Порядок виконання роботи:

Необхідно 25 мл субстрату вмістити у широку пробірку, в яку вставлена скляна паличка. 30 мл води і30 мл витяжки налити в окремі пробірки, поставити їх в ультратермостат і витримати на протязі 10 хв при температурі 30

ºС.

Потім у пробірку з крохмалем додати1–25 мл ферментного розчину у відповідну кількість води так, щоб загальний об’єм реакційної суміші становив

50 мл.

Вміст пробірки перемішати паличкою і відмітити за секундоміром ,час коли була додана витяжка до розчину крохмалю у пробірці, вміщеній в ультратермостат. Через кожні 60 с паличкою відбирати пробу у вигляді краплі. Краплю помістити на білу фарфорову пластинку, з’єднати її з краплею робочого розчину йоду і спостерігати за забарвленням. Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестає змінювати забарвлення при з’єднанні з краплиною забарвленого розчину протягом перших 10 с. Час, за який відбувається розщеплення крохмалю до продуктів, не забарвлених йодом,

– 10 – 12 хв. В іншому разі аналіз необхідно повторити з більшою чи меншою кількістю розчину ферменту .

Амілолітична активність ферментних матеріалів
АС=	0,25 ×60	од/г або од/мл,
	nB
де 0,25 – кількість крохмалю, яка міститься в 25 мл його 1%-го розчину, г;
60 – перерахунок на одиницю часу, 1 год;
n – кількість ферменту, що бере участь у реакціях, г або мл. Ця величина
визначається з урахуванням концентрації вихідної витяжки і			наступного
розведення; B – час, за який		пройшло розщеплення крохмалю	до не

забарвлених йодом продуктів.

Приклад. Вихідний розчин ферменту приготовано із розрахунку5 г культури гриба на100 мл забуференої води. Культура дуже активна, тому потрібно додаткове розведення: 20 мл вихідного розчину доведено в мірній

колбі до 50 мл дистильованою водою і звідти на		аналіз взято2 мл, тобто
отримано ланцюг розведень: 5 г – 100	мл – 20 мл – 50 мл – 2 мл.
Для проведення гідролізу0,25	г крохмалю 2 мл	ферментного розчину

останнього розведення потрібно 12 хв. Тоді:

АС= 0,25 ×60 ×50 ×100 ×1 = 31,25 од. АС/г 12 ×2 ×20 ×5

У даному разі з урахуванням усіх розведень

n = 2 ×20 ×5 50 ×100 ×1

при перерахунку на 1 г вихідної повітряно-сухої культури.

Хід роботи:

1.Визначити кількість білка в ферментних розчинах методом Лоурі (дод. 5).

2.Визначити ферментативну активність бактеріального походження.

49

3.Визначити оцукрювальну активність титриметричним методом.

4.Розрахувати питомі активності ферментних препаратів.

За даними, одержаними групою студентів, які вивчають накопичення амілолітичних ферментів за різної вологості поживного середовища одного складу, будують графік залежності біосинтезу амілолітичних ферментів від вологості поживного середовища. Для цього на осі абсцис відкладають значення вологості, а на осі ординат– одержане значення ферментативної активності (ОС або АС).

Результати роботи занести у таблицю спостережень і зобразити у вигляді графіка.

	Варіант			Маса	Кількість води	Втрати	ОС або
	середо-	Wвих	Wзад	сухих	для	сухих
							АС, од/г
	вища			речовин	зволоження D	речовин N

Виходячи із одержаних даних зробити висновок про оптимальне значення вологості поживного середовища для біосинтезу амілолітичних ферментів на твердому поживному середовищі для компонента, який вивчають.

Глибинне культивування Матеріали та обладнання: компоненти для приготування поживного

середовища (меляса, кукурудзяний екстракт або дріжджовий гідролізат, солі: (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, NH4Cl, крейда, 1 н розчин NaOН для підлужнення середовища), ФЕК з набором кювет, рефрактометр, рН-метр, лакмусовий папір, технічні ваги, реактиви для виконання аналізу вмісту редукуючих речовин за Бертраном (дод. 1), азоту амінокислот мідним способом (дод. 3) . Крім того, на кожну бригаду дві стерильні качалочні колби об’ємом250 мл, одна пробірка з

продуцентом протеолітичних ферментів, вирощеного на скошеному агаризованому середовищі.

Основні відомості

Чисту культуру, що зберігається в пробірках з2% м’ясопептонним агаром (МПА), пересівають на свіже середовище за дві доби до занять. Вирощують у термостаті при 22 °С впродовж 24 год. Свіжу однодобову культуру продуцента змивають з пробірок стерильною водопровідною водою(10 мл води на одну пробірку). Клітинна суспензія повинна містити 1,0×108 клітин/мл.

Далі вирощування продуцента проводять у колбах на середовищі такого складу, %: меляса – 5; кукурудзяний екстракт – 1 (за сухою вагою); амоній сірчанокислий – 2; калій фосфорнокислий однозаміщений– 0,5; калій фосфорнокислий двозаміщений – 0,5; крейда – 1; рН середовища доводять до значення 6,9 – 7,0 20% розчином NaOH і стерилізують 40 хв при 120 °С .

Стерильне поживне середовище засівають водною суспензією клітин продуцента з розрахунку 2 мл суспензії на 50 мл середовища в колбах на 250

50

мл. Вирощують упродовж 24 год при температурі 28–30 °С на круговій качалці з частотою обертів 200–220 об/хв.

		Основні етапи технологічної схеми:
1.	Одержання посівного матеріалу в колбах, інокуляторах і посівних
ферментерах.
2.	Готування	поживного	середовища	для	робочих	ферментерів	і
виробнича ферментація.

3.Видалення бактеріальних тіл з культуральної рідини.

4.Виділення продукту біосинтезу з нативного розчину та його очищення.

Хід роботи:

1. Підготувати поживне середовище заданого складу.

Як джерело вуглецю можна використовувати різні цукри(глюкозу, сахарозу, фруктозу, лактозу, мальтозу) і ряд органічних кислот(фумарову, бурштинову, молочну, піровиноградну, оцтову). У промисловості в основному використовують дешевше джерело вуглецю– мелясу. Як джерело неорганічного азоту використовують сірчанокислий амоній, а органічного – кукурудзяний екстракт, який, крім того, містить ряд біостимуляторів. Зокрема, кукурудзяний екстракт містить біотин і треонін, без яких дана культура розвиватися не може.

Можуть бути використані поживні середовища (таблиця 6.3).

Кількість кукурудзяного екстракту дається у відсотках за сухою вагою. Оскільки сухі речовини кукурудзяного екстракту становлять зазвичай50 %, то наважку беруть удвічі більшу, ніж за прописом.

Таблиця 6.3

Склад поживних середовищ, %

	Компонент				Варіанти
	поживного	1	2	3	4	5	6	7	8
	середовища
	Меляса	16	-	-	-	14	-	-	-
	Глюкоза	-	8	-	-	1	6	2	-
	Сахароза	-	-	8	-	-	2	6	-
	Оцтова кислота	-	-	-	5	-	-	-	10
	Кукурудзяний	-	2	2	2	-	2	2	2
	екстракт	2	2	2	2	2	2	2	2
	(NH4)2SO4
	KH2PO4	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
	K2HPO4	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
	CaCO3	1	-	-	1	1	-	-	1
	NaCl	-	0,5	0,5	-	-	0,5	0,5	-
	Крейда	1	1	1	1	1	1	1	1

Поживне середовище готують у кількості100 мл. Спочатку готують розчин, що містить мелясу, глюкозу чи сахарозу, оцтову кислоту, додають до

51

нього наважку кукурудзяного екстракту. Потім до розчину додають усі солі за винятком крейди. Наважку крейди додають останньою після ретельного перемішування поживного середовища.

Вимірюють рН середовища потенціометрично і доводять до значення6,9– 7,0 20 %-вим розчином NaOH.

Поживне середовище розливають по50 мл у колби на250 мл, (кожен студент готує 2 колби), закривають пробкою і паперовим ковпаком.

2.Приготовлене поживне середовище в колбах простерилізувати40 хв в автоклаві при надлишковому тиску 0,5 атм.

3.Провести аналіз поживного середовища: визначити рН, вміст сухих речовин, вміст азоту амінокислот (мідний спосіб).

4.Засіяти стерильне поживне середовище однодобовою культурою біологічного агента та поставити колби для вирощування. Визначити оптичну густину засіяного поживного середовища.

5.Приготувати ферментну витяжку з вирощеної культури.

6. В ферментній витяжці визначити амілолітичну активн колориметричним методом, оцукрювальну активність, амілолітичну активність крапельним методом та глюкоамілазну активність.

Контрольні запитання

1. Дайте характеристику промислового одержання амінокислот.

2. Дайте характеристику мікроорганізмів–біологічних , агентівякі використовуються в біотехнологічних виробництвах.

3.Які особливості технологічної схеми культивування бактерій та грбів?

4.1. Дайте характеристику комплексу ферментів амілолітичної :діїзазначте номенклатуру, класифікацію, субстратну специфічність.

5.Які принципи та методи використовуються для визначення активності ферментів амілолітичного комплексу?

6.Що таке міжнародні одиниці ферментативної активності? Що таке питома активність?

7.Який принцип лежить в основі методу визначення амілолітичної активності колориметричним методом? Що таке одиниці активності?

8.	Який	принцип	лежить	в	основі	методу	визначення	оцукрювальн
активності? Що таке одиниці активності?
9.	Який принцип лежить в основі методу визначення глюкоамілазної
активності? Що таке одиниці активності?

52

Лабораторна робота №7 Глибинне культивування мікроорганізмів (закінчення)

Мета роботи: розгляд порівняльної характеристики джерел одержання ферментних препаратів, опанування методів аналізу продуцентів ферментних препаратів.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та накривні скельця; бактеріологічні петлі; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою; барвники (метиленовий синій, розчин Люголя).

		Основні відомості
У	спеціально	створених умовах мікроорганізми здатні синтезувати
величезну	кількість	різноманітних ферментів. Вони невибагливі до складу

поживного середовища легко переключаються з синтезу одного ферменту на інший і мають порівняно короткий цикл росту(16–100 год). Для промислового одержання ферментних препаратів використовують як природні штами мікроорганізмів, виділені з природних об'єктів, так і мутантні штами. Продуцентами ферментів можуть бути різні мікроорганізми: бактерії (у тому числі актиноміцети), гриби, дріжджі. Мікроорганізми можуть синтезувати одночасно цілий комплекс ферментів, але є і такі, особливо серед мутантних штамів, що є моноферментними і утворюють у великих кількостях тільки один фермент.

Визначення протеолітичної активності (ПС) (модифікований метод Ансона)

Основою визначення є широко відомий метод Ансона, з снований на визначенні тирозину, який утворився в результаті ферментативного гідролізу білка, з реактивом Фоліна.

Після дії дослідного ферментного препарату на розчин казеїну білок, що не розклався, осаджують 5 %-ою трихлороцтовою кислотою (ТХО) і у фільтраті

за допомогою колориметричної реакції з реактивом Фоліна визначають кількість гідролізованого білка, який не осаджується ТХО. Беруть кількість розщепленого білка, пропорційну кількості тирозину, що міститься у фільтраті.

Одержані значення оптичної густини переводять у мікромолі тирозину за стандартною кривою, побудованою за чистим тирозином. За одиницю ПС взято таку кількість ферменту, яка каталізує перехід у неосаджуваний ТХО стан

кількість білка, яка містить 1 мікромоль тирозину, за 1 хв при температурі 30

оС.

Протеолітичну активність препаратів виражають числом одиниць 1в г препарату, а розчинів ферментів числом одиниць в 1 мл розчину.

53

		Техніка визначення:
Для	визначення	протеолітичної		активності у	дві пробірки(заввишки
18 см і	діаметром2 см) наливають по			2 мл розчину	казеїну і	вміщують в
ультратермостат з		температурою30	оС. Приблизно		через 10	хв, коли
температура розчину у пробірці буде30				оС, у кожну з них додають по 2 мл

розчину ферменту, струшують і вміщують в ультратермостат для гідролізу на 10 хв. Через 10 хв у обидві пробірки додають по4 мл 5% ТХО, щоб перервати

ферментативну реакцію			і осадити	білки	та	високомолекулярні		продукти
гідролізу. Суміш швидко перемішують і для забезпечення повного осадження
витримують	при	температурі30 оС		ще 20 хв. Потім			фільтрують	через
паперовий	фільтр	на	маленьких	воронках	у	сухі пробірки. Із прозорих
фільтратів відбирають у			пробірки по1	мл, додають		по 5	мл 0,5 М розчину

Na2CO3, перемішують і при безперервному перемішуванні швидко додають по 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна. Дають реакційній суміші постояти 20

хв. Розчини	набувають	блакитного	забарвлен, інятенсивність	якого
визначають на фотоелектроколориметрі.
Глухий	дослід (контроль)	готують,	додаючи реагенти у зворотному

порядку: до 2 мл ферментного розчину того самого розведення, що і в досліді, додають 4 мл ТХО, витримують в ультратермостаті 10хв, а потім вносять 2 мл субстрату.

Через 20 хв витримування в термостаті розчин фільтрують, відбирають у суху пробірку 1 мл фільтрату, а потім при перемішуванні вносять5 мл 0,5 М Na2CO3 та 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна. Контрольна проба повинна

мати слабке блакитне забарвлення.
Колориметрування	здійснюють на ФЕК	з	червоним	світлофільтром
(довжина хвилі 670 нм) в	кюветах завтовшки10	мм.	Спочатку	визначають

поглинання контролю проти водиDk, а потім поглинання дослідного розчину проти води D0. Дійсне поглинання розчину становить D0 – Dk. Для забезпечення достоменності аналізу поглинання розчину має бути в межах0,3...0,6. У розрахунках використовують середнє значення, одержане із двох паралельних визначень.

Побудова калібрувальної кривої.

Для розрахунку активності необхідно побудувати калібрувальну криву по тирозину і обчислити за нею тирозиновий еквівалент, тобто ту оптичну густину, яку дав би1 мкМ тирозину в1 мл. Тирозиновий еквівалент використовується для обчислення протеолітичної активності.

Для побудови калібрувальної кривої готують розчин тирозину концентрацією 10-3 М. Для цього наважку182,19 мг чистого тирозину розчиняють в 1 л 0,2 н. HCl. Із цього вихідного розчину готують подальші розведення, при цьому беруть1, 2, 3, 4, 5 мл вихідного розчину у мірну колбочку місткістю 50 мл і доводять до мітки0,2 н. HCl. Тоді виготовлені розчини будуть мати відповідно 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 мкМ тирозину в 1 мл.

Потім у пробірку вносять по1 мл стандартних розчинів, додають при перемішуванні по 5 мл 0,5 М Na2CO3 і 1 мл робочого розчину Фоліна. Глухий

54

дослід готують так само, але замість розчину тирозину	беруть1 мл
дистильованої води. Через 20 хв після додавання реактивів	інтенсивність

утвореного забарвлення вимірюють на фотоелектроколориметрі. Вимірювання проводять проти глухого досліду з червоним світлофільтром у кюветах з завтовшки 10 мм. Для більшої точності рекомендується приготувати три наважки тирозину і провести описаним вище методом три паралельних досліди.

За одержаними даними будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис кількість тирозину, а на осі ординат– відповідні значення оптичної густини (Рис. 3).

0,6
0,5
0,4
у.о.
0,3
D,
0,2
0,1
0
0	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3
		Вміст тирозину, мкмоль/мл

Рис. 7.1. Залежність оптичної густини від концентрації тирозину

На	основі	калібрувального графіка виводять				тирозиновий	еквівалент
(ТЕ). ТЕ	–	оптична	густина		розчину	тирозину, який	містить
1 мкМ тирозину в1 мл. На наведеній кривій 0,1 мкМ тирозину дає оптичну
густину 0,151, тоді 1 мкМ повинен дати 1,51. Значить ТЕ дорівнює 1,51.
Розрахунок активності. Протеолітичну активність од/,г визначають за
формулою				D ×4
			ПС=		×1000 , од/г
				ТE ×10 ×n

де D=D0 –DK – оптична густина; 4 – об’єм реакційної суміші, мл; 10 - час гідролізу, хв; n – кількість ферментного препарату, яку взято на протеоліз, мг у 1 мл ферментного розчину; 1000 – переведення одержаних одиниць на1 г ферментного препарату.

Для визначення протеолітичної активності розчину(наприклад, культуральної рідини), од/мл, користуються формулою,

55