і дослідного розчинів, мл); а – наважка препарату, взятого на аналіз, г; t – час гідролізу, хв.

Приклад розрахунку. На аналіз взято5 мл ферментного розчину після розведення 1:10000, тобто α=0,0005 г. На титрування контролю пішло19,5 мл 0,1 н розчину гіпосульфіту, а на титрування досліду– 17,8 мл. Різниці 1,7 мл відповідає активність 93,6 од. (табл.6.1).

Тоді

	OЗ =	93,6		=18720	од/мл.
		0,0005	×10

Визначення глюкоамілазної активності (ГлС)

Метод заснований на визначенні глюкози, яка утворюється в результаті

гідролізу розчинного крохмалю глюкоамілазою.
Глюкоамілазна	активність	характеризує	властивість	ферментного

препарату каталізувати розщеплення розчинного крохмалю до глюкози і виражається числом одиниць активності в 1 г препарату.

За одиницю глюкоамілазної активності взято таку кількість ферменту, яка, діючи на розчинний крохмаль при температурі 30 ºС і рН 4,7 протягом 1 хв звільняє 1 мкмоль глюкози.

Глюкозу визначають глюкозооксидазним методом, заснованим на тому, що фермент глюкозооксидаза каталізує окиснення глюкози киснем повітря до глюконової кислоти. Другим продуктом реакції є пероксид водню. Обидва кінцеві продукти утворюються в кількостях, еквімолярних окисненню глюкози.

До реакційного середовища вводять реактив гексаціаноферрат калію(II).

Кисень, який	утворився		при	відновленні			пероксиду ,		воднюокислює
гексаціаноферрат	калію (II)		K4Fe(CN)6		у	гексаціаноферрат			калію(III)
K3Fe(CN)6. Реакція йде за рівнянням:
	2K4Fe(CN)6 + 0,5O2 + H2O ®2K3Fe(CN)6 + 2KOH
Утворюється розчин,		забарвлений		у лимонно-жовтий колір. Інтенсивність
забарвлення пропорційна кількості глюкози.
Прилади, посуд, реактиви:
Ультратермостат;		піпетки			мірні;	пробірки;		водяна	баня;

фотоелектроколориметр; 1%-й розчин розчинного крохмалю; буферні розчини: ацетатний із рН 4,7 і фосфатний із рН7,5; 0,1 %-й розчин гексаціаноферрату калію (ІІ); розчин ферментів (глюкозооксидази і пероксидази); глюкозооксидазний реактив; стандартний розчин глюкози; насичений розчин

бензойної кислоти.
1 М фосфатний буфер рН7,5: готують 1 М			розчини І і .ІІРозчин		І –
однозаміщений	фосфорнокислий	калій. Для	його	приготування136	г

безводного однозаміщеного фосфорнокислого калію розчиняють у мірній колбі місткістю 1 л і доводять дистильованою водою до мітки. Розчин ІІ – 1 М розчин їдкого калію. Для його приготування56 г їдкого калію розчиняють у мірній колбі на 1 л і доводять об’єм до мітки дистильованою водою. 1 М фосфатний

45

буфер рН 7,5 готують перемішуванням рівних об’ємів розчинів І і ІІ. Величину рН перевіряють потенціометрично;

0,1 %-й розчин гексаціаноферрату калію(ІІ) – розчин А. Для його приготування, 0,1 г K4Fe(CN)6 розчиняють у воді у мірній колбі на100 мл. Розчин готують безпосередньо перед визначенням;

Розчин глюкозооксидази – розчин В. Для його приготування5 – 6 мг глюкозооксидази з активністю у цій наважці500 – 600 од. розчиняють у 1 М фосфатному буфері рН7,5 у колбочці місткістю50 мл, потім додають 2 мг пероксидази і об’єм доводять до 50 мл дистильованою водою.

Глюкозооксидазний реактив (робочий розчин С): готують змішуванням рівних об’ємів розчинів А і В. Одержаний розчин зберігають у темній склянці на холоді протягом 2 – 3 діб;

Насичений розчин бензойної кислоти. Для його приготування2,7 г бензойної кислоти розчиняють дистильованою водою і доводять до1 л. Розчин використовують для приготування стандартних розчинів глюкози.

Порядок виконання роботи:

5 мл досліджуваного розчину ферментного препарату приливають у

пробірку	на 25 мл, нагрівають до 30° С, доливають 10 мл 1 %-го			розчину
крохмалю,	нагрітого до	такої ж	температури, і инкубують 10	хв	в
ультратермостаті при 30±0,2°		С. Після	витримування відбирають	по1	мл

гідролізату в дві пробірки, які містяться у киплячій водяній бані, і витримують 3 хв для інактивації ферменту, потім розчини охолоджують у проточній воді. Аналіз проводять у двох повторностях. Для визначення вмісту глюкози в кожну пробірку з охолодженим гідролизатом вносять по3 мл глюкозооксидазного реактиву, розчин перемішують і залишають на 45 хв при кімнатній температурі.

Одночасно з досліджуваною пробою готують контрольну. Дня цього 5 мл розчину ферментного препарату поміщають у пробірку і нагрівають60 хв у киплячій водяній бані для інактивації ферменту. Потім розчин охолоджують, додають до нього 10 мл субстрату і проводять усі наступні операції так само, як з дослідним розчином. Крім зазначеної контрольної проби, ставлять контрольну на глюкозооксидазний реактив. Для цього до3 мл реактиву доливають1 мл дистильованої води. Після витримування дослідного і контрольного розчинів у них з’являється лимонно-жовте забарвлення, інтенсивність якого вимірюють на фотоелектроколориметрі при світлофільтрі з довжиною 420хвилінм, користуючись кюветою з товщиною шару10 мм. Порівнюють з контрольним розчином на глюкозооксидазний реактив або на інактивований фермент.

Отримані дані використовують для визначення за калібрувальним графіком кількості глюкози, що утворилася у процесі ферментативного гідролізу крохмалю.

Оптична густина досліджуваних розчинів повинна лежати у робочій зоні проградуйованого графіка (рис. 6.1), у іншому разі дослід повторюють з меншою кількістю досліджуваного ферментного препарату.

46

0,4
0,3
у.о
0,2
D,
0,1
0
0	40	80	120	160
	Вміст глюкози, мкг/мл

Рис. 6.1 Залежність оптичної густини розчинів від вмісту в них глюкози, яка визначається з гексаціанофератом калію

Глюкоамілазну активність визначають за формулою

a ГлС = 180 ×10b ,

де a- кількість глюкози, яка утворюється у 1 мл гідролізату, мкг; 180 – молекулярна маса глюкози (перерахунок мкг у мкмолі); 10 – час гідролізу, хв; b

– кількість ферменту в 1 мл гідролізату, г або мл.

Приклад розрахунку. 100 мг ферментного препарату розчинено у 100 мл дистильованої води. Потім 15 мл одержаного розчину перенесено у мірну колбу на 100 мл і доведено до мітки дистильованою водою. Тоді кількість ферменту у 1 мл гідролізату буде

	В =		0,1×15 ×5	= 0,00005	г.
		100 ×100 ×15

При колориметричному визначенні отримано величину =0,173,Е що за калібрувальним графіком відповідає 87 мкг глюкози. Тоді

87 ГлС = 0,00005 ×180 ×10 = 967 од./г.

Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності крапельним методом

Амілолітична активність визначається крапельним методом візуальним спостереженням за зміною забарвлення крохмалю з йодом під дією на крохмаль амілаз. Вона характеризує властивість каталізувати гідроліз крохмалю до незабарвлених йодом декстринів, зумовлену в основному наявністю у препараті a-амілази. За наявності у препаратіb-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

47