розчину виготовлено робочий розчин– 2 мл вихідного розчину розведено до 200 мл водою. Тоді в 5 мл робочого розчину, які використовують для проведення ферментативної реакції, буде вміщуватись 0,05 мг препарату або n.
Одержані значення оптичної густини: D1=0,745 і D2=0,463.
Кількість прогідролізованого крохмалю
C = 0,745 - 0,463 0,1 = 0,03785 г. 0,745
Тоді активність даного препарату буде
|
AC = |
7,264 ×0,03785 - 0,03766 |
×1000 = 474,5 од./г. |
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
0,05 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Визначення оцукрювальної активності |
|
|
|
|
|
|||||||
Метод визначення загальної оцукрювальної активності(ОЦ) заснований |
|
|||||||||||
на гідролізі крохмалю в межах25 % глікозидних зв’язків досліджуваним |
|
|||||||||||
ферментним препаратом з наступним йодометричним визначенням кількості |
|
|||||||||||
утворених цукрів. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Оцукрювальна |
активність |
|
характеризує |
здатність |
амілолітичних |
|||||||
ферментів каталізувати оцукрювання крохмалю до відновлювальних цукрів– |
|
|||||||||||
мальтози і мальтози в суміші з глюкозою. Таким |
чином, оцукрювальна |
|
||||||||||
активність відображає в основному активність b-амілази і глюкоамілази. |
|
|||||||||||
За одиницю оцукрювальної активності взято таку кількість ферменту, яка |
|
|||||||||||
в строго визначених умовах 1захв при |
температурі30 |
ºС |
каталізує |
|
||||||||
розщеплення |
до відновлювальних |
|
цукрів1 |
мікроеквівалента |
глікозидних |
|
||||||
зв’язків і виражається в міжнародних одиницях Е/г. |
|
|
|
|
||||||||
Прилади, посуд, реактиви: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Конічні колби місткістю 50 і 500 мл; піпетки; термостат на 30 ºС; 1 %-й |
|
|||||||||||
розчин розчиненого крохмалю (приготованого раніше); 1 н. розчин ацетатного |
|
|||||||||||
буфера рН 4,7 (приготування див. вище); |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
0,1 н розчин йоду(25 г хімічно чистого йодистого калію розчиняють у |
|
|||||||||||
мінімальній кількості дистильованої води і додають12,7 г "х.ч" йоду. Після |
|
|||||||||||
повного |
розчинення |
йоду |
|
|
об’єм |
розчину |
дов |
|||||
1 л дистильованою водою. Розчин зберігають у темній склянці); |
|
|
|
|||||||||
0,1 н розчин гіпосульфіту(25 г "х.ч" сірчистого натрію розчиняють в |
|
|||||||||||
дистильованій воді, яка не містить вуглекислоти, і доводять об’єм розчину до |
|
|||||||||||
1 л); |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
розчин |
сірчистої |
кислоти1:4 |
(до |
4 |
об’ємів дистильованої води |
|
||||||
приливають 1 об’єм "х.ч" концентрованої сірчистої кислоти); |
|
|
|
|||||||||
0,1 н розчин їдкого натру або їдкого калію(4 г їдкого натру або5,6 г |
|
|||||||||||
їдкого калію розчиняють у дистильованій воді і об’єм доводять до 1 л). |
|
|
||||||||||
1 н розчин соляної кислоти(82,2 |
мл |
"х.ч" концентрованої |
кислоти |
|
||||||||
розбавляють дистильованою водою до 1 л). |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
42
Порядок виконання роботи:
У конічні колби місткістю50 мл відмірюють піпеткою20 мл 1 %-го розчину крохмалю і ставлять у термостат з температурою30 ºС на 10 хв, щоб розчини набули температуру 30 ºС. Потім у колбочки з крохмалем добавляють 1...10 мл ферментного розчину і старанно перемішують. Загальний об’єм реакційної суміші має становити30 мл. Якщо на визначення беруть не10 мл
ферментного |
розчину, |
то |
для одержання |
потрібного |
об’єму |
доливають |
|||
дистильовану воду перед введенням розчину ферменту. |
|
|
|
||||||
Реакцію |
проводять |
точно10 |
хв |
після |
добавлення |
ферменту |
при |
||
температурі 30 ºС. Через 10 хв дію ферменту припиняють додаванням 2 |
мл 1 н |
||||||||
розчину соляної кислоти. Для визначення |
редукуючих цукрів, що утворилися, |
||||||||
вміст колби |
після |
оцукрювання |
кількісно |
переносять |
у колбу |
місткістю |
|||
300...400 мл, змиваючи водою. Піпеткою додають 20 мл 0,1 н розчину йоду і негайно 60 мл 0,1 н розчину їдкого натрію або їдкого калію. Луг приливають краплями при перемішуванні, потім колбу накривають годинниковим склом і залишають на 15 хв у захищеному від світла місці. Через 15 хв добавляють 2 мл сірчаної кислоти (1:4) і титрують йод, що виділився, 0,1 н розчином гіпосульфіту.
Таблиця 6.1
Дані для розрахунку оцукрювальної здатності розчинів, приготованих на ацетатному буфері (рН 4,7)
1 мл 0,1 н |
Одиниці |
1 мл 1,1 н |
Одиниці |
1 мл 0,1 н |
Одиниці |
розчину |
активності, е |
розчину |
активності е |
розчину |
активності, е |
гіпосульфіту |
|
гіпосульфіту |
|
гіпосульфіту |
|
0,1 |
5,0 |
2.1 |
118,9 |
4,1 |
273,8 |
0,2 |
10,0 |
2,2 |
125,5 |
4,2 |
283,2 |
0,3 |
15,0 |
2,3 |
132,1 |
4,3 |
292,8 |
0,4 |
20,2 |
2,4 |
138,9 |
4,4 |
302,7 |
0,5 |
25,5 |
2,5 |
145,8 |
4,5 |
312,8 |
0,6 |
30,8 |
2,6 |
152,8 |
4,6 |
323,1 |
0,7 |
36,2 |
2,7 |
159,9 |
4,7 |
333,6 |
0,8 |
41,6 |
2,8 |
167,1 |
4,8 |
344,6 |
0,9 |
47,0 |
2,9 |
174,5 |
4,9 |
355,5 |
1,0 |
52,6 |
3,0 |
181,9 |
5,0 |
366,9 |
1,1 |
58,2 |
3,1 |
189,5 |
5,1 |
378,6 |
1,2 |
63,9 |
3,2 |
197,2 |
5,2 |
390,6 |
1,3 |
69,7 |
3,3 |
205,1 |
5,3 |
402,9 |
1,4 |
75,5 |
3,4 |
213,1 |
5,4 |
415,6 |
1,5 |
81,5 |
3,5 |
221,3 |
5,5 |
428,8 |
1,6 |
87,6 |
3,6 |
229,6 |
5,6 |
442,3 |
1,7 |
93,6 |
3,7 |
238,1 |
5,7 |
456,2 |
1,8 |
99,8 |
3,8 |
246,8 |
5,8 |
470,6 |
1,9 |
106,1 |
3,9 |
255,6 |
5,9 |
485,0 |
2,0 |
112,5 |
4,0 |
264,6 |
6,0 |
501,2 |
43
Таблиця 6.2
Дані для розрахунку оцукрювальної здатності розчинів, приготованих на фосфатному буфері (рН 5,9)
1 мл 0,1 н |
Одиниці |
1 мл 0,1 н |
Одиниці |
1 мл 0,1 н |
Одиниці |
||
розчину |
активності, е |
розчину |
|
активності, |
розчину |
активності, е |
|
гіпосульфіту |
|
|
гіпосульфіту |
е |
гіпосульфіту |
|
|
0,9 |
|
45,0 |
1,9 |
|
108,5 |
3,0 |
226,1 |
1,0 |
|
52,1 |
2,0 |
|
113,1 |
3,1 |
250,6 |
1,1 |
|
58,7 |
2,2 |
|
128,8 |
3,2 |
278,2 |
1,2 |
|
63,3 |
2,3 |
|
138,0 |
3,3 |
312.1 |
1,3 |
|
67,8 |
2,4 |
|
150,3 |
3,4 |
366,2 |
1,4 |
|
74,7 |
2,5 |
|
158,3 |
3,5 |
452,3 |
1,5 |
|
81,4 |
2,6 |
|
169,7 |
3,6 |
517,9 |
1,6 |
|
85,9 |
2,7 |
|
180,9 |
3,7 |
585,7 |
1,7 |
|
92,7 |
2,8 |
|
192,3 |
3,8 |
662,7 |
1,8 |
|
99,6 |
2,9 |
|
209,9 |
4,0 |
811,9 |
|
|
|
|
|
|
4,1 |
891,6 |
|
|
|
|
|
|
4,2 |
968,1 |
Примітки: |
1. |
У |
зв’язку |
з |
кислотостійкістю |
амілази |
культур |
A. awamori і A. niger при визначенні ОЦ препаратів, одержаних із цих культур, в техніку визначення вносять деякі зміни. Для поліпшення реакції добавляють не2 мл 1 н. розчину HCl, а 10 мл, відповідно змінюють кількість додаваного лугу – спочатку додають 8 мл 1 н. розчину NaOH, а потім 60 мл 0,1 н. розчину NaOH. 2. Оцукрювальну активність у культурах і препаратах B. subtilis визначають за наведеною методикою, але розчин крохмалю готують не на ацетатному буфері, а на фосфатному рН 5,9 (до 100 мл розчину крохмалю має бути додано 10 мл фосфатного буферу 1/15 М з рН 5,9). Оцукрювальну здатність розраховують за тією самою формулою, використовуючи табл. 6.2 для переводу кількості мілілітрів 0,1 н
розчину гіпосульфіту в одиниці активності( мікроеквівалентах зачеплених гідролізом глікозидних зв’язків).
Одночасно ставлять контрольний дослід з такими самими кількостями всіх реагентів у колбі місткістю300...400 мл, тільки ферментний розчин вводять після додавання2 мл 1 н розчину соляної кислоти(без витримки у водяній бані).
Різниця між титруванням контрольного і дослідного розчинів має бути 0,5 – 6 мл 0,1 н розчину гіпосульфіту. Якщо вона менш як 0,5 чи більш як 6 мл, аналіз повторюють відповідно з більшою або меншою кількістю ферментного розчину.
Оцукрювальна здатність:
e
OЗ = a ×t , од/мл
де e – кількість одиниць активності в мікроеквівалентах глікозидних зв’язків, знайдена за таблицею відповідно до результатів титрування(різниця між кількістю 0,1 н розчину гіпосульфіту, витраченого на титрування контрольного
44