	71	35,94	96	50,35
21	10,30	46	23,10	72	36,47	97	50,94
22	10,80	47	23,63	73	37,00	98	51,50
23	11,31	48	24,16	74	37,55	99	52,07
24	11,84	49	24,70	75	38,10	100	52,65
25	12,35	50	25,21	76	38,63	101	53,23
26	12,85	51	25,74	77	39,17	102	53,81
		52	26,26			103	54,39

7

Для розрахунку кількості цукру q спочатку визначають вміст в пробі міді: qCu = n/T,

де qCu – вміст міді, мг; n – кількість 0,1 н розчину KMnO4, яке пішло на титрування, см3;

T – титр розчину KMnO4 по міді (1 см3 точно 0,1 н розчину KMnO4 відповідає 6,36 мг Cu).

Потім за табл. 1.5 визначають кількість цукруq в пробі і розраховують кількість цукру з врахуванням розведення досліджуваного розчину.

Приклад: В мірну колбу на 100 см3 відібрали 5 см3 гідролізату і довели до мітки дистильованою водою; звідки взяли 20 см3 на визначення цукру. На титрування пішло 10,4 см3 0,1 н розчину KMnO4, титр якого по міді рівний 6,24, qCu = 10,4×6,24 = 64,8 мг. З табл. 1.5 знаходимо, що даній кількості міді відповідає 32,57 мг глюкози. Кількість глюкози у вихідному гідролізатіq = 32,57×100/(5×20) = 32,57 мг/см3.

Визначення редукуючих цукрів (РЦ)

В колбу піпеткою вносять5-9 мл розчину, що досліджується і дистильованої води до загального об’єму10 мл. Із бюретки додають по10 мл розчину Фелінга І і Фелінга ІІ. Колбу ставлять на плитку і кип’ятять протягом 2 хв (рівно). Після охолодження додають 15-20 мл 20 % сірчаної кислоти і 3 г йодистого калію. Йод який виділився титрують0,1 н розчином тіосульфату. Коли розчин йоду починає світлішати додають2-3 краплини крохмалю і

продовжують титрувати до зникнення синього забарвлення і виділення білого осаду. Кількість міді, яка пішла на реакцію з глюкозою, визначають за формулою:

Cu = (a - b) ´ K ´ 6,36 , де: c

а - кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування контролю, мл; b - кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування досліду, мл; К - поправочний коефіцієнт (К=1); 6,36 - кількість мг міді, яка відповідає 1мл 0,1 н тіосульфату;

с - кількість досліджуваного розчину, яка пішла на титрування, мл.

Потім за табл. 1.6 визначають кількість редукуючи речовин в пробі і розраховують кількість цукру з врахуванням розведення досліджуваного розчину.

8

Таблиця 1.6

Співвідношення між вмістом глюкози та інвертного цукру (в мг) і кількістю відновленої міді (в мг) при визначенні редукуючих цукрів

Вміст	Відновлення міді, мг			Вміст	Відновлення міді, мг
		під дією:				під дією:
цукру	глюкози		інвертного	цукру	глюкози		інвертного
			цукру				цукру
10	20,4		20,6	29	57,3		57,1
11	22,4		22,6	30	59,1		59,3
12	24,3		24,6	31	61,3		61,5
13	26,5		26,5	32	62,3		63,4
14	28,5		28,5	33	64,6		64,9
15	30,5		30,5	34	66,5		66,7
16	32,5		32,5	35	68,3		68,8
17	34,5		34,5	36	70,1		70,2
18	36,4		36,4	37	72,0		72,2
19	38,4		38,4	38	73,8		73,9
20	40,4		40,4	39	75,5		75,7
21	42,3		42,3	40	77,5		77,6
22	44,2		44,2	41	79,3		79,5
23	46,1		46,1	42	81,1		81,5
24	48,0		48,1	43	82,9		83,2
25	49,8		49,8	44	84,9		84,9
26	51,7		51,7	45	86,4		86,7
27	53,6		53,6	46	88,2		88,5
28	55,5		55,5	47	90,0		90,1
				48	91,8		92,2

Завдання до виконання:

1.Проаналізувати органолептичні показники меляси.

2.Визначити редукуючи цукри в мелясі.

3.Визначити вміст сахарози в мелясі.

4.Перевірити рівень кислотності меляси

Контрольні питання

1.Назвіть та дайте характеристику відходам інших виробництв, які використовуються як біотехнологічна сировина.

2.За якими показниками перевіряється якість меляси?

3.В чому полягає метод визначення редукуючих цукрів?

4.Що таке активна та титруємо активність?

5.В чому полягає метод визначення сахарози?

9

Лабораторна робота №2 Продукти біотехнології. Аналіз готової продукції

Мета роботи: ознайомлення з методами та способами аналізу продуктів біотехнології; опанування методів якісного та кількісного аналізу продуктів біотехнології.

Матеріали та обладнання: дріжджі пресовані та сухі, центрифужні пробірки (мірні), пікнометр, камера Горяєва, мікроскоп, фільтрувальний папір, конічні колби, піпетки, бюретки, хімічні стакани, пробірки, прилад Чижової.

	Основні теоретичні відомості
Хлібопекарські	дріжджі	являють	собою	технічно	чисту	культуру

дріжджів Saccharomyces serevisіae.

Відповідно ГОСТ 171-69 дріжджі хлібопекарські пресовані повинні мати сірувато-жовтуватий колір (на поверхні бруска не повинно бути темних плям), щільну консистенцію, властивий пресованим дріжджам запах, не допускається запах цвілі й інші сторонні запахи.

За фізико-хімічними та біохімічними показниками пресовані дріжджі повинні відповідати наступним нормам:

-вологість - не більше 75%;

-підйомна сила не більше 75 хвилин;

-кислотність – 120 мг оцтової кислоти на100 г дріжджів у день вироблення і 360 мг після 12 діб зберігання при температурі 0-4 °С;

-стійкість дріжджів при температурі зберігання 35°С не менше 48 годин. Сушені дріжджі повинні задовольняти вимогам ОСТ18193-74. Вони

діляться на вищий і1 сорт. У дріжджів вищого сорту підйомна сила– 70 хв, вологість 8 %, термін зберігання 12 місяців у герметичній тарі.

Підйомна сила дріжджів 1 сорту – 90 хв, вологість 10%, термін зберігання 5 місяців.

Визначення щільності і розмірів дріжджової клітини
При	виділенні		більшості			цільових	продуктів		біотехнологічн
виробництв (хлібопекарські дріжджі, ферменти, антибіотики і т.п.) необхідно
відокремити	клітинну біомасу				від	культуральної		.рідиниДля	цього, в
основному,	використовують		механічні			способи, такі, як		центрифугування,
сепарація і фільтрація.
Розглянемо		процес	центрифугування				або	процес	осадження
відцентровому полі. Відповідно до закону Ньютона опірR для одиночної
частки, яка поміщена в потік рідини необмеженого розміру, визначається за
рівнянням:				1		2
			R =		gcCDсmU0A , де:
				2

CD - коефіцієнт тертя;

ρm- щільність рідини, кг/м3;

10

U0 — відносна швидкість між рідиною й одиночною часткою, м/сек;

А - площа перетину частки, перпендикулярного напрямe руху рідини, м2;

gc - коефіцієнт перерахунку.
Співвідношення			між коефіцієнтом		тертяD	Сі числом Рейнольдса
( NRe =	DpU0сm	) для	сферичних	часток	при	значенняхNRe<0,3 буде
	м

наступним:

24 CD = NRe

Це рівняння було теоретично отримане з рівняння:

Rgc = 3ррм pU0

Одержані рівняння являють собою вираження закону Стокса, μ і Dp — в'язкість рідини і діаметр частки відповідно.

Закон Стокса, як правило, застосовуємо для мікробної суспензії, що розведена так, що можна знехтувати впливом сусідніх часток на рух окремої частки. Приймемо для простоти, що в першому наближенні мікробні частки мають сферичну форму.

У випадку рівноважного стану сили опору, що впливають на мікробні клітини, дорівнюють рушійній силі. У цьому випадку швидкість осіданняU0 дорівнює кінцевій швидкості окремої частки.

Таким чином видно, що в гравітаційному полі попередні рівняння будуть наступний вигляд:

3pmDpU0 = р6 D3p(с y -сm)g

U0 =	Dp (с y -с m )g	,
	18м

де ρу - щільність мікробних клітин, кг/м3; g - прискорення сили ваги, м/сек2.

У відцентровому полі

		2	(с y -сm )g
	ZDp
Uc0 =					ZU0 ,
			18м
де Uc0 - швидкість осідання		одиночних		часток у відцентровому полі,

м/сек;

Z - відцентрова сила ( rv 2/g );

r - відстань по радіусу від центра обертання, м; ω - кутова швидкість обертання, рад/сек.

Через те, що при цьому відбувається зростання концентрації клітин, необхідно враховувати вплив сусідніх часточок на рух одиночної клітини. Величина U0 в цих випадках зменшується доU і осадження таких часток називають «примусовим» осадженням. Розділення суспензії мікробних клітин

11

як у гравітаційному, так і відцентровому полях відноситься до цієї загальної категорії примусового осадження.

Можна показати, що опір R′, що впливає на сферичну частку, яка рухається з швидкістю U, при примусовому осадженні:

R'= 3рmDpU(1+ в0Dp ) L

де L - відстань між сусідніми частками; β0— коефіцієнт.

Величина β , визначена Смолуховським для прямокутного розподілу часточок, дорівнює 1,16.

Якщо зробити відповідну заміну величиниDp для не кулястих часточок, то при кубічному розподілі справедливе рівняння:

	Dp	1
		= вc 3
	L

де β- геометричний фактор; с — об‘єм часточок.

Хоча дане рівняння можливо використовувати лише для розведених суспензій, можна припустити, що величина β0 є функцією с:

в

0

= в'

+ f(c)

0

де β0= β0′, коли с наближається до нуля.

Тоді отримаємо:

1 ù

1

R' = 3р ×мD U

é

'

ê1+ íìв

+ f(c)ýüвc3ú = 3р ×мD U(1+ бc3) ,

p

ê

î

0

þ

ú

p

ê

ú

ë

де б = в[в'

û

+ f(c)].

0

Оскільки у випадку осадження R=R′, то:

U

=

1

U

1

o

1+ бc3

Для встановлення функціональної залежності величиниа від значення з,

були використані

експериментальні

дані

багатьох

дослідників з метою

порівняння величин U/U0 і с.

Величини U і U0

були визначені з наступного співвідношення:

U =

u

або U =

u0

1+ c

1+ c

0

де

u

-

швидкість

осідання

часточки за примусового осадження в

гравітаційному полі або питомої швидкості потоку, віднесена до площі

поперечного перерізу ємності;

u0

-

швидкість

осідання

часточки

за примусового

осадження

у

відцентровому

полі. Емпіричні

рівняння,

що

зв'язують а

і с для

часточок

неправильної форми:

12

б=1+305c2,84, де 0,15<с<0,5;

для сферичних часток

б=1+ 229c3,43, де 0,2<с<0,5;

для розведених суспензій
б =1 » 2 , де с<0,15.
Розглянемо	процес	фільтрування. Фільтр	являє	собою	тканину	з
синтетичних або	інших	матеріалів. Ефективні	розміри	отворів	фільтру не
обов'язково повинні бути менше розмірів клітин, які затримуються, внаслідок
так званого «ефекту перекривання», що спостерігається в				процесі	утворення

фільтруючого шару. Проходження рідини через цей новий фільтруючий шар дозволяє одержати чистий фільтрат. Широко розповсюджений варіант фільтру, в якому шар фільтруючого матеріалу, наприклад, інфузорна земля, наноситься на поверхню фільтра.

Величина тиску, що визначає процес фільтрування, ∆р=р 2-р1. У процесі фільтрації в результаті збільшення фільтруючого шару буде зростати опір

фільтруванню.

Отже, якщо

при

фільтруванні

величина

∆р

залишається

постійною, то швидкість фільтрування, виражена в одиницях об'єму фільтрату,

отриманого за одиницю часу з одиниці поверхні фільтру, буде зменшуватися.

Цей спосіб «фільтрування під постійним тиском» зазвичай використовується в

промисловості.

Розглянемо швидкість фільтрування, віднесену до одиниці поверхні

фільтра, позначивши загальну площу фільтрування

А(м2). Приймаючи, що

потік

рідини

через

капілярну

сітку

пір

фільтруючого

шару

філ

визначається

величиною

її

в'язкості, виразимо

рівняння

швидкості

в

наступному вигляді:

dV

Дpgc

=

dи

(r

+ r

)м

m

c

де V – об‘єм фільтрату, отриманий з одиниці поверхні фільтра, м3/м2 ; θ - тривалість фільтрації, сек; ∆р - рушійна сила, перепад тиску на фільтрі і фільтруючому шарі, Па; gc - коефіцієнт перерахунку;

rm- коефіцієнт опору середовища, 1/м;

rc - коефіцієнт опору фільтруючого шару, 1/м; μ - в'язкість фільтрату, кг/(м×сeк).

Величина rm є характеристикою фільтра і не залежить від часу фільтрації; величина rc буде зростати в процесі фільтрації і через якийсь час значно перевищить величину rm.

Позначивши загальну кількість твердої фази у вихідній суспензії через W, а поверхню фільтра А одержимо рівняння:

rc = бR W A

де α - коефіцієнт пропорційності (питомий опір шару), м/кг.

Величина αR може залежати або не залежати від тиску, спрямованого на фільтруючий шар («не пружний» і «пружний» фільтруючі шари). Фільтруючі

13

шари, які використовуються в біотехнології, належать, як правило, до категорії не пружних фільтруючих шарів.

У зв'язку з цим легко встановити кількісні співвідношення між вихідною суспензією, фільтратом і фільтруючим шаром в перерахунку на одиницю маси (у кг) вихідної суспензії.

Позначимо: ω - маса сухого шару, кг/кг; mω - маса вологого шару, кг/кг;

(1-mω) - маса фільтрату, кг/кг.

Тоді маса рідини, що утримується в вологому фільтруючому шарі, буде дорівнювати: m(ω-1), кг/кг.

Якщо щільність рідини, що утримується в вологому фільтруючому шарі, дорівнює щільності фільтрату, то об‘єм вологого шару складається з об‘єму сухого шару і об‘єму рідини, що утримується в вологому шарі:

mщ		=		щ		+		(m -1)щ			,
с y				сd					сm
	m		=		1		+		m -1
									сm
	с y				сd

де ρу - щільність вологого шару, кг/м ; ρd- щільність сухого шару, кг/м ;

ρm - щільність фільтрату, кг/м.

Величина m набуває постійного значення тільки наприкінці процесу нормального фільтрування. І дійсно, m залежить від умов процесу і від фізичних властивостей твердої фази(клітин), суспендованої у вихідній рідині.

При додатковому ущільненні фільтруючого шару, що часто має місце в промислових процесах, величина m зменшується в процесі фільтрування.

Хід виконання роботи:

Визначення щільності і розмірів дріжджової клітини.

Щільність клітин ρу може бути визначена, якщо відомі величини ρс, ρm і с, з рівняння:

с y = сc + (1c- c)сm ,

де ρу - щільність клітин, г/см3 ; ρс - щільність суспензії, г/см3 ;

ρm - щільність середовища, г/см3 ;

с– об‘єм клітинної фракції в суспензії.

1.Величини ρс і ρm визначають пікнометричним методом.

2.	Для	визначення	, сдріжджову	суспензію	поміщають у мірну пробірку
об‘ємом		10 см3 і центрифугують		при700 об/хв протягом 10 хв. Відношення
об‘єму осаду V0 до об‘єму суспензії VС дає величину с.
3.	Для	визначення	діаметра дріжджової		кліткиDp підраховують кількість

клітин n у 10 см3 суспензії і розраховують за формулою:

14

			D	= 3 6V0
			p		рn
Прискорений метод			визначення	вологості продуктів на приладі Чижової.
Сутність методу полягає у висушуванні наважки досліджуваної речовини між
двома		нагрітими	металічними	плитами. Загальний			час	визначення	не
перевищує 35-40 хвилин.
	Техніка визначення:
1.	Виготовити пакети (2 шт на 1 дослід) ( - пакет).

2.Пронумерувати їх простим олівцем.

3. Висушувати їх протягом 3 хвилин t = 165-170 °С. Після цього пакети на 5-6 хвилин лишають в ексикаторі для охолодження, а потім зважують на технічних терезах з точністю до0,01 г. У заготовленні сухі пакети зважують приблизно 5 г речовини для визначення вологості середньої . пробиЗа можливістю розміщують речовину у конверті рівним шаром, потім пакет з

вологою наважкою зважують і вкладають у прибор			Чижової, де пробу
висушують	при t=165-170°С	впродовж 7 хвилин. Після	5-6 хвилин
охолодження, в ексикаторі пакети з наважкою знов зважують.
Вологість розраховують за формулою:

W= a - в ×100

а- б

де W- вологість;

а – маса пакета з наважкою до висушування, г;

б– маса сухого висушеного пакета, г;

в– маса пакета з наважкою після сушки, г.

Здвох пакетів знаходимо середнє значення вологості.

Визначення кислотності пресованих дріжджів

Хід роботи.

10 г пресованих дріжджів зважують на технічних вагах, у порцеляновій чашці або склянці; розтирають їх з50 мл дистильованої води і титрують розчином NaOH у присутності фенолфталеїну до появи рожевого забарвлення, що не зникає протягом декількох секунд.

Кислотність дріжджів визначають за формулою:

x = 6´100 ´a 10

де х - кислотність дріжджів у перерахуванні на оцтову кислоту;

а - кількість 0,1 н розчину NaOH, який пішов на нейтралізацію, мл; 6 - кількість оцтової кислоти, що відповідає мол 0,1 розчину NaOH.

При визначенні результатів аналізу десяті долі до 0,5 відкидають, а десяті долі, рівні 0,5 і вище, округлюють до одиниці.

15

Визначення стійкості пресованих дріжджів (термостатна проба)

Хід роботи.

Загорнутий у папір брусок дріжджів масою0,5 або 1 кг поміщають у термостат при 35 °С зберігають доти, поки дріжджі не розм‘якнуть або не висохнуть. Час (у годинах), що минув від моменту внесення дріжджів у термостат до розм'якшення їх, характеризує стійкість. Стійкі при зберіганні дріжджі в таких умовах зберігаються більше100 год і висихають. Нестійкі дріжджі розм‘якшуються через48 год і раніше, такі дріжджі вважаються непридатними для далеких перевезень.

Визначення ферментативної активності пресованих дріжджів

Цим методом визначають зимазну активність– швидкість зброджування глюкози або мальтазну активність – швидкість зброджування мальтози.

Мальтазну й зимазну активність виражають кількістю часу(у хвилинах), необхідного для виділення 10 мл вуглекислого газу при зброджуванні розчину мальтози або глюкози пресованими дріжджами.

Дріжджі високої якості мають зимазну активність30-40 хв, мальтазну -

50-90 хв;	дріжджі задовільної	якості мають зимазну	активність41-70 хв,
мальтазну - 90-100 хв. Якість		дріжджів вважається	незадовільною, якщо
зимазна активність перевищує 70 хв, мальтазна - 100 хв.
При	визначенні	ферментативної	активності	корист
мікрогазометром.

Прилад складається з колби із притертою ,пробкоюз‘єднаної з відградуйованою бюреткою, яка заповнена підфарбованим насиченим розчином

солі. Бюретка з‘єднана з колбою, заповненою розчином повареної солі.
Хід роботи.
0,5 г пресованих дріжджів поміщають у ,колбузаливають	10	мл
водопровідної води з температурою35 °С и розмішують	до	повного

розчинення. До отриманої суспензії дріжджів додають10 мл 10 %-го розчину цукру (сахарози, глюкози або мальтози) і швидко закривають колбу пробкою. Переміщаючи бюретку в штативі, встановлюють рівень рідини на поділку«0». Поміщають колбу в термостат при температурі35 °С. Спостерігають за часом

виділення	10	мл вуглекислоти, тобто				відзначають		час, протягом		якого	з
бюретки буде витиснуто 10 мл сольового розчину.
		Визначення осмочутливості пресованих дріжджів
Метод		заснований		на	порівняльній			оцінці	підйомної		сили
нормальному й підвищеному осмотичному тиску, тобто в тесті без солі й з
підвищеним змістом солі.
Різниця		в	,часівиражений			у	хвилинах, арактеризує			ступінь
осмочутливості досліджуваних дріжджів.
Хід роботи.
На технічних вагах зважують дві наважки випробуваних дріжджів по0,31
г кожна. До першого навішення додають 4,8 мл водопровідної води, нагрітої до
35 оС, і	ретельно		розмішують		за	допомогою		шпателя або		товкачика в

16

порцеляновій чашці або ступці. До отриманої дріжджової емульсії додають від 6,5 до 7,5 г (залежно від вологості) борошна 85 %-го помелу і швидко замішують тісто, надаючи йому форму кульки, яка не повинна прилипати до рук. Кульку опускають у склянку з водою при температурі32 °С, а склянку поміщають у термостат з температурою 32-34 °С.

Підйомна сила характеризується часом, що минув з моменту опускання кульки у воду до моменту її спливання.

До другої наважки додають4,8 мл 3,35 %-го розчину повареної солі, нагрітого до 35 °С, і далі дослід проводять так само як і з першою наважкою.

Кулька, замішана без солі спливає швидше ніж кулька з сольовим розчином підвищеної концентрації.

Примітка. Час спливання кульки у хвилинах необхідно помножити на коефіцієнт 3,5, отриманий емпірично.

Завдання до виконання:

5. Визначити щільність і розміри дріжджової клітини.

6. Визначення кислотності пресованих дріжджів.

7. Перевірити осмочутливість пресованих дріжджів.

8. Визначити ферментативну активність пресованих дріжджів.

9. Визначити стійкість пресованих дріжджів.

	Контрольні питання
1.	При одержанні яких продуктів необхідно відокремлювати клітинну масу від
культуральної рідини?
2.	Які способи використовують для відокремлення клітинної маси від

культуральної рідини?

3.На яких фізичних законах заснований процес центрифугування?

4.У чому полягає сутність закону Стокса?

5.	Чому	дорівнює	швидкість	осідання	поодинокої	частки	в	гравітаційному
полі?
6.	Чому	дорівнює	швидкість	осідання	поодинокої	частки	у	відцентровому
полі?

7.Дайте визначення поняття «примусового» осадження часток.

8.Які особливості процесу фільтрування під постійним тиском?

9.Яким рівнянням описується швидкість фільтрування?

10.Від яких факторів залежить швидкість фільтрування?

11.За якими показниками оцінюють правильність ведення технологічного процесу? Назвіть їхні оптимальні величини.

12.Якими методами визначають концентрацію дріжджів у культуральному середовищі і дріжджовому молоці?

13.Назвіть методи визначення вологості дріжджів.

14.За якими показниками оцінюють якість готової продукції(пресованих дріжджів)?

15.Назвіть методи визначення ферментативної активності дріжджів.

16.За якими показниками оцінюють якість сухих дріжджів?

17

Лабораторна робота №3 Посівний матеріал. Підготовка посівного матеріалу. Чиста та

накопичу вальна культура

Мета роботи: ознайомитись з способами підготовки					та зберігання
посівного матеріалу в біотехнології. Опанувати методи аналізу посівного
матеріалу. Навчитись	готувати	посівний	матеріал	для	глибинного	т
поверхневого культивування

Матеріали та обладнання: мікроскопи, предметні та накрівні скельця; бактеріологічні петлі та голки; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою ФЕК з набором кювет, рефрактометр, набори для мікроскопії, культури продуцентів.

Основні відомості

Номенклатура біологічних агентів, які використовуються в біотехнології, бурхливо розширюється:

-	клітини мікроорганізмів (бактерії, актиноміцети, гриби, найпростіші),
тварини,	рослини, у тому числі отримані методами генної та клітинної

інженерії;

-віруси, у тому числі бактеріофаги;

-компоненти клітин: протопласти, мембрани, мітохондрії, хлоропласти, внутрішньоклітинні ферменти та ін;

-позаклітинні продукти: ферменти, коферменти;

-іммобілізовані клітини мікроорганізмів, тварин, рослин, їх компоненти та позаклітинні продукти.

Підготовка біологічного агента
Посівним	матеріалом		називають			чисту	культуру		мікроорганізму,
одержану шляхом її послідовного пересіву з пробірки в колбу, а потім в посівні
апарати (інокулятори), об’єм яких поступово збільшується(як правило,										від
стадії до стадії у 10 разів).
Необхідно		періодично	проводити		розсів		культури		і	перевірку
однорідності як за морфологічними, так і фізіологічними ознаками, тому що
при тривалому зберіганні навіть зовсім					однорідних клітин і				спор можуть
виникнути спонтанні нерегульовані мутації.
При розсіві з колонії, що дала найкращі показники на діагностуючому
середовищі, роблять новий розсів у30–40					пробірок. Потім з кожних5–6
пробірок відбирають одну і перевіряють мікроорганізм, що знаходиться в ній,
на здатність утворювати ту речовину, продуцентом							якого	він .	єГотову
культуру в пробірках поміщають у холодильник і зберігають при температурі
3–4 °С. Пересівання культур проводять через визначені проміжки часу з таким
розрахунком, щоб		найкращим		способом		зберегти		фізіолого–біохімічні
властивості штаму.

18

Для готування необхідної кількості посівного матеріалу на заводі організується цех чистої культури, що веде постадійне вирощування посівного матеріалу в асептичних умовах. Технологія одержання виробничого посівного матеріалу залежить від виду мікроорганізма–продуцента і способу його культивування.

Зберігання вихідних штамів продуцентів

Жоден з численних способів збереження живих культур мікроорганізмів не дає повної гарантії стабільності штаму і збереження його продуктивності.

Найчастіше		підтримка вихідної		культури	продуцента		здійснюється
шляхом	висіву	мікроорганізмів	у	пробірки	на	скошені	агаризирова
середовища з оптимальним для кожного штаму складом і вирощування його до
визначеного віку		в оптимальних		умовах. Готову	культуру в		пробірках

поміщають у холодильник і зберігають при температурі3–4°С. Пересівання культур проводять через визначені проміжки часу з таким розрахунком, щоб щонайкраще зберегти фізіолого–біохімічні властивості штаму. Для тривалого збереження деяких штамів доцільно використовувати бідні цукрами крохмальні середовища.

При частих пересіваннях (1 раз у 3–4 місяця) можуть виникати мутанти з характеристиками, що відрізняються від властивостей оригіналу.

Більш тривалий час можна зберігати культуру під шаром вазелінової олії. Для цього доцільно використовувати вазелінову олію медичного призначення. Вона не повинна містити токсинів і окислених продуктів. Шар олії повинний бути тільки на ~1 см вище агарового зрізу, інакше можлива загибель культури через недолік кисню. Попередньо олію стерилізують при0,15 МПа протягом 1,5 годин. Культуру заливають охолодженою стерильною олією після того, як вона досягне повної фізіологічної зрілості. Для цього способу збереження найкращим середовищем вважається картопляно–мальтозний агар.

Відомі способи збереження культур при температурах від –11 до –14°С. В таких умовах культури зберігають активність протягом10–16 місяців без

пересівання.
Перспективним	варто	визнати	спосіб	збереження	культур
ліофілізованому стані. Культуру мікроорганізму вносять у захисне середовище,

у якості якої можна використовувати цукрожелатинове середовище ., й ін поміщають у стерильні ампули, закривають стерильними ватяними тампонами і

швидко заморожують при температурах від–35 до –78	°С. Потім	ампули
переносять у вакуум–сушильний апарат і висушують при тиску13,33–1,33 Па
протягом 25–30 год. Ліофільно висушені культури	можуть	зберігатися

5–6 років і більш, не втрачаючи здатності продукувати ферменти.

Вихідний штам може зберігатися на зерні або в ґрунті. Для цього ґрунт стерилізують і вносять у неї культуру продуцента. При поновленні культури змив з ґрунту висівають на чашки Петрі. Якщо продуцент зберігають на пшоні, то для цього пшоно, очищене від домішок, кип'ятять у мінімальній кількості води (0,8 л на 1 кг пшона), розпарюють 30 хв. Охолоджене пшоно засипають у стерильні флакони об’ємом250 мл, які потім стерилізують при0,1 МПа

19

протягом 40 хв. На стерильне розпарене пшоно засівають2 мл густої суспензії конідій або 3 мл дводобового вегетативного міцелію, вирощеного в колбах на качалці. Культуру продуцента вирощують при періодичному струшуванні при температурі 25–30 °С. Вирослу культуру висушують до вологості7–8 % у вакуумі при 25 °С протягом 60–70 год і в такому виді зберігають від1 до 3–5 років.

Існує так називаний метод α–висушування– це висушування під вакуумом безпосередньо з рідкого середовища. При α–висушуванні також використовують різні «носії»: стерильні смужки фільтрувального папера, волокна целюлози, кварцові кульки, таблетки крохмалю й ін. Однак цей метод не завжди дає гарні результати по виживанню мікроорганізмів.

В останні роки, особливо в національних колекціях(США – АТСС; Німеччина – DSM і ін.) поряд з ліофілізацією культури зберігають у рідкому азоті при наднизьких температурах. Так, наприклад, грибні культури успішно зберігають у замороженому стані в атмосфері рідкого азоту при температурах від –165 до –196°С. Мікроскопічні гриби заморожують у 10% водяному розчині гліцерину в запаяних ампулах. Ампули з замороженими культурами поміщають у контейнер з рідким азотом, де їх зберігають 5 і більш років. Однак цей метод

вимагає	складного	устаткування і його використовують тільки у	великих
колекціях	і для	культур, що не витримують ліофільного висушування
(Micromonospora, Micropolyspora, деякі неспорулюючі міцеліальні гриби і			ряд
ін. мікроорганізмів).

Для підготовки виробничої посівної культури вихідний штам продуцента ферментів пересівають у 12–20 повторюваннях на нове поживне і середовище проводять її культивування в термостаті при оптимальній температурі до визначеного віку. Це буде обновлена вихідна заводська культура, саме вона є стартовою культурою для приготування посівного матеріалу.

Одержання посівного матеріалу

Підготовка посівного	матеріалу для поверхневого культивування.
Цей спосіб застосовують	в основному для культивування мікроскопічних

грибів. Посівний матеріал у цьому випадку може бути приготовлений двох видів: у виді культури, вирощеної на твердому поживному середовищі і міцеліальній масі продуцента, вирощеної на рідкому середовищі глибинним способом. Незалежно від виду посівного матеріалу послідовність операцій однакова:

-приготування поживного середовища;

-стерилізація поживного середовища і апаратури;

- охолодження середовища з дотриманням правил асептики д температури росту культури;

-засіву середовища вихідним штамом продуцента;

-вирощування культури продуцента до визначеного віку;

-консервування посівного матеріалу.

20

Приготування поживного середовища зводиться до точного дозування окремих компонентів середовища і їхньому змішуванню у визначені послідовності. Цей процес можна вести в спеціальній ємності – змішувачі або в апараті, призначеному для стерилізації. Умови стерилізації залежать від складу середовища і її стану. Всю апаратуру і комунікації стерилізують гострою парою при надлишковому тиску0,15–0,35 МПа. Охолоджувати середовище можна

стерильним холодним повітрям або холодною водою через глухі поверхні теплообміну. Засів середовища ведуть водяною суспензією продуцента з

дотриманням правил асептики.
Вирощування проводиться у			спеціальному .цехуГотовий посівний
матеріал консервують або висушуванням, або збереженням при низьких
температурах. Терміни збереження встановлюються для кожного продуцента
експериментально.
Посівну	культуру	готують	на	твердому	поживному	середовищ,

вирощуючи мікроорганізми у зростаючому кількості в три чи чотири етапи. Склад поживного середовища визначається властивостями мікроорганізму– продуцента. Найчастіше для цієї мети використовують зволожені пшеничні висівки. Іноді до середовища додають солодові паростки, деревний пил, бурячний гніт. У залежності від продуцента вологість середовища після стерилізації складає 45–56 %.

Вихідну музейну культуру продуцента на твердому агаризованому середовищі пересівають для відновлення спочатку на1–1,5 мл зволожених стерильних висівок у пробірці. Пробірку поміщають у термостат і вирощують культуру при оптимальній температурі до рясного утворення конідій. Вміст

пробірки переносять у3–4 колби місткістю 0,75–1 л, що	містять 40–100	г
пухкого вологого стерильного середовища, і вирощують	продуцент за	тих
самих умов.

Підготовлений у колбах у достатній кількості посівний матеріал використовують для засіву поживних середовищ, які попередньо стерилізують у біксах при0,15 МПа протягом 60 хв. Засіяне середовище розміщається на стерильних кюветах. Звичайно посівні кювети мають прямокутну форму, виконуються з оцинкованого неперфорованого заліза, що мають одне чи два отвори, що закриваються ватно–марлевими серветками. Трьох колб посівної культури досить для засіву20–25 кювет. Засіяне середовище розкладають у посівні кювети шаром 0,8–1,2 см; між кюветою і кришкою прокладають шар непроклеєного паперу для запобігання можливої конденсації вологи на кришці і створення зон зайвого зволоження зростаючої культури. Закриті кювети із середовищем поміщають у спеціальні ростильні камери для посівної культури на стаціонарні чи стелажні етажерки. У камері підтримують визначені вологість і температуру режим, оптимальні для вирощуваного мікроорганізму і утворення конідій. Камери заповнюють кюветами з розрахунку не більш1–2 кг засіяного

середовища (по сухій масі) на 1 м3 камери, повітрообмін у такій камері повинний бути 2–3 м3/(м3×ч).

21

Готовий посівний матеріал знімають з кювет за допомогою ручного

маніпулятора	і	у вологому стані поміщають у стерильні, щопакети
відправляють на збереження в камеру з температурою не 4вище°С до
закінчення	його	мікробіологічної	і	біохімічної	перевірки. Тривалість

збереження посівного матеріалу не повинна перевищувати3–4 днів, тому що волога культура навіть при низькій температурі поступово стає малопридатною для одержання активної виробничої культури. Приготовлена вищеописаним способом посівна культура повинна містити не менш0,7 млрд. спор в 1 г. Посівний матеріал не повинний містити сторонньої мікрофлори.

Якщо посівний матеріал задовольняє усім вимогам, його передають з холодного приміщення у відділення готування посівної суспензії. Посівний матеріал змішують у спеціальній судині зі стерильною водою і невеликою

кількістю поверхнево–активної речовини для підвищення					змочування	.спор
Така суспензія і є готовим посівним матеріалом.
Крім	кюветного	способу	одержання	посівного	матеріалу	існують

розробки по виробництву посівного матеріалу у виді поверхневої культури на механізованих установках.

Підготовка посівного матеріалу для глибинного культивування.

Для засіву виробничого середовища при глибинному спо культивування посівний матеріал готують також глибинним способом. Вид посівного матеріалу залежить від продуцента: для грибів і актиноміцетів– це міцеліальна маса, а для бактерій – молода спороносна культура.

Етапи одержання посівної культури наступні:

1)відновлення вихідної культури на агаризованому середовищі;

2)вирощування культури на рідкому середовищі в колбах на качалці;

3)культивування продуцента в малому, а потім, якщо потрібно, у великому інокуляторі.

Посівна доза при засіві глибинною культурою порівняно велика– від 1 до 15 %, тому число стадій і об’єм інокуляторів визначаються тільки

продуктивністю підприємства й оптимальною нормою витрати посівного матеріалу для даного продуцента.

Технологічна схема готування посівного матеріалу для глибинного культивування:

-Вихідний продуцент із пробірки пересівають на матраци з великою кількістю агаризованого середовища.

-З матраців культуру змивають стерильною водою й у виді суспензії використовують для засіву колб. Частіше засівши ведуть відразу з пробірки в колби.

-Колби закріплюють на качалці, що струшує рідину в колбах і сприяє

розчиненню	кисню	в	середовищі, забезпечуючи	нормальні	умови
життєдіяльності мікроорганізмів.

22

- Готову культуру з колб збирають в одну ємність при дотриманні правил асептики і переносять у малий інокулятор зі стерильним охолодженим середовищем. Засів ведуть у полум'ї палаючого смолоскипа через посівний патрубок інокулятора.

-У малий інокулятор через індивідуальний фільтр подається стерильне повітря. Підготовку, стерилізацію й охолодження поживної проби середовища ведуть у малому інокуляторі.

-Піногасник стерилізують і прохолоджують у спеціальній ємності і подають у малий інокулятор за потребою.

-Для великого інокулятора середовище готують, як правило, у спеціальних апаратах, потім його стерилізують, охолоджують приблизно до 30–40 °С і подають у стерильний охолоджений до 60–70 °С великий інокулятор,

вирівнюють температуру середовища до оптимальної						для	вирощуваного
продукту.
- Після	цієї	операції	готову	культуру	з		малого	інокул
передавлюють стерильним повітрям у великий інокулятор на свіже поживне
середовище.
- Культивування на всіх стадіях ведеться при оптимальній температурі
й аерації. Звичайно		готовий посівний		матеріал відразу		ж	передають у
виробництво.

-Якщо ж виникають непередбачені затримки, то посівний матеріал безпосередньо в інокуляторі охолоджують до 8–10 °С, але зберігають не більше 2–3 год, інакше його якість може різко погіршитися.

-Посівний матеріал, отриманий будь–яким способом, підлягає мікробіологічному і біохімічному контролю.

Посівний матеріал вважається активним, якщо він забезпечує нормальну

тривалість	культивування				на	виробничому		середовищі		і	досягне
максимального нагромадження ферментів за цей термін. Він не повинний
містити сторонньої мікрофлори.
Дозування і вік посівного матеріалу
Занижені дози посівного матеріалу приводять								до	різкого	уповільнення
процесу культивування. У зв'язку з цим для кожного виробничого штаму
встановлюється			оптимальне			дозування		посівного		. матеріалуДля
забезпечення			нормального			розвитку	мікроскопічних				грибів
поверхневому способі культивування в умовах стерильного середовища і
стерильного		повітря		досить		внести0,02–0,05	%	посівної спороносної
культури з титром 106 спор на 1 г. У заводських умовах, де часто неможливо
досягти повної стерильності виробничих середовищ, посівний										матеріал
вносять з розрахунку 0,2–1,0 % від маси сировини, що переробляється.
При	використанні			міцеліального посівного				матеріалу		його	витрата
зростає до 1,5–2,5 %. Використання глибинного							посівного		матеріалу трохи
затягує процес росту виробничої поверхневої культури, але він більш
перспективний,		тому	що	полегшується праця робітників, спрощується						процес

23

одержання стандартної посівної культури і скорочуються площі посівного цеху. Дозування глибинної посівної культури залежить від виду використовуваних мікроорганізмів. Якщо це спорова культура, то витрата посівного матеріалу залежить від титру посівного матеріалу: звичайно вона складає від 0,2 до 1,0 %; для мікроскопічних грибів і складає1,0–2,5 %. Для продуцентів з ослабленою вегетацією й актиноміцетів посівна доза зростає до5–6 %, а в деяких випадках

– до 15–20 %. Вік глибинної посівної культури відповідає логарифмічній фазі

росту; звичайно це інтенсивно зростаюча культура у 18–віці24	год.
Оптимальний вік встановлюється експериментально для кожної культури.

Завдання на роботу:

1.Провести мікроскопічне дослідження культур-продуцентів.

2.Зробити висновок про мікробну чистоту вихідної культури.

3.Засіяти поживне середовище з метою одержання посівного матеріалу.

Контрольні запитання

1.Що таке чиста та накопичувальна культура?

2.Які способи зберігання вихідних штамів-продуцентів Ви знаєте?

3.Назвіть основні показники, за якими контролюється посівний матеріал.

4.Які шляхи покращення якості посівного матеріалу Ви знаєте?

5.Охарактеризуйте процес підготовки посівного матеріалу для поверхневого культивування.

Охарактеризуйте процес підготовки посівного матеріалу для глибинного культивування.

Лабораторна робота №4 Підготовка поживного середовища. Способи стерилізації поживних

середовищ. Поверхневе культивування мікроорганізмів на рідких поживних середовищах (початок)

Мета роботи: ознайомлення з методами та способами стерилізації поживних середовищ з метою забезпечення стерильності під час культивування мікроорганізмів-продуцентів. Опанувати методи засівання рідких поживних

середовищ	з метою	отримання	поверхневої культури. Ознайомлення з
методами	поверхневого	культивування	мікроорганізмів на рідких поживних

середовищах з метою одержання органічних кислот.

Матеріали та обладнання: компоненти для приготування поживного середовища (меляса, сахароза, глюкоза, 1%-ї розчини солейNH4Cl, KH2PO4, ZnSO4, 10% розчин K4[Fe(CN)6], 1 н розчин H2SO4 та 1 н розчин Na2CO3 для підкислення або підлужування середовища); технічні ваги, культура продуценту лимонної кислотиAspergillus niger 119 вирощена на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, мікроскопи, набори для мікроскопії, рефрактометр; рН-метр, лакмусовий папір. Крім того на кожну бригаду по

24

одній стерильній качалочній колбі об’ємом750 мл і 250 мл, музейна культура A. оryzae 740-А2, чашки Петрі з глюкозо-картопляним агаром.

Основні відомості

Теорія стерилізації. Метою стерилізації є знищення всіх мікроорганізмів, що знаходиться в поживному середовищі. Особливо це стосується середовищ, що складаються з відходів і можуть містити гнильні і патогенні мікроорганізми.

Досягти повної стерильності практично дуже важко, т му що деякі мікроорганізми, особливо спороутворювальні, витримують вплив високих температур протягом тривалого часу.

Велике значення мають властивості об'єктів, що стерилізуються. Деякі речовини можуть підсилювати стерилізуючий ефект, наприклад, кислоти, а деякі, навпаки, спричиняють протекторний вплив, тобто збільшують стійкість мікроорганізмів до температури і тиску, наприклад, жири і крохмаль.

Таким чином, ефективність стерилізації залежить від дуже багатьох факторів: температури, тривалості процесу, складу середовища, конструкції апарата, ступеня обнасінення середовища, що стерилізується, вимог стерильності на наступних стадіях.

Швидкість загибелі клітин можна виразити в такий спосіб:

dNdф = -kN

де N - кількість мікроорганізмів у момент часу τ; k - питома швидкість загибелі мікроорганізмів.

Знак „-” означає, що в процесі стерилізації відбувається зменшення кількості живих мікроорганізмів.

Привівши цей вираз до зручного для інтегрування виду, отримаємо:

dN = -kdф N

Інтегруємо цей вираз, з огляду на те, що при τ=0, N=N0 (N0 - кількість мікроорганізмів перед стерилізацією).

		ln	N		= -kф
			N0
		або ln		N0		= kф
					N
Ліву частину рівняння називають критерієм стерилізації і позначають
символом Ñ (набла).
При постійній температурі критерій стерилізації дорівнює:
			Ñ = kф
Щоб	розрахувати	ефективність				прийнятого	режиму	стерилізації,
користуються табличними значеннями k, даними в таблиці 4.1.

25

Таблиця 4.1

Швидкість загибелі клітин від різних значень температури стерилізації

t °C	k, хв	-1	Ñ нm та	t °C	k, хв	-1	Ñ нm та
			Ñoxm				Ñoxm
100	0,013		0,013	122	2,440		11.825
101	0,017		0,030	123	3,075		14.900
102	0,023		0,053	124	3,765		18,665
103	0,030		0,083	125	4,57		23,235
104	0,036		0,119	126	5,9		29,13
105	0,038		0,167	127	7,4		36,53
106	0,062		0,229	128	9,3		45,88
107	0,083		0,312	129	11,7		57,58
108	0,109		0,421	130	14,8		72,38
109	0,135		0,556	131	16,6		88,98
110	0,163		0,719	132	18,6		107,58
111	0,193		0,912	133	23,4		130,98
112	0,234		1,146	134	29,5		160,48
113	0,302		1,448	135	37,2		197,68
114	0,412		1,860	136	46,8		244,48
115	0,540		2,400	137	59,0		298,48
116	0,653		3,053	138	74,2		377,68
117	0,810		3,863	139	93,5		471,18
118	1,002		4,865	140	104,8		474,98
119	1,210		6,075	141	118,0		693,98
120	1,480		7,550	142	148,0		841,98
121	1,830		9,385

Для розрахунку й обґрунтування режиму стерилізації при неізотермічних умовах реального виробництва використовують наближений метод Т. Річардса. Метод припускає врахування критеріїв стерилізації при нагріванні об'єкта, який стерилізується ( ÑН ), витримуванні його при температурі стерилізації( ÑВ ) і

охолодження ( ÑОХ ).

Якщо швидкість нагрівання й охолодження відрізняється від прийнятої при складанні таблиці(1 °С за 1 хв), то для розрахунку дійсного критерію стерилізації використовують наступне співвідношення:

ф

Ñ = Ñm t ст -100

де Ñь - табличне значення;

τ - тривалість зміни температури від 100 °С до tct; tст - температура стерилізації.

Ефект стерилізації визначається як сума критеріїв стерилізації:

26

Ñ= Ñн + Ñв +Ñох

Впромисловості використовують режими, де Ñ = 80 ÷100 і вище.

У зв'язку з великою складністю процесу стерилізації і неоднорідністю середовищ, які стерилізуються, отримані розрахунковим шляхом режими стерилізації необхідно в кожному випадку перевіряти експериментально.

Найбільш розповсюдженим способом стерилізації поживних середовищ є

спосіб обробки насиченою парою під							тиском. У		таблиці 4.2		показана
температура насиченої пари при різному тиску.
Крім		теплової	обробки	поживних			поромів		середовищ				або гарячим
повітрям,	існують		інші	способи		стерилізації: обробка				ультразвуком,
ультрафіолетовим випромінюванням, хімічними речовинами і т.п.
										Таблиця 4.2
		Залежність температури насиченої пари від тиску
			Тиск						Температура,
			атм
		атм					МПа		°С
			(надлишковий)
		1,0	0,0				0,101		100
		1,5	0,5				0,152		111
		2,0	1,0				0,203		121
		2,5	1,5				0,251		128
		3,0	2,0				0,300		134

Виробництво органічних кислот

Після того як були знайдені активні продуценти органічних кислот,

мікробіологічне виробництво останніх отримало широке розповсюдження, ів
деяких випадках, витіснило інші способи їх одержання(наприклад, лимонної
кислоти із цитрусових).
Сучасне одержання органічних кислот базується, головним чином, на
використанні як продуцентів різних штамів міцеліальних грибів, найчастіше
роду Aspergillus. Так, для виробництва ітаконової кислоти використовують гриб
A. terreus. Гриб A. niger утворює із цукру лимонну та глюконову кислоти.
Мукорові	гриби Mucor,		Rhizopus здатні синтезувати фумарову, молочну і
янтарну кислоти.
Лимонна		кислота	широко	використовується	у	багатьох	галу
промисловості:		харчовій,	медичній, хімічній тощо. Це трьохосновна			кислота
С6Н8О7×Н2О, яка кристалізується з водних розчинів у вигляді ромбічних призм-
кристалів з	однією молекулою води. Температура плавлення				кристалів 70–75

°С.

Існують два способи культивування гриба з метою отримання лимонної кислоти – глибинний і поверхневий. Основним поживним середовищем для

27

культивування є меляса – відход цукрового виробництва, яка містить 45–48 %

цукру.
За	поверхневого	способу культивування	вміст	цукру	в середовищі
доводять	до 14–20 %,	за глибинного – до 3,5–4	%. Крім	того,	поживне

середовище повинно містити мінеральні солі– хлорид амонію, сульфат цинку тощо.

У мелясі містяться солі важких металів, які сповільнюють ріст грибів та утворення лимонної кислоти, тому для осадження цих солей до меляси додають жовту кров’яну сіль.

Величина рН середовища повинна бути 7,0–7,2.

Поверхневе культивування здійснюють в качалочних колбах з товщиною шару поживного середовища – 20-25 см. Посівний матеріал вносять у вигляді суміші спор продуцента з вугіллям за допомогою повітря та розпилюють на поверхні розчину. Температура культивування 32–34 °С, тривалість – 7 діб. У процесі росту гриба на поверхні утворюється добре розвинена міцна плівка.

Лимонна кислота накопичується під плівкою гриба	в культуральній	рідині.
Разом із лимонною кислотою завжди утворюються	глюконова та	щавлева

кислоти.

Тепер у виробництві вторинно використовують ,плівкузамінюючи культуральну рідину свіжим поживним середовищем. Після зняття другої порції культуральної рідини під плівку подають гостру пару, яка конденсується, контактуючи з холодною плівкою. Конденсатом змивається лимонна кислота, яка залишилася на плівці.

Хід роботи

1. Приготувати поживне середовище.

Для культивування грибаA. niger 119 на лабораторному занятті використовують варіанти середовищ, наведених у таблиці 4.3.

Вихідний розчин меляси готують одразу для всіх варіантів, до складу яких входить цей компонент.

250 г меляси розчиняють у 500 мл киплячої дистильованої води і кип’ятять протягом 10 хвилин. З цього розчину беруть пробу та визначають у ній рН(рН розчину меляси повинен бути 7,0, оскільки вже при рН 8 затримується розвиток спор, а при рН 4–5 вони зовсім не проростають).

Залежно від рН розчин підлужують содою або підкислюють 1,0 н сірчаною кислотою.

До мелясного розчину додають солі і об’єм доводять водопровідною водою до 1 л.

Отриманий мелясний розчин з солями кип’ятять 10–15 хв, охолоджують та перевіряють густину на рефрактометрі. Вміст цукру повинен бути у межах16– 17 %. Так само готують всі варіанти середовищ.

28

Таблиця 4.3

Варіанти середовищ для культивування гриба A. niger 119 з метою одержання лимонної кислоти

	Джерело вуглецю в середовищі						Кількість доданих сольових
								розчинів, мл
Варіанти	Вміст,	Співвідношення компонентів,
							співвідношенні		жовтої
	г/л		%
								1% розчини	10%
							солей додають у		розчин
		Меляса	Сахароза		Глюкоза			1:1:1	кров’яної
									солі
1	160	100	–		–			4,5	10
2	160	80	20		–			4,5	8
3	160	50	25		25			4,5	5
4	160	20	80		–			4,5	2
5	160	–	100		–			4,5	0,5
6	160	–	–		100			4,5	0,5
7	160	50	–		50			4,5	5
8	160	70	30		–			4,5	7

2. Простерилізувати поживне середовище.

Приготовлені розчини розлити по 400 мл в конічні колби на 0,75 л, закрити колби ватними пробками, паперовими ковпаками, підписати і стерилізувати в автоклаві при 0,5 атм протягом 30 хв. Після стерилізації колби вийняти та підготувати вміст до посіву.

3. Засіяти стерильне поживне середовище продуцентом лимонної кислоти. Засів середовища здійснюється споровим матеріалом. Засівають за всіма

правилами асептики та антисептики. Закриту пробірку з продуцентом обережно постукують по поверхні столу з метою струшування спор. Потім в полум‘ї

пальника обпалюють пробірку та, відкривши колбу з поживним середовищем,
висипають спори з пробірки на поживне середовище. Спори розподіляються
тонким шаром на поверхні середовища.
Колби із засіяним середовищем зав’язати, підписати та поставити					у
термостат при температурі 32–34 °С на 7–8 діб.
4. Засіяти	чашки	Петрі	продуцентом	амілолітичних	фермент

A. оryzae 740-А2 (для наступного заняття).

Контрольні запитання

1.Які речовини підсилюють ефект стерилізації і чому?

2.Які речовини знижують ефект стерилізації і чому?

3.Від яких факторів залежить ефект стерилізації?

4.Що називається критерієм стерилізації?

5.Чому дорівнює критерій стерилізації при постійній температурі?

6. У чому полягає сутність наближеного методу розрахунку режиму

29

стерилізації?

7.Яке поправочне рівняння використовується при розрахунку режиму

стерилізації, якщо швидкість нагрівання й охолодження відмінні від1°С в 1 хв.?

8.Як визначається ефект стерилізації?

9.Які значення критерію стерилізації використовують у промисловості?

10. Чому	розрахункові	режими	стерилізації	необхідно	переві
експериментально?

11.Якими методами можна знайти наявність живих клітин у поживному середовищі?

12.Які методи стерилізації поживних середовищ існують?

13. Які особливості стерилізації твердих сипучих і рідких поживни середовищ?

14.Який метод стерилізації найбільш ефективний і чому?

15.У чому полягає мета стерилізації поживних середовищ?

16.	Дайте	характеристику		методу	поверхневого		культив
мікроорганізмів.
17.	Які існують методи біотехнологічного одержання лимонної кислоти?
18.	Охарактеризуйте		особливості	твердофазного		та	рідиннофазно

культивування продуцентів лимонної кислоти.

19.Які використовуються методи аналізу складу поживного середовища?

20.Які вимоги ставляться до поживних середовищ у виробництві лимонної кислоти?

21.Охарактеризуйте вимоги до біологічних агентів у виробництві лимонної кислоти.

Лабораторна робота №5 Поверхневе культивування мікроорганізмів на рідких поживних

середовищах. Біотехнологія одержання лимонної кислоти (закінчення). Поверхневе культивування мікроорганізмів на сипких поживних середовищах (початок)

	Мета роботи: опанування методів контролю у процесі поверхневого
одержання лимонної		кислоти	при культивуванні	грибаA. niger	штам 119.
Ознайомлення зі стадіями виділення лимонної кислоти з культуральної рідини
та	опанування	методів	кількісного	визначення	лимонної.	кис
Ознайомлення з методами поверхневого культивування мікроорганізмів на
сипких поживних середовищах з метою одержання ферментних препаратів.

Матеріали та обладнання: паперові фільтри, технічні ваги, реактиви для визначення загальної титрованої кислотності лимонної кислоти, кількості лимонної, щавлевої та глюконової кислот; рефрактометр, рН-метр, лакмусовий папір, скляні палички, бюретки, мірні циліндри, пробірки з МПА, музейні

30

культури продуцентів протеолітичних ферментів, мікроскопи, набори для мікроскопії, культура A. оryzae 740-А2, засіяна на минулому занятті.

Основні відомості

Культивування гриба проходить декількома етапами. У першу добу росту з’являється тонка плівочка гриба, крізь яку помітне поживне середовище, далі вона потовщується і стає складчастою. Субстратний міцелій бежевого кольору. Зверху плівка у перші2–4 доби покрита білувато-сіруватим пушком, на 6–7 добу спостерігається початок спороносіння, а далі спори покривають всю зовнішню поверхню чорним шаром.

За цей час весь цукор із середовища споживається, перетворюючись частково на лимонну кислоту. Вихід лимонної кислоти від цукру становить 58– 60 %. Через 7–8 діб зброджений розчин аналізують.

Хід роботи

1.Відокремити розчин від мікробної біомаси.

2.Проаналізувати культуральну рідину: визначити загальну титровану кислотність лимонної кислоти, визначити кількість лимонної, щавлевої та глюконової кислот, визначити суху масу міцелію та розрахувати його здатність до утворення лимонної кислоти, визначити вміст сухих речовин та визначити рН.

Відокремлення збродженого розчину

Знімають з колби пробку, іобережно нахиляючи колбу, зливають з-під плівки увесь зброжений розчин у мірний циліндр на500 мл. У кінці зливання плівку підтримують паличкою. Далі плівку міцелію перевертають і промивають

киплячою водою два рази 30по–35 мл. Промивні води зливають до збродженого розчину та замірюють увесь об’єм культуральної рідини. Цей розчин є вихідним матеріалом для подальших визначень.

Визначення загальної титруємої кислотності

Відбирають 5 мл аналізованого розчину та розводять його дистильованою водою до 150 мл, додають 3–4 краплі фенолфталеїну та титрують0,25 н розчином лугу.

Вміст лимонної кислоти Х визначають за формулою

Х =	А × F ×100	, %
5

де А – кількість лугу, витрачена на титрування, мл;

F – фактор лугу щодо лимонної кислоти(1мл 0,1 н NаОН відповідає 0,007 г лимонної кислоти). У перерахунку на 0,25 н NаОН:

F	=	0,007 × 0,25	= 0,0175	, г лимонної кислоти, тобто 1 мл 0,25 н NаОН
0,25		0,1

відповідає 0,0175 г лимонної кислоти.

31

Визначення лимонної, щавлевої та глюконової кислот

Реактиви:

11,1 %-й розчин хлористого кальцію; 11 %-й розчин аміаку; 10 %-й розчин сірчаної кислоти; 10 %-й розчин соляної кислоти; насичений розчин щавлевокислого амонію; 1%-й розчин азотнокислого срібла; 1%-й розчин фенолфталеїну; 0,1 н. розчин перманганату калію; 5%-й розчин хлористого амонію; вуглекислий кальцій.

Роздільне визначення цих кислот ґрунтується на різній розчинності їх кальцієвих солей у воді і у слабкому розчині кислоти.

Лимоннокислий	кальцій	слабо розчиняється у	гарячій	воді і добре
розчинний у розведеній соляній кислоті. Щавлевокислий кальцій практично не
розчинний ні у воді,	ні у слабкому розчині кислоти. Глюконовокислий кальцій
добре розчинний у воді.
Визначення суми лимонної		та щавлевої кислот. Для	визначення	беруть

таку кількість розчину, щоб у ньому містилося не менше 1 г і не більше2 г кислоти (орієнтовно 10 мл). Далі приливають 11,1%-ий хлористого кальцію так, щоб 1 г загального вмісту кислоти відповідав9 мл розчину СаCl2. Практично беруть полуторний надлишок хлористого кальцію(13,5 мл). Розчин нагрівають

до кипіння,	нейтралізують 10 %-м	розчином	аміаку по	фенолфталеїну,
кип’ятять 3 хв і ставлять на водяну баню. Цитрат і оксалат кальцію випадають в
осад, а глюконат кальцію залишається у розчині. Реакція нейтралізації кислот
СаCl2 з аміаком відбувається за схемою:
2С6Н807 + 3CaCl2 + 6NH4OH = Ca3(C6H5O7)2 + 6NH4Cl + 6H2O;
C2H2O4 + CaCl2 + 2NH4OH = CaC2O4 + 2NH4Cl + 2H2O;
2C6H12O7 + CaCl2 + 2NH4OH = Ca(C6H11O7)2 + 2NH4Cl + 2H2O.				гарячою водою д
Гарячий	розчин фільтрують і	осад	промивають

негативної реакції на хлор 1з %-м розчином АgNО3, підкисленим азотною кислотою.

Враховуючи, що розчинність цитрату кальцію у гарячій воді становить 0,055 % у перерахунку на лимонну кислоту, об’єм фільтрату і промивних вод заміряють і вносять поправку під час розрахунку результатів аналізу.

Осад цитрату і оксалату кальцію розчиняють у10 % НCl. Розчин кількісно переносять у колбу на1 л, об’єм доводять до мітки дистильованою водою і після перемішування відбирають 100 мл у хімічну склянку.

Після нагрівання до кипіння кальцій осаджують насиченим киплячим розчином щавлевокислого амонію(10–15 мл), нейтралізуючи аміаком за фенолфталеїном.

Реакція осадження оксалату кальцію: CaCl2 + (NH4)2C2O4 = CaC2O4 + 2NH4Cl.

Розчин кип’ятять 10 хв, охолоджують, фільтрують і осад промивають холодною водою до негативної реакції на хлор. Після цього осад розчиняють у 10 % H2SO4 (20–25 мл), нагрівають до 80 °С і титрують щавлеву кислоту0,1 н. розчином перманганату калію.

32

Суму лимонної та щавлевої кислот Х1 (у %), розраховують за формулою:

0,07n1 ×10 + V1 × 0,0055 ×100

Х1 = 100 Q1

де n1 – об’єм розчину перманганату, витрачений на титрування (у перерахунку на 0,1 н. розчин), мл; 0,007 – кількість лимонної кислоти, яка відповідає 1 мл 0,1 н. розчину КMnО4; V1 – об’єм фільтрату і промивних вод, мл; Q1 – об’єм розчину, взятого на аналіз.

Визначення щавлевої кислоти. Кількість розчину для аналізу і кількість СаCl2 розраховують так само як і для визначення суми кислот.

До досліджуваного розчину додають11,1 %-й розчин хлориду кальцію, кип’ятять 10 хв і ставлять на30 хв на водяну баню. Охолоджений розчин фільтрують. Осад промивають холодною водою до негативної реакції на хлор, розчиняють у 10 %-й сірчаній кислоті, далі нагрівають до 80 °С і титрують 0,1 н розчином перманганату калію.

Вміст щавлевої кислоти (у %), визначають за формулою:

X 2	=	0,007 × n 2 ×100
		Q1
Позначення такі самі, як у попередній формулі
Кількість лимонної кислоти визначають за різницею між Х1				і Х2
Визначення глюконової	кислоти. Для аналізу беруть			розчин у тому

самому об’ємі, що і для визначення суми лимонної і щавлевої кислот, додають вуглекислий кальцій із розрахунку 0,78 г на 1 г лимонної кислоти, визначеної за загальною кислотністю.

Після осідання піни розчин кип’ятять10 хв і перевіряють реакцію лакмусовим папірцем. У разі кислої реакції кип’ятять ще кілька хвилин, а якщо цього недостатньо, то додають трохи вуглекислого кальцію і знову кип’ятять, поки розчин не набуде нейтральної реакції за лакмусовим папірцем. Далі додають 1–2 мл 5 % хлористого амонію і ставлять на30 хв у водяну баню. Цитрат і оксалат кальцію випадають в осад, разом з яким осяде і надлишок кальцію у вигляді крейди.

У розчині залишається глюконовокислий кальцій і невелика кількість цитрату кальцію (оскільки він погано розчиний у ).водіГарячий розчин фільтрують і осад промивають гарячою водою до негативної реакції на хлор (проба з АgNО3).

Глюконову кислоту у відфільтрованому розчині визначають за кальцієм, віднімаючи кальцій, зв’язаний з лимонною кислотою. Об’єм фільтрату в промивних водах заміряють і вносять поправки на розчинність цитрату кальцію. Далі розчин нагрівають до кипіння і протягом10–15 хв осаджують кальцій киплячим насиченим розчином щавлевокислого амонію.

Розчин кип’ятять 10 хв, охолоджують, фільтрують і осад промивають водою до негативної реакції на хлор. Осад розчиняють у20–25 мл 10 % сірчаній кислоті, нагрівають до 80 °С і титрують 0,1 н розчином перманганату

33

калію. Вміст глюконової кислоти, еквівалентний кількості лимонної кислоти, розраховують за формулою:

é

æ

V

× 0,0055

öù

ê

(0,007 × n

3

)- ç

3

÷

ú

×100

100

è

X

3 =

ë

øû

Q3

Позначення такі самі, що у двох попередніх формулах

Загальна

кількість

усіх

трьох

кислот(щавлевої

і глюконової

в

перерахунку на еквівалентну кількість лимонної кислоти) повинна дорівнювати загальній кислотності, визначеній у збродженому розчині титруванням. Крім того, вміст усіх кислот перераховують у відсотках до загальної кислотності досліджуваного розчину.

Примітка. В мелясних зброджених розчинах, крім вільних кислот, містяться кальцієві солі, тому сума трьох кислот за аналізом перевищує кислотність за титруванням.

Визначення сухої ваги міцелію і розрахунок його продукуючої здатності по лимонній кислоті

Плівку гриба, яка залишилася у колбі, переносять на велику воронку Бюхнера з фільтром. Зверху плівку прикривають2–3 круглими фільтрами і підсушують під вакуумом15–20 хв, далі плівку вміщують у великий пакет, висушують у приладі Чижової протягом 7–8 хв при температурі 170–175 °С.

За сухою масою міцелію підраховують продукуючу здатність міцелію.

Розрахунок виходу лимонної кислоти у відсотках від цукру середовища

У 400 мл середовища містилося0,16´400=64 г цукру. В результаті біосинтезу було отримано 37,3 г лимонної кислоти.

Складаємо пропорцію

64	100
37,3	х

X = 37,3 ×100 = 52,28% 64

Матеріали та обладнання: компоненти для приготування поживного середовища (меляса, кукурудзяний екстракт або дріжджовий гідролізат, солі (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, NH4Cl, пшеничні висівки, солодові паростки, тирса, соняшникове лушпиння, буряковий жом); культури продуценти для культивування глибинного: – A. foetidus, для поверхневого культивування – A. orizae. ФЕК з набором кювет, апарат Чижової, рефрактометр, лакмусовий папір; технічні ваги, реактиви для визначення крохмалю за Еверсом(дод. 6). Крім того, на кожну бригаду дві стерильні качалочні колби об’ємом250 мл,

34

одна стерильна металева кювета, одна колба з 90 мл стерильної водопровідної води, один стерильний мірний циліндр.

Основні відомості

Поверхневий спосiб культивування продуцентiв ферментiв. Вплив вологостi твердого поживного середовищана бiосинтез ферментiв

Для поверхневого способу культивування продуцентiв ферментiв ступiнь зволоження твердого поживного середовища має велике значення. За низької вологостi мiкроорганiзми не можуть використовувати поживнi речовини

середовища,	оскільки	дифузiя	останнiх	ускладнена, що	призводить	до
сповiльнення	росту, бiосинтезу		ферментiв	та інтенсивного	спороутворення.
Надмiрне зволоження		порушує	крихку	структуру середовища, знижує		його

повiтропроникливiсть, що також призводить до сповiльнення ростуi зниження бiосинтезу ферментiв.

Оптимальна вологiсть твердого поживного середовища для бiосинтезу

ферментiв	залежить	вiд фiзiологiчних властивостей продуценту, складу
поживного середовища i зазвичай повинна бути в межах 55–70 %.
На першому занятті готують поживне середовище заданого складуi
вологостi,	стерилiзують	середовище, контролюють	посiвний	матер,	iал

зволожують середовище i засiвають, розкладають засiяне середовище в кювети i ставлять кювети для вирощування.

На другому занятті аналізують готову культуру, визначають оцукрювальну або амiлолiтичну активність, вологість готової культури i

вихiд.

Підготовчий етап: попередньо спiвробiтники кафедри готують музейні культури i стерилізують посуд.

На минулому заняття студенти пересiвають продуцент A. оryzae 740-А2 iз музейної пробiрки на чашки Петрі з сусло-агаром. Чашки Петрі вирощують у термостаті iз температурою 30 ºС 3–4 доби. Вирощена культура є вихiдним посiвним матерiалом.

Попередньо також стерилiзують кювети для вирощування, посуд для засiву i зволоження середовища, мiрнi цилiндри, колби з водопровiдною водою, склянi палички для перемiшування при температурi 120 ºС протягом 30 хв.

Група студентiв проводить спiльне дослiдження, вивчаючи бiосинтез амiлолiтичних ферментiв на середовищi певного складу, але за рiзної вологостi: 45, 55, 60, 65 i 70 %. Кожен студент готує вiдповiдний варiант середовища заданої вологостi у кiлькостi 150 г за повiтряно-сухою масою.

Варiанти поживних середовищ:

I –100 % пшеничних висівок;

II – 80 % пшеничних висівок i 20 % солодових росткiв; III – 80 % пшеничних висівок i 20 % деревної тирси; IV – 80 % пшеничних висівок i 20 % бурякового жому.

Зваженi компоненти добре перемiшують i 100 г одержаного середовища (А1) зважують до стерилiзацiїi заповнення кювети. Середовище вмiщують у

35

попередньо зважену (а), складену у чотири шари марлеву серветку. Серветки iз

середовищем кладуть у бiксi	стерилiзують	протягом 1	год	при 120 ºС.
Простерилізовані серветки iз	середовищем	зважують(В)	для	визначення
кількості конденсованої вологи n:

n = B – A1 – a

За час стерилiзацiї вмiщеного у серветку поживного середовища у залишковому середовищi визначають вихiдну вологiстьWвих i розраховують кiлькiсть води, яку необхiдно додати для досягнення заданої вологостi Wзад.

Вологiсть визначають прискореним методом на приладі Чижової (дод. 5). Кiлькiсть добавленої води визначають такими способами:

1. Вмiст абсолютно сухих речовин у середовищi з вихiдною вологістю, г,

Aср = 100 - Wвих ×А1 100

2. Маса того ж середовища iз заданою вологiстю, г,

100

А 2 = А с.р. × 100 - Wзавд

3.Кiлькiсть води, яку необхiдно додати для досягнення заданої вологостi з урахуванням конденсованої вологи, г,

D = A2 - A1 - n

Приклад розрахунку. Приготувати 125 г (А1) середовища із завданою вологістю 60 % (Wзад). Вихідна вологість середовища10 % (Wвих). Кількість конденсованої вологи – 10 г (n).

Aср =

100 -10

×125 = 112,5

г -

вмiст

абсолютно

сухих

речовин

у

100

середовищi.

100

А 2 = 112,5 ×

= 281,25

г - маса середовища iз заданою вологiстю.

100 - 60

D = 281,25 –125 – 10 = 146, 25 г - кiлькiсть води, яку необхiдно додати для

досягнення заданої вологостi.

Потiм

зволожують i

засiвають

поживне

середовище

з

додержанням

правил асептики у безпосереднiй близькості вiд газового пальника. Вiдому з

розрахунку кiлькiсть води вимiрюють у стерильний цилiндрi використовують

для перенесення посiвного матерiалу

в

посуд

для

засiву з

поживн

середовищем.

Середовище необхiдно добре перемiшати з посiвним матерiалом рукою у

гумовiй рукавичцi, попередньо промитій спиртом, а потiм перенести у кювету

для вирощування,

перфороване дно

якої

закрите шаром

фільтрувального

паперу. Середовище рівномірно розподіляють у кюветіi закривають кришкою. Кювету необхідно зважити до заповнення середовищаi після засіву для визначення кількості сухих речовин середовища, поставленого на вирощування М1. Кювети ставлять на30 год для вирощування у термостат з температурою 29–30 ºС, в якому підтримують відносну вологість повітря 95–100 %.

36

Через 30 год кювети виймають з термостата, загортають у полiетиленову плівку i кладуть у холодильник до наступного заняття.

					Хід роботи
1.	Приготувати заданий варіант твердого поживного середовища, передати
на стерилізацію.
2.	Проаналізувати		сипке		поживне	середовище: визначити		вологість
методом Чижової (дод. 5); визначити крохмаль методом Еверса (дод. 6).
3.	Зволожити середовище, засіяти і встановити на вирощування.
4.	Засіяти	пробірки		з	агаризованим		м‘ясо-пептонним		бульйоно
продуцентами протеолітичних ферментів.

		Контрльні запитання
1.	У чому полягають особливості біотехнологічного одержання органічних
кислот?
2.	Охарактеризуйте	особливості	одержання	лимонної	кислоти	методом
мікробного синтезу.

3.Охарактеризуйте методи контролю у виробництві лимонної кислоти.

4.Дайте загальну характеристику поверхневого методу культивування.

5.Дайте загальну характеристику глибинного методу культивування.

6.Дайте загальну характеристику гетерофазного методу культивування.

7.Які фази росту характерні для продуцентів ферментів за поверхневого культивування?

8.Охарактеризуйте принципи складання поживних середовищ за поверхневого

та глибинного культивування.

Лабораторна робота №6 Поверхневе культивування мікроорганізмів на сипких поживних

середовищах (закінчення). Глибинне культивування мікроорганізмів (початок)

Мета роботи: аналіз кількісного впливу вологості твердого поживного середовища на накопичення амiлолiтичних ферментів культурою A. оryzae 740-

А2. Опанування	методів аналізу		ферментних	препаратів	амілолітичного
комплексу. Ознайомлення		з	методами	глибинного		культивуван
мікроорганізмів	на рідких	поживних середовищах з			метою	одержанн
ферментних препаратів.

Матеріали та обладнання: мікроскопи, предметні та накрівні скельця; бактеріологічні петлі та голки; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою ФЕК з набором кювет, рефрактометр, лакмусовий папір, технічні ваги, реактиви для визначення білка за Лоурі(дод. 4), амілолітичної та оцукрюючої та полігалактуроназної активностей, ферментні препарати амілосубтилін,

37

амілоризин, мікроскопи, набори для мікроскопії, культури продуцентів протеолітичних ферментів, засіяні на минулому занятті.

Основні відомості

За сучасною класифікацією усі ферменти поділяються на шість основних класів за типом реакції, які вони каталізують: 1 – оксидоредуктази; 2 – трансферази; 3 – гідролази; 4 – ліази; 5 – ізомерази і 6 – лігази (синтетази). Більшість промислово важливих ферментів, потреба в яких визначається десятками тисяч тонн, відносяться до третього класу – гідролаз.

Очищені ферменти визначаються за класифікацією, прийнятою у 1961 році. В основі класифікації лежить тип реакції, який каталізує даний фермент

(субстратна специфічність).
Згідно класифікації	кожному	ферменту відповідає4-значний шифр
(цифри роз’єднуються крапками): 1 –		клас; 2 – підклас; 3 – підпідклас; 4 –

номер за списком.

Після першого згадування назви ферменту у тексті подається його шифр у скобках, наприклад (КФ 1.1.1.1), КФ – класифікація ферментів.

Всі ферменти амілолітичного комплексу належать до класу гідролаз,

другого	підкласу –		ферментів, які	каталізують		гідроліз глікозидних				сполук, і
підпідкласу глікозидаз.
У	комплекс		ферментів	амілолітичної			дії	входятьa- і b-амілази,
глюкоамілаза і комплекс ферментів, який називається декстриназою.
a-амілаза (a-1,4-глюкан-глюканогідролаза), (КФ 3.2.1.1) каталізує розрив
внутрішніх a-1,4-глюкозидних				зв’язків		крохмалю, тому			її	називають
ендоамілазою.		Під	дією a-амілази		відбувається			розрідження		крохмалю
внаслідок накопичення декстринів і деякої кількості мальтози.
b-амілаза		(a-1,4-глюкан-мальтогідролаза),					(КФ	3.2.1.2) є	ферментом

екзодії і гідролізує a-1,4-глюкозидні зв’язки та передостанні зв’язки у лінійних ділянках амілози і амілопектину, послідовно відщеплюючи залишки мальтози із нередукуючого кінця ланцюга. При цьому шляхом інверсії утворюєтьсяb- мальтоза.

Глюкоамілаза		або	екзо-1,4-глюкозидаза (a-1,4-глюкан-глюкогідролаза),
(КФ 3.2.1.3)	також	є	екзоферментом, гідролізує крохмаль,	відщеплюючи
послідовно	залишки		глюкози із нередукуючого кінця	ланцюга. Фермент

подібний не тільки доa-1,4-глюкозидних зв’язків, а й доa-1,6-зв’язків, які гідролізуються із значно меншою швидкістю.

Декстриназа – комплекс ферментів, котрі діють на розгалужені субстрати із великою кількістю a-1,6-зв’язків.

Аналіз вирощеної поверхневої культури

Кювету з готовою культурою продуценту зважують, пiсля чого її вміст переносять у кристалiзатор, добре перемiшують i вiдбирають середню пробу, з якої беруть двi наважки для визначення вологостi i двi наважки – для визначення ферментативної активностi.

38

Вологiсть готової культури визначають прискореним методом у двох паралельних пробах i визначають масу сухих речовин у готовiй культурi гриба

М2 за формулою

М2 = 100 - Wвих ×М1 100

Вихiд готової культури вiд маси вихiдного середовища становить, %,

N = M2 ×100

M1

Таким чином, втрати сухих речовин на вирощуваннi продуцента, %, h = 100 – N.

Для визначення ферментативної активностi готової культури продуцента готують витяжку з поверхневої культури за методикою, наведеною

вдодатку 7.

Уодержанiй витяжці визначають оцукрювальну активнiсть(ОС) або амiлолiтичну активнiсть (АС).

Визначення амілолітичної активності колориметричним методом

Метод базується на гідролізі крохмалю ферментами амілолітичного

комплексу	до	декстринів	різної		молекулярної.		Кількістьмаси
прогідролізованого		крохмалю встановлюють		за	зміною	його забарвлення з
йодом в	результаті	дії амілаз. Інтенсивність		забарвлення		з йодом	вихідного

крохмалю та одержаних в результаті гідролізу декстринів вимірюють на фотоколориметрі.

За одиницю амілолітичної активності (АС) взято таку кількість ферменту, яка в строго визначених умовах каталізує гідроліз1 г розчинного крохмалю до декстринів різної молекулярної маси. При цьому кількість прогідролізованого крохмалю має становити не більш як 30 % вихідного.

Активність препарату (амілолітична		здатність) виражається		числом
одиниць активності в 1 г препарату.
Прилади, посуд, реактиви:
Фотоелектроколориметр;	пробірки	великі;	піпетки	мірні;

ультратермостат; колби конічні місткістю 100 мл; 1%-й розчин крохмалю (субстрат): наважку розчинного крохмалю (1 г з

урахуванням вологості), вміщують у мірну колбу місткістю 100 мл, добавляють 25 мл води і перемішують. Потім добавляють ще 25 мл води і вміщують колбу в киплячу водяну баню, де витримують 25 хв, безперервно перемішуючи до повного розчинення крохмалю. Після охолодження додають10 мл буфера (ацетатного з рН 4,7 – для аналізу грибних препаратів або фосфатного з рН6,0

– для аналізу бактеріальних препаратів) і об’єм рідини доводять дистильованою водою до мітки.

Перевіряють оптичну густину субстрату: до 100 мл розчину крохмалю в пробірці додають 5 мл дистильованої води, добре перемішують і 0,5 мл одержаного розчину переносять у конічну колбочку з50 мл робочого розчину

39

йоду. Забарвлений розчин колориметрують на фотоелектроколориметрі з

червоним світлофільтром у кюветі з довжиною грані 1 см. Оптична густина має

становити не менш як 0,7;

Буферні розчини: ацетатний буфер рН4,7, для приготування якого

використовують льодяну оцтову кислоту або хімічно чисту, або безводну.

Готують 1 н розчини: 1 н розчин оцтової кислоти: 57,25 мл (60,12 г) льодяної

оцтової кислоти або 58,63 мл (61,22 г) хімічно чистої оцтової кислоти на 1 л 1 н.

розчин ацетату натрію: 136,09 кристалічного оцтовокислого натрію або86 г

безводного на 1 л.

Для одержання буферного розчину з рН 4,7 нормальні розчини кислоти та

солі перемішують у співвідношенні1:1 (рН перевіряють на потенціометрі);

фосфатний

буфер

рН6,0,

для

приготування

якого

використовують

двозаміщений

фосфорнокислий

натрій–

11,876

г

на 1

л

та однозаміщений

фосфорнокислий

калій –

9,078

г

на 1

л. Наважки солей розчиняють у

дистильованій воді і об’єм розчинів доводять у мірних колбах до 1 л.

Для одержання буфера з 6,0рН вихідні розчини перемішують у

співвідношенні 1:9 (рН перевіряють на потенціометрі).

Основний розчин йоду: наважку 0,5 г металічного йоду і5,0 г йодистого

калію вміщують у бюкс з притертою кришкою і добавляють 2 мл дистильованої

води. Після повного розчинення йоду

розчин переносять у мірну колбу на

200 мл з притертою пробкою і об’єм розчину доводять до мітки дистильованою

водою. Основний розчин йоду зберігають у темряві і використовують протягом

1 місяця.

Робочий розчин йоду: в мірній колбі розводять2 мл основного розчину

йоду 0,1 н

розчином

соляної

кислоти 100до

мл. Перед

використанням

перевіряють оптичну густину на ФЕК з синім світлофільтром

у

кюветі

з

довжиною грані 1 см. Оптична густина має бути0,160. У разі відхилення цю

величину доводять до потрібної додаванням декількох крапель0,1 н розчину

соляної кислоти або основного розчину йоду.

Хід роботи:

Ферментну реакцію гідролізу крохмалю проводять у строго визначених

стандартних умовах: температура 30 ºС, рН середовища 6,0 – для бактеріальних

препаратів

та 4,7

– для

грибних,

тривалість

реакції 10

хв, концентрація

субстрату – 1 %, об’єм

реакційної

суміші15 мл (10 мл

субстрату

та5 мл

ферментного розчину).

Для аналізу беруть дві пробірки

діаметром2 см

та

заввишки18

см,

наливають

у

кожну

по10 мл 1%-го

розчину

крохмалю

і

ставлять

в

ультратермостат з температурою30 ºС

на 10 –

15хв,

щоб

розчини

набули

температури 30 ºС.

Потім

у

першу

пробірку

наливають5 мл

дистильованої

води

(контрольний

зразок), у другу – 5 мл ферментного

розчину (дослідна

проба).

Суміші швидко перемішують і витримують в ультратермостаті10 хв для перебігу ферментативної реакції. Пробірки виймають з термостата, з кожної відбирають по 0,5 мл реакційної суміші і переносять у конічні колбочки, в які

40

попередньо налито по50 мл робочого розчину йоду, приготованого на 0,1 н розчині соляної кислоти. Вміст колб перемішують– одночасно проходять інактивація ферменту та йод-крохмальна реакція.

Розчини набувають забарвлення: одержаний із контрольної проби – синє, одержаний із дослідного розчину – фіолетове різної інтенсивності, залежно від ступеня гідролізу крохмалю.

Оптичні густини одержаних забарвлених розчинів визначають на фотоелектроколориметрі, застосовуючи кювети з довжиною грані1 см та світлофільтр з довжиною світлової хвилі 656 нм (червоний світлофільтр).

Вимірювання проводять проти води за інструкцією, доданою до кожного приладу. Отримують два значення оптичної густини: D1 – контрольного розчину, яка характеризує кількість крохмалю, взятого на ферментативну реакцію (значення D1 має бути не менш як 0,7) та D2 – дослідного розчину, яка характеризує кількість крохмалю та декстринів у реакційній суміші.

Кількість прогідролізованого крохмалю, г,

C = D1 - D 2 × 0,1

D1

Якщо кількість прогідролізованого крохмалю менш як0,02 або більш як 0,7, то аналіз повторюють відповідно з більшим або меншим розведенням

вихідного	ферментного		розчину. Амілолітичну			активність визначають			з
рівнянь,	одержаних		в	результаті			математичного	опрацю
експериментальних даних			з вивчення залежності між кількістю					взятого	на
аналіз ферменту та ступенем гідролізу крохмалю(в коефіцієнти введено
перерахунок на 1 год дії ферментів).
У	разі	різниць	ферментних		комплексів		препаратів	грибного

бактеріального походження і специфічності їх дії розрахунок активності проводиться за рівняннями, які характерні тільки для аналізу даного роду ферментних препаратів.

Рівняння для розрахунку амілолітичної активності мають такий вигляд: для ферментних препаратів грибного походження

AC = 7,264C - 0,03766 100 од./г, n

для ферментних препаратів бактеріального походження

AC = 5,885×C - 0,001671100 од./г, n

де С – кількість крохмалю, прогідролізованого в період реакції, г; n – кількість ферментного препарату, взятого на аналіз, мг.

Для вираження амілолітичної активності в міжнародних одиницях одержану величину АС слід помножити на103 стандартні міжнародні одиниці розмірністю мкмоль/хв.

Приклад розрахунку. Для аналізу взято препарат амілорізин10хП. Приготовлено його розчин 0,1 г препарату на 100 мл води. Із цього вихідного

41