Praktikum_biology_1_kurs

Вплив концентрації субстрату на швидкість ферментативної реакції. Для певної концентрації ферменту швидкість реакції збільшується зі збільшенням концентрації субстрату, оскільки збільшується вірогідність контакту між ними. Але настає момент, коли збільшення концентрації субстрату вже не веде до збільшення швидкості реакції, оскільки всі активні центри ферменту зайняті.

Завдання на виконанння

1.Порівняти активність дії ферментів перокисдазно-каталазного комплексу в живих та мертвих клітинах тканин рослин та тварин. Для проведення досліду пронумерувати пробірки від №1 до №7.

В пробірку №1 внести трохи піску.

Подрібнити в ступці шматочок сирої картоплі з піском. Перенести подрібнену суміш до пробірки №2.

Подрібнити в ступці шматочок сирого м`яса з піском. Перенести подрібнену суміш до пробірки №3.

Внести в пробірку №4 – шматочок сирої картоплі , в пробірку №5 – шматочок вареної картоплі, в пробірку №6 – шматочок сирого м`яса, в пробірку №7 – шматочок вареного м`яса.

Додати в кожну пробірку по декілька крапель 3%-го розчину пероксиду водню.

Провести спостереження за тим, що буде відбуватися в кожній з пробірок.

2.Розпочати роботу із дослідження фаз мітозу в рослинних клітинах (див. лаб. роботу №13).

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 12, у якому повинно бути відображено:

1. Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2. Теоретичні відомості: поняття про фермент та ферментативну реакцію; властивості ферментів; вплив факторів на активність ферментів.

3. Практична частина – порівняти ферментативну активність рослинної та тваринної тканин за різного оброблення; результати порівняння за системою: «–» активність не спостерігається; «+» - активність слабка; «++» - активність помірна; «+++» - активність висока занести до таблиці:

	Рослинна тканина			Тваринна тканина
	Без	Після обробки		Без	Після обробки
	обробки	термічної	механічної	обробки	термічної	механічної
Активність
фермента

У висновку до роботи необхідно пояснити причини явищ, які спостерігались: з чим пов’язано збільшення або зменшення ферментативної активності клітин за умови різної обробки; як це пов’язано з властивостями ферментів.

101

Контрольні запитання

1.Що таке фермент?

2.Якими властивостями характеризуються ферменти?

3.Як відбувається ферментативна реакція?

4.Які фактори впливають на перебіг ферментативних реакцій?

5.Що таке швидкість ферментативної реакції?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 13

Мітоз у клітинах рослин

Мета роботи: ознайомитись з явищем мітозу, його стадіями та біологічним значенням; опанувати методи дослідження фаз мітозу на прикладі клітин апікальної меристеми коренів рослин.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; крапельниці з дистильованою водою; спиртівки, фільтрувальний папір; набір барвників, пророщені зубчики часнику (з корінцями), голки, пробірки з водою, скальпелі, пінцети, дві чашки Петрі, водяна баня на 60°С, 6%-вий розчин оцтової кислоти, 1М розчин соляної кислоти (31 мл концентрованої HCl розчинити у воді; об′єм довести до 1л), реактив Фьольгена (0,5 г фуксину й 5 г сульфіту натрію на 100 мл води); крім того на кожну бригаду з двох студентів – 1 пробірка, 1 шпилька (скрепка), 1 суха чашка Петрі, 2 маленькі пробірки з гумовими пробками; на кожну академічну групу студентів – штатив для пробірок (на 12 шт); навчальний відеофільм «Стадії мітозу».

Загальні відомості

13.1. Мітоз як основна форма розмноження клітин

Здатність до самовідтворення є найважливішою властивістю живого. Живі організми будуються з частин (органів), проте самі ці частини складаються з відносно простих клітин. Середній час життя клітини невеликий, проте коли клітина зношується і вмирає, на її місце автоматично постає інша. Заміна відмерлих клітин відбувається за рахунок резерву клітин, утворених при поділі клітин шляхом мітозу. Мітоз протікає в тваринних і рослинних клітинах майже однаково, але є і ряд розходженнь (табл. 5).

Швидкість мітотичного поділу клітин у різних організмів і в різних тканинах сильно різниться – найбільша у бактерій і у зародків багатоклітинних організмів, найменша у високодиференційованих тканинах. Дуже швидко можуть ділитися ізольовані рослинні і тваринні клітини при зростанні на поживних середовищах в умовах, оптимальних для поділу і за наявності у середовищі специфічних стимуляторів.

102

		Таблиця 5
	Особливості мітозу у рослин і у тварин
№	Рослинна клітина	Тваринна клітина
пор.
1	Центріолей немає	Центріолі є
2	Зірки поділу не утворюються	Зірки поділу утворюються
3	Утворюється клітинна пластинка	Не утворюється клітинна пластинка
4	За цитокінезу не утворюється	За цитокінезу утворюється борозна
	борозна (перетяжка)
5	Мітози відбуваються, головним	Мітози відбуваються в різних
	чином, у меристемах	тканинах і ділянках організму

Події, що відбуваються в ядрі під час мітозу, зазвичай спостерігають на фіксованих і пофарбованих клітинах. Такі препарати дозволяють побачити фази, через які проходять хромосоми при клітинному поділі, але не виявляють їх послідовність (рис. 84).

Рис. 84. Фігури мітозу в клітинах кореня цибулі: 1 – інтерфаза; 2, 3 – профаза; 4 – метафаза; 5 – ахроматинове веретено (веретено поділу); 6 – анафаза; 7 – телофаза

103

13.2.Біологічне значення процесу мітозу

Урезультаті мітозу утворюються два ядра, кожне я яких містить стільки ж хромосом, скільки їх було в батьківському ядрі. Ці хромосоми походять від батьківських хромосом шляхом точної реплікації ДНК, тому гени їх містять абсолютно однакову спадкову інформацію. Дочірня клітина генетично ідентична батьківській клітині, отже ніяких змін в генетичну інформацію мітоз внести не може. Тому клітинні популяції (клони), що походять від батьківських клітин, володіють генетичною стабільністю.

В результаті мітозів кількість клітин в організмі збільшується (процес, відомий під назвою гіперплазії), що являє собою один з головних механізмів зростання.

Регенерація і заміщення клітин. Багато видів тварин і рослин розмножуються нестатевимшляхом за допомогою одного лише мітотичного поділу клітин. Крім того, мітоз забезпечує регенерацію втрачених частин (наприклад, ніг у ракоподібних) і заміщення клітин, відбуваючись в тій чи іншій мірі у всіх багатоклітинних організмах.

Завдання на виконання

І. Переглянути навчальний відеофільм.

ІІ. Фази мітозу можна спостерігати в апікальній меристемі кінчиків кореня часнику (2n = 16), цибулі (2n = 16) і кінських бобів (2n = 12).

Для цього треба провести наступні операції:

1 (Виконати на попередньому лабораторному занятті!!!) Проткніть зубчик часнику шпилькою (скрепкою) й підвісьте його вгорі пробірки з водою так, щоб основа зубчика перебувала у воді. Залишіть на 3...4 дні в спокої, тому що будь-який сторонній вплив може тимчасово пригнітити клітинний поділ.

2 (Виконати за 1 добу до лабораторного заняття!!!) Після утворення декількох корінців довжиною 1...2 см відріжте від них кінцеві ділянки довжиною 1 см.

3 Помістіть відрізані ділянки корінців у невелику пробірку з 6%-вою оцтовою кислотою, заткніть її пробкою й залишіть на ніч при кімнатній температурі для фіксації.

4 Взявши корінці пінцетом за верхній кінець, перенесіть їх у чашку Петрі з дистильованою водою й відмивайте протягом декількох хвилин для видалення фіксатора.

5 Перенесіть кінчики корінців у пробірку, що містить 1М HCl, і витримайте 3 хв при 60 °С (для корінців цибулі, горошку або бобів – 6...10 хв). При цьому серединні пластинки, що утримують клітини разом, руйнуються, а ДНК хромосом гідролізується з утворенням альдегідних форм дезоксирибози, здатних взаємодіяти з барвником (реактивом Фьольгена).

6 Кислоту разом з кінчиками корінців влийте в чашку Петрі. Перенесіть корінці в іншу чашку Петрі, що містить дистильовану воду, і відмийте кислоту. Залишіть на 5 хв.

104

7 Перенесіть корінці в маленьку пробірку з реактивом Фьольгена (0,5 г фуксину й 5 г сульфіту натрію на 100 мл води) і заткніть її пробкою. Поставте в прохолодне темне місце (краще в холодильник) мінімум на 2 год.

8 Вийміть пінцетом один кінчик і помістіть його в чашку Петрі з 6%- вою оцтовою кислотою.

9 Відріжте скальпелем кінцеву ділянку довжиною 1...2 мм інше відкиньте.

10 На чисте предметне скло нанесіть скляною паличкою краплю 6%- вої оцтової кислоти й помістіть в неї кінчик корінця.

11 Двома препаровальними голками розтріпайте кінчик корінця й накрийте покривним склом.

Помістіть препарат на плоску поверхню, накрийте декількома листками фільтрувального паперу й сильно натисніть через нього на покривне скло подушечкою великого пальця. Не допускайте зсуву покривного скла в боки.

12 Вивчіть препарат під мікроскопом за збільшення 8×; 40×. Знайдіть клітини, що перебувають на різних стадіях мітозу.

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 13, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: поняття про мітоз як основний спосіб розмноження еукаріотичних клітин, фази мітозу, біологічне значення мітозу.

3.Практична частина – виконати рисунки одержаних мікроскопічних препаратів у лабораторному зошиті, супроводити їх поясненнями.

У висновку до роботи необхідно зазначити, які ознаки ядер клітин спостерігаються на різних стадіях мітозу і які фази мітотичного поділу спостерігались у мікропрепараті.

Контрольні запитання

1.Охарактеризуйте стадії процесу мітозу.

2.Опишіть особливості структури мітотичних хромосом.

3.Які методи фарбування генетичного матеріалу клітин відомі?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 14

Вивчення впливу абіотичних та біотичних факторів середовища на живі клітини

Мета роботи: ознайомитись із характером впливу абіотичних та біотичних факторів середовища на живі клітини, опанувати методи визначення термостійкості, кислотостійкості, холодостійкості мікроорганазмів, а також методи дослідження типів біотичних взаємовідносин між організмами.

105

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; крапельниці з дистильованою водою; спиртівки, водяна баня; скальпелі; тестові культури спороутворювальних та аспорогенних бактерій, симбіотично існуючі асоціації живих організмів (корені бобових рослин з бульбочками, кефірний грибок, чайний грибок, лишайник). Крім того на кожну бригаду: набір пробірок

зМПБ з різним значенням рН середовища (рН=3, рН=7, рН=10), 4 чашки Петрі

зМПА, 8%-й розчин KNO3.

Загальні відомості

Компоненти природного середовища, які впливають на стан і властивості організму, популяції, природного угруповання мають назву екологічних факторів. За своєю природою вони можуть бути абіотичними, біотичними та антропогенними.

Абіотичні – усі компоненти неживої природи, серед яких найважливішими є температура, вологість, світло та інші компоненти клімату, а також водного, повітряного та ґрунтового середовища.

Біотичні – взаємодія між особинами в популяціях, між популяціями в природних угрупованнях, що існують поруч на якійсь ділянці і впливають один на одного безпосередньо, через продукти метаболізму або більш швидке використання поживних речовин.

14.1.Вплив абіотичних факторів середовища на живі клітини

14.1.1.Температура. Під час вивчення впливу температури на ріст мікроорганізмів виділяють температурний діапазон, обмежений мінімальною і максимальною температурами, за яких ріст припиняється, а також ділянку оптимальних температур з максимальною швидкістю росту. На підставі цих показників мікроорганізми ділять на три основні групи: мезофіли, психрофіли і термофіли.

До психрофілів (від грецьк. ψυχρός — холод, φιλέω — люблю) відносять холодолюбні мікроорганізми, зокрема деякі ґрунтові і морські бактерії, а також хвороботворні для риб і водних рослин мікроорганізми. Температура росту

психрофілів лежить в межах від –10°С до +20°С і вище. У свою чергу психрофіли поділяться на облігатні і факультативні

Багато з психрофілів добре розмножуються за температур, сприятливих для мезофілів, однак можуть рости, хоча і повільно, при 0°С й нижче, тому їх називають факультативними психрофілами. Інші мікроорганізми пристосувалися до існування за досить низьких температур (близько 0°С і нижче), а за температури 25°С і вище вони гинуть. Подібні мікроорганізми належать до облігатних психрофілів.

Для мезофілів (mesos – середній; φιλέω — люблю) – оптимальна температура становить 30...45 °С. До цієї групи належить більшість мікроорганізмів, у тому числі патогенних для людини і тварин. Типовим

106

мезофілом є кишкова паличка Е. соli: нижній рівень температури росту є +10°С, а верхній – +49°С, оптимальною є температура +37 °С.

Термофіли (від др.-грецьк. θέρμη – тепло и φιλέω – люблю) – теплолюбні мікроорганізми, розвиваються за температур вище +55°С, температурний мінімум для них +30°С. Термофільні мікроорганізми, у свою чергу, теж поділяються на облігатні, факультативні та екстремально термофільні.

Факультативні термофіли мають максимальну температуру росту від 50 до 65°С, але здатні також до розмноження за кімнатної температури (20°С) Особливістю цієї групи мікроорганізмів є здатність рости за температури в межах від 20 до 40 °С.

Для екстремальних термофілів характерна оптимальна температура росту 80...105°С, але рости вони можуть в межах від 60°С до 110°С До екстремальних термофілів належать організми з групи архебактерій що не мають аналогів серед мезофілів, наприклад представники родів Thermoproteus, Pyrococcus,

Pyrodictium та ін.

Мікроорганізми по-різному ставляться до граничних температур. Якщо низькі температури мікробні клітини переносять, після розморожування зберігаючи здатність до росту, то під впливом високих температур вони досить швидко гинуть. Високі температури (60°С і вище) викликають коагуляцію білків та інактивацію ферментів.

Як правило, за 60...70 °С гинуть вегетативні клітини. Нагрівання до 100...120 °С використовують у мікробіології для повного знищення як вегетативних форм мікроорганізмів, так і їх спор. Це найбільш зручний і надійний спосіб стерилізації.

14.1.2. Осмотичний тиск. Важливе значення для життя мікроорганізмів має осмотичний тиск, величина якого визначається концентрацією розчинених речовин у середовищі. Якщо вона мала, розчин називають гіпотонічним. Розчин з високою концентрацією солей, тобто з великим осмотичним тиском,

називають гіпертонічним.

Цитоплазматична мембрана клітини регулює проникнення в клітину і вихід із неї води і розчинених речовин, зберігаючи при цьому осмотичну рівновагу. Надходження води з довкілля у клітину можливе лише в тому випадку, коли осмотичний тиск в клітині буде більшим, ніж тиск зовнішнього розчину. В умовах високого осмотичного тиску в середовищі клітина втрачає здатність поглинати з нього воду, що згубно діє на неї. Нормальний осмотичний тиск у клітині визначається в межах від 3 до 7 атм.

У розчинах з осмотичним тиском, більш високим, ніж усередині мікробних клітин, останні гинуть. Це зумовлюється тим, що вода виходить із клітин назовні, клітини зневоднюються і їх протопласт стискується. Це явище має назву плазмоліз (рис. 86).

107

Рис. 86. Схема плазмолізу: 1 – клітина з шаром протоплазми біля стінки й центральною вакуолею; 2 – початок плазмолізу, розміри клітини трохи зменшуються; 3 – вакуоля помітно скорочується, протоплазма відходить від клітинної оболонки в її кутах; 4 – протопласт набуває сферичного обрису.

У середовищі з дуже низьким осмотичним тиском відбувається протилежне явище – плазмоптиз, коли вода надходить усередину клітини, викликаючи розрив клітинної оболонки.

Високий осмотичний тиск середовища не перешкоджає росту лише деяких мікроорганізмів, що називаються осмофільними (від грецьк. osmos – тиск, phileo

– люблю). До них належать багато пліснявих грибів родів Aspergillus і Penicillium, а також деякі види дріжджів, здатних розвиватися за високої концентрації цукру, але не витримують високої концентрації солей. Мікроорганізми, які витримують високий осмотичний тиск, але краще розвиваються за нормального тиску, називаються осмотолерантними.

14.1.3.Вологість середовища. Активна життєдіяльність мікроорганізмів можлива лише в умовах достатнього зволоження. Надходження поживних речовин у клітину та виділення продуктів обміну в зовнішнє середовище можливі тільки за достатнього вмісту води. В умовах її дефіциту мікроорганізми не розмножуються. Найменша кількість води, за якої ще можливий розвиток мікроорганізмів, становить 20...30 % загальної маси організму. Найстійкіші до зневоднювання – актиноміцети і гриби. Вони можуть розвиватися навіть тоді, коли вміст вологи в субстраті дорівнює 10...15 %. Їх здатність витримувати дефіцит вологи має велике значення для підтримання безперервності кругообігу речовин у природі.

14.1.4.Кислотність середовища (рН). Ступінь кислотності або лужності середовища суттєво впливає на життя мікроорганізмів. Фізіологічно діючою

основою в кислих і лужних субстратах є концентрація гідроксильних і водневих іонів (ОН- і Н+). Залежно від відношення до кислотності середовища мікроорганізми можуть бути розділені на декілька груп. Оптимальне значення рН для росту переважної більшості, які називають нейтрофілами – діапазон рН, близький до нейтрального, а ріст можливий, як правило, від рН 4 до рН 9.

Типовими нейтрофілами є різні штами Escherichia coli, Bacillus megaterium. У

108

Рис.85. Бульбочкові бактерії: А – палички; Б - бактероїди

деяких видів мікроорганізмів оптимальне значення рН може бути в кислому (рН 4 і нижче) або лужному (рН від 9 і вище) діапазоні. Такі прокаріоти називають ацидофільними або алкалофільними (базофільними), відповідно.

Серед цих груп виділяють облігатні форми, що втратили здатність рости в нейтральному діапазоні рН, і факультативні, такі, що зберегли цю здатність. Типовими представниками облігатних ацидофілів є бактерії роду Thiobacillus. До облігатних алкалофілів можна віднести деяких представників роду Bacillus.

У всіх відомих ацидофілів значення внутріклітинного рН підтримується близько 6,5, у нейтрофілів – 7,5, у алкалофілів – не вище 9,5.

14.2. Вплив біотичних факторів середовища на живі клітини

У довкіллі мікроорганізми існують як складні асоціації. У процесі еволюції кожна група мікроорганізмів виробила різні механізми адаптації не лише до умов неживого середовища, але й до всіх її мешканців. Це призвело до заселення мікробами найрізноманітніших екологічних ніш. Взаємовідносини між учасниками асоціацій дуже складні й динамічні у зв’язку з постійними змінами екологічних умов та фізіологічною мінливістю самих мікроорганізмів.

Умовно всі взаємовідносини між мікроорганізмами для зручності поділили на дві категорії – сприятливі (взаємодопомоги) та несприятливі (антагоністичні). В кожній категорії виділяють певні групи.

14.2.1.Сприятливі біотичні взаємовідносини. Характеризуються взаємною для різних організмів вигодою від спільного існування.

Симбіоз – форма співіснування мікроорганізмів, коли обидва симбіонти отримують користь від цього співіснування і не можуть існувати один без одного. Наприклад, співіснування гриба аскоміцета з одним із видів водоростей або ціанобактерій. В результаті цієї асоціації утворюється новий організм – лишайник.

Мутуалізм або кооперація – співіснування, коли обидва організми отримують користь, але їх зв’язок менш тісний і вони можуть існувати один без одного. Наприклад, бульбочкові бактерії та бобові рослини (рис. 85), отримують користь один від одного, але можуть рости окремо.

Синтрофія – явище сумісного росту двох або більше видів мікроорганізмів на середовищі, яке є незасвоюваним для кожного виду окремо. Наприклад, симбіоз в асоціації молочнокислих бактерій здійснюється завдяки тому, що кожен з співіснуючих видів синтезує та виділяє у

середовище речовини необхідні іншому виду.

Сателітизм – різновид синтрофії, коли стимуляція має однобічний вплив. Наприклад, навколо колонії мікроорганізмів, які продукують вітамін В12,

109

розмножуються мікроорганізми, які не можуть продукувати цей вітамін, але потребують його для свого розвитку.

Метабіоз – ланцюгові взаємовідносини, коли один вид мікроорганізмів забезпечує умови для розвитку іншого виду. Наприклад, клітковину розщеплюють гриби, актиноміцети і деякі бактерії, в результаті чого утворюється дисахарид целобіоза, який розщеплюють інші мікроорганізми до глюкози, а глюкоза – це універсальне джерело енергії для багатьох мікроорганізмів.

Синергізм – така форма співіснування, коли у асоціантів підсилюються фізіологічні функції і виникають нові властивості. Наприклад, оцтовокислі бактерії та дріжджі (“чайний гриб”), дріжджі і молочнокислі бактерії («кефірний грибок»). Оцтовокислі бактерії перетворюють сахарозу на глюкозу та фруктозу, які окислюються до глюконової та кетаглюконової кислот. Ці кислоти використовують дріжджі. Дріжджі синтезують вітаміни, які потрібні оцтовокислим бактеріям.

14.2.2. Несприятливі (антагоністичні) біотичні взаємовідносини.

Проявляються у пригнічувальному впливі одного або декількох членів мікробної спільноти один на одного.

Пасивний або конкурентний антагонізм зумовлений використанням різними мікроорганізмами однакових поживних речовин. В цьому змаганні перевага за швидкоростучими формами мікроорганізмів.

Активний антагонізм зумовлений виділенням специфічних речовин. Такими речовинами можуть бути неспецифічні продукти обміну (органічні кислоти, спирти, аміак, феноли, перекис водню та інші). Залежно від ефекту дії розрізняють антагонізм мікробоцидний, мікробостатичний та лізуючий. За направленістю антагонізм може бути однобічним та двобічним. Антагонізм може бути між мікроорганізмами – представниками різних родів та видів. Також може бути антагонізм між різними штамами одного виду. Наприклад, один із штамів кишкової палички синтезує коліцини, які пригнічують інші штами цього виду. Нерідко спостерігається явище самопригнічення – ізоантагонізм. Це явище особливо проявляється у актиноміцетів. Літичний фактор актиноміцетів включає складний комплекс, що складається з ряду ферментів – протеїназ, пептидаз, амілаз, лізоциму та антибіотику(ів).

Найбільш різко виражені антагоністичні взаємовідносини проявляються у формі паразитизму або хижацтва. І хижаки й паразити задовольняють свої харчові потреби за рахунок жертви. Різниця між ними у тому, що хижаки вбивають свою жертву миттєво, а паразити повільно. Паразит повністю або частково перекладає регуляцію своїх взаємовідносин з навколишнім середовищем на організм хазяїна. Паразитизм може бути постіним або тимчасовим; зовнішнім (екто-) та внутрішнім (ендо-). Наприклад, бактеріофаги втратили здатність до сапрофітного розвитку, їх вирощують лише на культурі тканини, а мікроміцети-хижаки здатні живитися за рахунок клітини мікроміцета-жертви.

110