Praktikum_biology_1_kurs

бактеріологічною петлею й наносять на поверхню поживного середовища біля краю чашки. Знімають надлишок матеріалу й проводять його посів паралельними штрихами від краю до краю чашки (див. рис. 78). Через добу інкубації посівів за оптимальної температури на поверхні чашки виростають ізольовані колонії мікроорганізмів (рис. 80).

Рис. 80. Ізольовані колонії мікроорганізмів, одержані методом штрихових посівів.

Після посіву чашки поміщають у термостат кришками вниз, щоб конденсаційна вода, що утворилася на кришці чашки Петрі, не перешкодила одержати ізольовані колонії. Чашки витримують у термостаті протягом 1...7 діб залежно від швидкості росту мікроорганізмів. Вирослі ізольовані колонії відсівають петлею на поверхню скошеного щільного середовища в пробірки або в рідке середовище.

11.1.2. Виділення чистої культури з однієї клітини. Чисту культуру з однієї клітини можна виділити краплинним методом, за допомогою мікроманіпулятора або мікроселектора.

Краплинний метод Лінднера використовують під час роботи з великими мікроорганізмами: дріжджами, міцеліальними грибами, водоростями. Порядок роботи наступний. Накопичувальну культуру розводять у стерильному середовищі з таким розрахунком, щоб у невеликій краплі були одиночні клітини мікроорганізмів. Потім на поверхню стерильного покривного скла стерильним сталевим пером наносять ряд крапель приготовленого розведення. Готують препарат «висяча крапля». Нанесені на покривне скло краплі переглядають під мікроскопом і відзначають ті, у яких виявлена тільки одна клітина. Після цього препарат поміщають у термостат у вологу камеру, якою зазвичай служить чашка Петрі зі зволоженим фільтрувальним папером на дні. Через 12...24 год відзначені краплі знову мікроскопіюють. Ті краплі, в яких спостерігається утворення мікроколоній, обережно знімають із покривного скла шматочками стерильного фільтрувального паперу й переносять у пробірки зі стерильним середовищем.

Виділення окремих клітин за допомогою мікроманіпулятора.

Мікроманіпулятор – прилад, що дозволяє за допомогою спеціальної мікропіпетки або мікропетлі вилучати одну клітину з суспензії. Цю операцію контролюють під мікроскопом. Мікроманіпулятор має два операційних штативи, між якими розташований звичайний мікроскоп (рис. 81). На

91

предметному столику мікроскопа встановлена волога камера, у яку поміщають препарат «висяча крапля». У тримачах операційних штативів закріплені мікропіпетки (мікропетлі), переміщення яких у поле зору мікроскопу здійснюється з мікронною точністю завдяки системі гвинтів і важелів. Мікропіпетки вводять у вологу камеру таким чином, щоб їхні кінці виявилися у висячій краплі. Дослідник, дивлячись у мікроскоп, вилучає окремі клітини мікропіпетками і переносить їх у пробірки з стерильним рідким середовищем.

Виділення окремих клітин за допомогою мікроселектора Перфільєва.

Найбільш істотною частиною мікроселектора Перфільєва є скляний мікрокапіляр, що має строгий прямокутний перетин. Завдяки цьому канал капіляра добре проглядається навіть із імерсійним об’єктивом. Стерильний капіляр заповнюють досліджуваною суспензією клітин в агаризованому поживному середовищі і за великого збільшення мікроскопа знаходять ділянку з однією клітиною. Спеціальним інструментом цю ділянку капіляра стерильно вибивають у приймач, з якого потім переносять у стерильне середовище. Мікроселектор Перфільєва можна використовувати для виділення як великих, так і дрібних мікроорганізмів.

Рис. 81. Мікроманіпулятор з ковзними площинами конструкції Рейнерта: 1 – нижня пластина штатива, 2 – стовпчик, 3 – загальна підставка для мікроскопа й мікроманіпулятора, 4, 5 – ковзна пластина з рукояткою, 6 – штатив мікроманіпулятора для кріплення мікроінструментів (7)

11.2. Методи кількісного обліку мікроорганізмів

Методи кількісного обліку мікроорганізмів можуть бути прямими (підрахунок клітин під мікроскопом, зважування на вагах) або непрямими. Непрямі методи засновані на вимірі параметрів, величина яких залежить від кількості або біомаси мікроорганізмів (кількість колоній, що виросли після

92

висіву суспензії клітин на поживне середовище, розсіювання або поглинання суспензією клітин світла, вміст у ній білка й ін.).

11.2.1. Підрахунок клітин мікроорганізмів під мікроскопом.

Підрахувати клітини мікроорганізмів під мікроскопом можна, використовуючи лічильні камери, капіляри Перфільєва, препарати фіксованих і зафарбованих клітин, приготовлені на предметних скельцях або мембранних фільтрах.

Підрахунок клітин у лічильних камерах. Цей метод рекомендується використовувати для підрахунку великих об’єктів – дріжджів, одноклітинних водоростей, конідій грибів і деяких щодо великих бактерій. Зазвичай використають камеру Горяєва - Тома (рис. 82), хоча можна застосовувати й інші лічильні камери. Камера Горяєва являє собою товсте предметне скло, розділене борозенками. На центральну частину скла нанесена сітка. Площа квадрата сітки зазначена на одній зі сторін предметного скла й відповідає 1/25 мм2 (великий квадрат) або 1/400 мм2 (малий квадрат). Частина предметного скла, на якій нанесена сітка, на 0,1 мм нижче двох інших сторін. Це глибина камери; вона завжди вказується на предметному склі.

а

б

г

в

д

Рис. 82. Лічильна камера Горяєва-Тома:

а – вид зверху; б – вид збоку; в – при малому збільшенні мікроскопа; г – зовнішній вигляд; д – клітини в камері Горяєва під мікроскопом.

При роботі з камерою необхідно дотримуватися певного порядку її заповнення. Спочатку заглиблення із сіткою покривають спеціальним шліфованим покривним склом і, злегка притискаючи, зміщають покривне скло в протилежні сторони до появи кілець Ньютона. Це вказує на те, що покривне скло притерте до сторін камери. Тільки за такої умови об’єм суспензії мікроорганізмів, що перебуває в камері, відповідає розрахунковому. Після цього камеру заповнюють досліджуваною суспензією мікроорганізмів.

93

Суспензію вносять через борозенку камери капіляром або піпеткою. Підрахунок клітин рекомендується починати через 3...5 хв після заповнення камери, щоб клітини осіли і у ході мікроскопіювання були видимі в одній площині.

Кількість клітин підраховують із об’єктивом 8× або 40×. З імерсійним об’єктивом працювати не можна, оскільки його фокусна відстань менше товщини скла камери. Підраховують клітини мікроорганізмів в 10 великих або 20 маленьких квадратах сітки, переміщаючи останні по діагоналі. Враховують всі клітини, що лежать у квадраті сітки, а також клітини, що перетинають верхню й праву сторони квадрата. При підрахунку кількість клітин у великому квадраті не повинно перевищувати 20, а в малому – 10, у іншому випадку вихідну суспензію розводять водопровідною водою. Для одержання достовірного результату загальне число підрахованих клітин мікроорганізмів повинне бути не менш 600.

Кількість клітин в 1 мл досліджуваної суспензії обчислюють за формулою:

	М =	а ×10	3	× n	(1.3)
		h ×S

де М – кількість клітин в 1 мл суспензії; а – середня кількість клітин у квадраті сітки; h – висота камери в мм; S – площа квадрата сітки в мм2; 103 – коефіцієнт переведення см3 у мм3; n - розведення досліджуваної суспензії.

Підрахунок клітин у капілярах Перфільєва. Для вивчення й підрахунку мікроорганізмів у природних субстратах іноді застосовують капіляри Перфільєва. Вони мають прямокутний перетин і за принципом підрахунку аналогічні лічильній камері. Під час занурення капіляра в субстрат (мул, ґрунт і т.д. ) він заповнюється в силу своїх капілярних властивостей. Потім капіляр поміщають на предметне скло, заливають кінець розплавленим парафіном і підраховують клітини, використовуючи об'єктиви 40×, 90× або фазовоконтрастний пристрій.

Довжина відрізка капіляру відповідає діаметру поля зору за даного збільшення мікроскопу. Для одержання достовірного результату підраховують клітини в 50...100 полях зору. Кількість клітин в 1 мл досліджуваного субстрату визначають за формулою:

	М =	а ×103	×n	(1.4)
		h ×l ×d

де М – кількість клітин в 1 мл суспензії; а – середня кількість клітин у капілярі довжиною в діаметр поля зору; h - висота капіляру в мм; l -ширина капіляру в мм; d – діаметр поля зору (довжина капіляру) при даному збільшенні мікроскопа в мм; 103 – коефіцієнт переведення см3 у мм3; n - розведення досліджуваної суспензії.

94

Підрахунок клітин на мембранних фільтрах. Цей метод рекомендується використовувати для визначення чисельності мікроорганізмів у субстратах з низькою щільністю клітин. Його застосовують для визначення кількості мікроорганізмів у різних водоймах, під час санітарно-бактеріологічних і деяких інших досліджень. Фільтрування проби певного об’єму (від декількох милілітрів до десятків літрів) дозволяє сконцентрувати на поверхні фільтра клітини мікроорганізмів, що містяться в пробі. Потім їх фарбують і підраховують.

Стерильний мембранний фільтр матовою стороною догори поміщають на пористу пластинку спеціального тримача, аналогічно як для стерилізуючої фільтрації (див. рис. 72) й пропускають через нього точно виміряний об’єм досліджуваної проби. Клітини мікроорганізмів, що осіли на фільтрі, фарбують карболовим еритрозином. Для цього фільтр поміщають нижньою стороною в чашку Петрі на фільтрувальний папір, зволожений барвником, чашку закривають кришкою й залишають на 3...5 год. або навіть на добу. Для рівномірного фарбування клітин мембранний фільтр повинен щільно прилягати до паперового фільтра з еритрозином. Потім мембранний фільтр відмивають від барвника, перекладаючи його в чашки Петрі з фільтрувальним папером, рясно змоченим дистильованою водою, доти, доки він не перестане забарвлювати вологий фільтрувальний папір. Після відмивання фільтр висушують на повітрі й готують препарат для мікроскопіювання. На предметне скло капають імерсійну олію й поміщають на нього зафарбований мембранний фільтр так, щоб клітини мікроорганізмів були зверху. На поверхню мембранного фільтра наносять ще краплю імерсійної олії й покривають фільтр покривним склом.

Кількість клітин мікроорганізмів підраховують із імерсійним об’єктивом 90× у квадратах окулярної сітки або в полі зору мікроскопа. Кількість клітин в 1 мл досліджуваного субстрату обчислюють за формулою:

	М =	а × F ×106	(1.5)
		s ×V

де М – кількість клітин в 1 мл суспензії; а – середня кількість клітин у квадраті окулярної сітки (полі зору); F – площа мембранного фільтру в мм2; 106

– коефіцієнт переведення мм2 у мкм2; s - площа квадрата окулярної сітки (поля зору) в мм2; V – об’єм профільтрованої проби в мл.

11.2.2. Визначення кількості клітин мікроорганізмів висівом на поживні середовища. На відміну від підрахунку мікроорганізмів під мікроскопом цей метод дає можливість визначити тільки число життєздатних клітин у популяції. Оскільки середовищ, придатних для росту всіх мікроорганізмів, не існує, метод висіву дає можливість визначити число мікроорганізмів, здатних рости на середовищі даного складу, але не дозволяє врахувати ті мікроорганізми, які не ростуть або ростуть украй повільно. Це

95

важливо пам’ятати під час аналізу таких природних субстратів, як ґрунт, вода тощо.

Визначення кількості клітин висівом на щільні поживні середовища

(чашковий метод Коха). Метод широко застосовують для визначення чисельності життєздатних клітин у різних природних субстратах і в лабораторних культурах. У його основі лежить принцип Коха, відповідно до якого кожна колонія є потомством однієї клітини. Це дозволяє на обрахувавши кількість колоній, що виросли після посіву на щільне поживне середовище певного об’єму досліджуваної суспензії, судити про вихідний вміст у ній клітин мікроорганізмів. Результати кількісного обліку мікроорганізмів, проведеного методом Коха, часто виражають не в числі клітин, а в умовних одиницях – так званих колонієутворювальних одиницях (КУО). Визначення проводиться у три етапи: приготування розведень, посів на щільне середовище в чашки Петрі й підрахунок вирослих колоній.

1.Приготування розведень. Для одержання ізольованих колоній необхідно приготувати ряд послідовних розведень. Розведення готовлять у стерильній водопровідній воді або 0,9%-вому розчині NaCl (фізрозчині). У ході досліду доцільно використати однаковий коефіцієнт розведення, наприклад 10, що зменшує ймовірність помилки.

Для приготування розведень стерильну водопровідну воду розливають по 9 мл у стерильні сухі пробірки. Потім 1 мол досліджуваної суспензії

стерильною піпеткою переносять у пробірку з 9 мл стерильної води - це 1-ше розведення, 10-1. Отримане розведення ретельно перемішують новою стерильною піпеткою, вбираючи в піпетку й випускаючи з неї отриману суспензію. Цю процедуру виконують 3...5 разів, потім тією же піпеткою

відбирають 1 мл отриманої суспензії й переносять в 2-гу пробірку – одержують 2-е розведення (10-2). У такий же спосіб готують і наступні розведення (рис. 83).

Ступінь розведення залежить від щільності досліджуваної популяції мікроорганізмів; відповідно він тим більше, чим більше щільність популяції.

2.Посів. Висівати суспензію можна поверхневим або глибинним способом. Поверхню агаризованных середовищ перед посівом рекомендується підсушувати для видалення конденсаційної води. Після того як середовище готове, на його поверхню стерильною піпеткою наносять точно відміряний об’єм (0,05 або 0,1 мл) відповідного розведення й розподіляють його стерильним шпателем по поверхні середовища. Висіви на щільне середовище проводять, як правило, із трьох останніх розведень, причому з кожного роблять 2...4 паралельних висіви. Посіви можна робити однією піпеткою, але при цьому починати треба обов'язково з більшого розведення. Для кожного розведення використають новий стерильний шпатель. Після посіву чашки Петрі поміщають

утермостат кришками внизПри глибинному посіві точно точно відміряний об’єм (як правило 0,1, 0,5 або 1,0 мл) вихідної суспензії або розведення вносять

урозплавлене й охолоджене до 48...50°С агаризоване середовище, ретельно перемішують і потім негайно виливають у чашку Петрі. Коли середовище застигне, чашки Петрі перевертають догори дном і поміщають у термостат.

96

Рис. 83. Схема приготування розведень і розсіву суспензії мікроорганізмів шпателем

Для визначення кількості клітин анаеробних мікроорганізмів чашки Петрі із щільним середовищем після посіву поміщають в анаеростати.

3. Колонії мікроорганізмів залежно від швидкості росту підраховують через 2...15 доби інкубації. Підрахунок, як правило, проводять, не відкриваючи чашок Петрі. Для зручності кожну перелічену колонію відзначають крапкою на зовнішньому боці дна чашки. За великої кількості колоній дно чашки Петрі ділять на сектори, прораховують колонії в кожному секторі й підсумують результати. Іноді для підрахунку колоній використовують спеціальні напівавтоматичні лічильники.

Кращим розведенням варто вважати те, при висіві з якого в чашці Петрі виростає від 30...50 до 100...150 колоній. Якщо кількість вирослих колоній виявилося менше 10, то ці результати для розрахунку кількості клітин у вихідному матеріалі не використовують. Результати паралельних висівів з того самого розведення підсумують і визначають середню кількість колоній.

Кількість клітин в 1 мл досліджуваного субстрату обчислюють за формулою

	М =	а ×10n	(1.6)
		V

де М – кількість клітин в 1 мл суспензії; а – середня кількість колоній при висіві розведення, з якого зроблений висів; V – об’єм суспензії, узятий для посіву, мл; 10n – коефіцієнт розведень.

97

Завдання на виконання

1. Закінчити роботу із виділення чистої культури мікроорганізмів. Визначити родову та видову назву виділених чистих культур.

2. Провести підрахунок кількості дріжджових клітин за допомогою камери Горяєва. Для цього змонтувати камеру: покрити камеру спеціальним шліфованим покривним склом і, злегка притискаючи, притерти покривне скло до появи кілець Ньютона. Після цього камеру заповнити досліджуваною суспензією мікроорганізмів. Суспензію внести через борозенку камери піпеткою. Підрахунок клітин розпочинати через 3...5 хв після заповнення камери, щоб клітини осіли і у ході мікроскопіювання були видимі в одній площині. Підрахувати клітини мікроорганізмів в 10 великих або 20 маленьких квадратах сітки, переміщаючи останні по діагоналі. Врахувати всі клітини, що лежать у квадраті сітки, а також клітини, що перетинають верхню й праву сторони квадрата. При підрахунку кількість клітин у великому квадраті не повинна перевищувати 20, а в малому – 10. Результати підрахунків занести до лабораторного зошиту.

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 11, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Поняття про чисту та накопичувальну культуру мікроорганізмів. Виділення чистої культури з окремої колонії (метод послідовних розведень; метод Коха (метод пластинчастих розведень); метод Дригальского – метод штрихових посівів). Виділення чистої культури з однієї клітини (краплинний метод Лінднера; за допомогою мікроманіпулятора; за допомогою мікроселектора Перфільєва). Методи кількісного обліку мікроорганізмів: підрахунок клітин мікроорганізмів під мікроскопом (у лічильних камерах; на мембранних фільтрах). Визначення числа клітин мікроорганізмів висівом на поживні середовища: визначення кількості клітин висівом на щільні поживні середовища (чашковий метод Коха).

3.Практична частина – записати у лабораторному зошиті результати досліду з виділення чистої культури: родові і видові назви мікроорганізмів; записати послідовність операцій, необхідних для здійснення кількісного обліку клітин у камері Горяєва; обрахувати кількість клітин у 1 мл вихідної суспензії за формулою 1.3.

Увисновку до роботи необхідно зазначити яким методом було виділено чисту культуру дріжджів та за якими ознаками ідентифіковано її родову і видову приналежність. Також необхідно зазначити переваги та недоліки підрахунку клітин у лічильній камері Горяєва та навести одержані результати підрахунку.

Контрольні запитання

1.Дайте визначення поняття «накопичувальна культура» мікроорганізмів.

2.Дайте визначення поняття «чиста культура» мікроорганізмів.

98

3.Які методи одержання чистих культур мікроорганізмів існують?

4.Охарактеризуйте прямі і непрямі методи кількісного обліку мікроорганізмів.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 12

Вивчення ферментативної активності клітин

Мета роботи: ознайомитись з особливостями будови та функціонування ферментів як біологічних каталізаторів; опанувати методи визначення та аналізу ферментативних активностей клітин.

Матеріали та обладнання: крапельниці з дистильованою водою; водяна баня; скальпелі; свіжий 3%-й розчин пероксиду водню, Крім того на кожну бригаду: 7 чистих сухих пробірок, пінцет, тканини рослин (2 шматочки сирої та 1 шматочок вареної картоплі) та тварин (2 шматочки сирого та 1 шматочок вареного м`яса чи риби), пісок, ступка, товкачик.

Загальні відомості

12.1. Ферменти – біологічні каталізатори

Ферменти – це біологічні каталізатори. Всі ферменти – білки, синтезовані живими клітинами. За участі ферментів прискорюються у тисячі разів численні біохімічні реакції.

Ферменти мають такі властивості:

∙всі вони глобулярні білки;

∙прискорюють реакцію, але самі у цій реакції не витрачаються;

∙досить мала кількість ферменту викликає перетворення великої кількості субстрату;

∙активність ферменту залежить від рН середовища, температури, тиску, від концентрації субстрату та самого ферменту;

∙дія ферментів вибіркова, тобто один фермент майже завжди каталізує тільки одну реакцію.

Ферменти, діючи як каталізатори, зменшують енергію активації, необхідну для початку реакції.

Речовина, перетворення якої каталізує фермент, має назву субстрат. Кожному ферменту відповідає свій власний субстрат. З’єднуючись з субстратом, фермент утворює фермент-субстратний (ензим-субстратний) комплекс (ES), імовірність перебігу реакції у якому значно зростає. Після закінчення реакції фермент вивільняється і знову може вступати у реакцію:

S + Е ↔ ES ↔ EP ↔ E + P,

де S – субстрат; Е – фермент; ЕS – фермент-субстратний комплекс; ЕР – комплекс фермент-продукт; Р – продукт (продукти).

Швидкість ферментативної реакції – кількість перетвореного субстрату або кількість продукту, утвореного за одиницю часу.

99

У більшості випадків цілісний фермент (холофермент) складається з білкової частини (апофермента) і небілкового компонента (кофактора). Якщо кофактор міцно пов'язаний з апоферментом, то він називається простетичною групою. Якщо ж зв'язок слабкий, то кофактор називається коензим, або

кофермент.

Всі ферменти несуть активний центр – певну ділянку, що і є власно каталізатором. У ряді випадків конформація (третинна структура) поліпептиду така, що активний центр «закритий» і не розпізнає свій субстрат. У таких ферментів є алостеричний центр, здатний взаємодіяти з певними речовинами –

алостеричними ефекторами.

Ефектори діляться на інгібітори й активатори. Взаємодія алостеричного центру з інгібіторами змінює конформацію поліпептиду так, що активний центр «закривається». Взаємодія алостеричного центру з активаторами, навпаки, «відкриває» активний центр.

Алостеричні ефектори можуть з'являтися в клітинах у результаті хімічних, фотохімічних і термохімічних реакцій. Часто інгібітором служить продукт реакції, яка каталізується даним ферментом (у цьому випадку спостерігається негативний зворотний зв'язок).

12.2. Вплив факторів на активність ферментів

Активність ферменту змінюється залежно від рН, температури, а також від концентрацій як ферменту, так і самого субстрату.

Вплив температури на активність ферментів. З підвищенням температури прискорюється рух молекул, внаслідок чого у молекул субстрату і ферменту є більше шансів на зіткнення і перебіг реакції. Температура, що забезпечує максимальну активність ферменту, має назву оптимальної температури ферментативної реакції (tоopt). Якщо, температура вище за tоopt, швидкість реакції знижується, оскільки відбувається руйнування вторинної і третинної структур білків, тобто інактивація ферменту.

Вплив рН на активність ферментів. При постійній температурі ферментативні реакції проходять найефективніше у вузьких межах рН. Оптимальне значення рН ферментативної реакції – те значення рН, при якому реакція відбувається з максимальною швидкістю. Зі зниженням рН збільшується концентрація іонів водню у середовищі, що веде до руйнування іонних зв’язків, що беруть участь у підтриманні просторової структури молекули ферменту. При різких змінах рН молекула ферменту може денатуруватися.

Вплив концентрації ферменту на швидкість ферментативної реакції. За високої концентрації субстрату та сталих інших факторів (рН, tо) швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту. Ферментативні реакції відбуваються за умови, коли концентрація ферменту набагато нижча за концентрацію субстрату і тому з підвищенням концентрації ферменту швидкість реакції також зростає.

100