Praktikum_biology_1_kurs

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 9

Вивчення мікроорганізмів, які належать до різних систематичних груп (І підсумкове заняття)

Мета: систематизувати одержані знання щодо морфології, культуральних ознак та практичного значення мікроорганізмів та перевірити рівень опанування технікою мікроскопічних досліджень.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; крапельниці з дистильованою водою; фільтрувальний папір; набір барвників, контрольні препарати мікроорганізмів.

Загальні відомості

9.1. Методи ідентифікації мікроорганізмів

Провести ідентифікацію мікроорганізмів – означає визначити їх приналежність до певної систематичної категорії. Про повну ідентифікацію мова йде тоді, коли визначені родова і видова приналежність. Для визначення виду мікроорганізмів ураховують культуральні, морфологічні, фізіологобіохімічні ознаки та їх генотип.

9.1.1. Культуральні ознаки. Характер росту культури на рідких середовищах або колоній на щільних середовищах (МПА, сусло-агар, агаризоване синтетичне середовище) – важливі систематичні ознаки мікроорганізмів. У першому випадку відзначають: характер розвитку плівки (тонка, суха, складчаста, слизувата) і її колір; наявність каламуті (слабка, помірна, сильна); присутність, характер осаду (рясний, щільний, пластівчастий) і його колір.

Культуральні ознаки на щільних середовищах у чашках Петрі наступні: форма колонії, профіль колоній, край колонії (гладкий, хвилястий, зубчастий, лопатевий, війчастий, ворсистий, гіллястий); її поверхня (гладка, шорсткувата, складчаста, горбиста); розміри (діаметром 10 мм і більше – велика, від 1 до 10 – середньої величини, не перевищує 1 мм – крапкова); оптичні властивості (прозора, просвітчаста, непрозора, блискуча, матова, флуоресціююча); колір (грязно-білий, білий, жовтий, жовтогарячий, бузковий, синій, червоний, чорний і т.д.); структура колонії (однорідна, дрібноабо грубозерниста, плівчаста, така, що вростає в агар-агар, така, що легко знімається голкою з агар-агару); консистенція (масляниста, тістоподібна, слизувата, суха, щільна, така, що вростає в агар).

При посіві уколом, коли голку з культурою вводять у стовпчик агар-агару, відзначають інтенсивність росту у верхній, середній або нижній частині уколу.

При вивченні культуральных ознак актиноміцетів та мікроміцетів звертають особливу увагу на пігмент і обумовлене їм забарвлення повітряного міцелію й середовища. Зазвичай користуються спеціальними посібниками (шкала кольорів Бондарцева та інші для визначення кольору). Значення мають консистенція колонії (щільна, шкіряста, вросша в агар, пухка), міцеліальний

71

ободок, поверхня колонії (борошниста, бархатиста) і її запах (землистий, ефірний, фруктовий і т.д. ).

9.1.2.Морфологічні ознаки. При визначенні виду мікроорганізмів ураховують такі морфологічні ознаки, як форму клітин (для бактерій: кулясті, палочкоподібні й звивисті). У паличкоподібних відзначають форму кінців клітин (вони можуть бути ввігнуті, закруглені або усічені).

Клітини можуть бути одиночні, з'єднані попарно, у ланцюжки або у вигляді пакетів.

Морфологічними ознаками мікроорганізмів служать: розміри клітин у мікрометрах (поперечний переріз, довжина палички, діаметр кулястих форм); здатність до спороутворення й розташування в клітинах спор (термінальне, субтермінальне, центральне); наявність капсул і клітинні включення; здатність до руху й тип джгутикування (один джгутик – монотрих, пучок джгутиків на одному кінці – лофотрих, по всій поверхні клітини – перітрих). Частіше джгутики бувають у паличкоподібних бактерій, рідше – у коків, корінеподібних бактерій, в одиничних випадках – в актиноміцетів. Важлива морфологічна ознака – тинкторіальні властивості (відношення до фарбування) – забарвлення за Грамом й кислотостійкість.

До морфологічних ознак актиноміцетів відносять тенденцію цих мікроорганізмів до утворення гіф, що гілкуються, у деяких родин розвивається

йміцелій. Гіфи можуть бути дуже короткими або добре розвиненими, діаметр їх варіює в межах 0,5...2 мкм, зазвичай менш 1 мкм. Гіфи можна спостерігати не завжди, тому що в окремих родинах вони легко фрагментуються. Іноді фрагментація гіф веде до утворення кокоподібних, видовжених, або дифтероїдних елементів.

Для деяких родин актиноміцетів характерне формування справжніх спор на повітряних або субстратних гіфах. Спори можуть розташовуватися поодиноко на гіфі, парами або ланцюжками з різного числа клітин. За великого числа спори складаються в ланцюжки: прямі, у вигляді петлі або спіральні. Такі ланцюжки можуть виникнути на гіфі по одному або у вигляді мутовок. У межах однієї родини спори в спорангії окремих видів мікроорганізмів бувають рухливими або нерухомими залежно від роду.

9.1.3.Фізіолого-біохімічні ознаки. Для ідентифікації мікроорганізмів досліджують: відношення їх до джерел вуглецю й азоту; продукти життєдіяльності, що накопичуються в середовищі (кислоти, спирти, гази); відношення до кисню, лугів та інших факторів зовнішнього середовища.

Серед біохімічних властивостей культури особливо важливе визначення її ферментативної активності (перш за все амілолітичної та протеолітичної); відношення до антибіотиків та лізоциму.

9.1.4.Молекулярно-генетичні ознаки. Принципово новим підходом до ідентифікації мікроорганізмів є визначення генетичної подібності (або відмінності) мікроорганізмів. При цьому генетичними ознаками, які дозволяють віднести мікроорганізм до певної систематичної групи є вміст гуаніну та цитозину (ГЦ) у молекулі ДНК, ступінь гібридизації молекул ДНК-ДНК та ДНК-РНК, а також нуклеоотидна послідовність генів. Для ідентифікації

72

прокаріотів аналізують послідовність 16S р-РНК. Ген рРНК малої субодиниці рибосоми важливий для оцінки еволюційних відносин між бактеріями, оскільки він еволюціонує повільно і його продукт життєво важливий і функціонально консервативний. Для ідентифікації еукаріотів аналізують послідовність 18S р- РНК.

Принципи класифікації та ідентифікації різних груп прокаріотів та еукаріотних мікроорганізмів мають істотні розходження. Ідентифікація грибів до класів, порядків і родин заснована на характерних рисах будови й способах утворення в першу чергу статевих структур. Крім того, використовується характеристика безстатевого спороносіння, будова й ступінь розвитку міцелію (зародковий, добре розвинутий, септований або несептований), культуральні (колонія) і фізіологічні ознаки. Диференціація родів усередині родин і ідентифікація видів проводяться із застосуванням морфологічних ознак, одержаних з використанням електронної мікроскопії, а також фізіологічних і культуральных особливостей. Єдиного визначника для ідентифікації всіх грибів не існує, тому спочатку визначають клас або порядок гриба, який піддається ідентифікації, й далі користуються відповідним визначником для цього класу або порядку.

9.2.Основні систематичні категорії мікроорганізмів.

∙Домен (лат. – regio, англ. – domain) – таксономічна категорія найвищого рангу, що включає декілька царств;

∙Царство (regnum) – група споріднених відділів, чи типів;

∙Відділ (division) – група споріднених класів;

∙Клас (classis) – група споріднених порядків;

∙Порядок (ordo);

∙Родина (familia) – група споріднених родів;

∙Рід (genus) – група споріднених видів;

∙Вид (species) – група особин, ідентичних до особини-еталону за діагностичними ознаками.

Завдання на виконання

1. Розглянути контрольний мікробний препарат при збільшенні 40×. Користуючись зробленими рисунками та складеними таблицями ознак мікроорганізмів, вказати родову і видову назву мікроорганізму з контрольного зразка.

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 9, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Порядок ідентифікації мікроорганізмів. Сучасні підходи до ідентифікації мікроорганізмів. Основні систематичні категорії мікроорганізмів.

3.Практична частина (рисунок) – зобразити у лабораторному зошиті морфологічні ознаки мікроорганізмів контрольного препарату.

73

У висновку до роботи необхідно відзначити критерії, на яких була заснована ідентифікація мікроорганізмів з контрольного препарату.

Контрольні запитання

1.За якими ознаками проводиться ідентифікації мікроорганізмів?

2.Опишіть сучасні методи ідентифікації мікроорганізмів.

3.Охарактеризуйте основні систематичні категорії мікроорганізмів.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 10

Поживні середовища та культивування мікроорганізмів. Посів та пересів мікроорганізмів

Мета роботи: ознайомитись з основними принципами і правилами складання поживних середовищ для культивування мікроорганізмів, класифікацією поживних середовищ, принципами і методами стерилізації; опанувати методи посіву і пересіву мікроорганізмів на рідкі та щільні середовища, опанувати навички й правила підготовки посуду й матеріалів до стерилізації.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; крапельниці з дистильованою водою; фільтрувальний папір; набір барвників, мікробіологічні петлі; спиртівки; культури дріжджів, пробірки з рідким середовищем, пробірки з щільним середовищем (стовпчики), чашки Петрі з сусло-агаром, посуд (піпетки, пробірки, чашки Петрі) для підготовки до стерилізації.

Загальні відомості

10.1. Принципи складання поживних середовищ для культивування мікроорганізмів

Для свого росту й розвитку мікроорганізми потребують необхідних поживних субстратів. У природних умовах усі необхідні поживні речовини вони отримують із довкілля (ґрунтового розчину, води). В лабораторних умовах харчові потреби мікроорганізмів забезпечуються за рахунок поживних середовищ, які повинні містити макроелементи (C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe),

мікроелементи (Zn, Mn, B, Cu, Mo та ін.) за необхідності – фактори росту

(деякі амінокислоти, вітаміни, жирні кислоти, нуклеотиди).

Різні групи мікроорганізмів відрізняються між собою за потребою в хімічних елементах та можливостях їх використання.

Залежно від того, яке джерело енергії можуть використовувати прокаріоти, їх поділяють на фототрофів (джерело енергії – світло) і хемотрофів (джерело енергії – окисно-відновні реакції). Організми, для яких джерелом (донором) електронів в енергетичному процесі є неорганічні речовини, запропоновано називати літотрофами, а ті, у яких донорами електронів виступають органічні речовини – органотрофами. Тоді, залежно від джерела енергії й природи

74

донора електронів, можливі чотири типи енергетичного метаболізму: хемолітотрофія, хемоорганотрофія, фотолітотрофія, фотоорганотрофія.

У конструктивному метаболізмі головна роль належить вуглецю, оскільки всі сполуки, з яких побудовані живі організми – це вуглецеві сполуки. Залежно від джерела вуглецю, для конструктивного метаболізму, всі прокаріоти поділяють на дві групи – автотрофи та гетеротрофи.

Автотрофи (від гр. autos – сам, trophe – харчування) – перетворюють неорганічний вуглець, вуглекислоту СО2 (яка не має енергетичної цінності) на багаті енергією речовини власного тіла.

Гетеротрофи (від гр. heteros – інший) потребують готові органічні сполуки, які використовують як джерело енергії й вуглецю. Тобто живляться за рахунок органічних субстратів, синтезованих іншими організмами.

Поняття гетеротрофія, досить широке й об’єднує організми, які різко відрізняються за потребами у поживних речовинах. Різниця між гетеротрофними прокаріотами з високою потребою у готових органічних сполуках і тими, потреби яких мінімальні, полягає у ступені розвинутості їх біосинтетичних властивостей.

Так, до паразитів відносять мікроорганізми, які здатні жити лише за рахунок живих організмів. Паразитарний спосіб життя зумовлений відсутністю деяких метаболічних шляхів у цих прокаріот, що призвело до їх повної залежності від продуктів метаболізму хазяїна.

Сапрофіти (від гр. sapros – гнилий, phyton – рослина) – потребують готові органічні сполуки, якими можуть бути гниючі рештки рослинного та тваринного походження.

Деякі прокаріоти потребують одну якусь сполуку (або кілька) із групи вітамінів, амінокислот або азотистих основ, які вони з тих чи інших причин не можуть синтезувати самі. Такі сполуки називають факторами росту, а мікроорганізми, що їх потребують – ауксотрофами, на відміну від прототрофів, які синтезують всі органічні сполуки з основного джерела вуглецю.

Азот – є одним із чотирьох основних елементів, із яких побудовані клітини. З розрахунку на сухі речовини, його вміст становить ~ 10%. У природі азот зустрічається в окисленій чи відновленій формах та у молекулярному вигляді. Переважна більшість прокаріотів засвоює азот у відновленій формі (солі амонію, сечовина, органічні сполуки – амінокислоти та продукти неповного гідролізу). Багатьма прокаріотами може також використовуватись окислений азот.

Дослідження потреб прокаріотів у поживних елементах показало, що всі вони потребують металів, які можуть використовуватись у вигляді катіонів неорганічних солей. Деякі з них (залізо, калій, кальцій, магній) необхідні у досить великих кількостях, інші (цинк, марганець, натрій, молібден, мідь, ванадій, нікель, кобальт) – у незначних. Роль металів зумовлена тим, що вони входять до складу основних клітинних метаболітів.

Таким чином, поживне середовище повинно містити всі необхідні компоненти для нормального розвитку мікроорганізмів, з урахуванням його

75

фізіологічних особливостей. При цьому слід пам’ятати, що повністю універсального поживного середовища не існує.

В лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на поживних середовищах, які повинні відповідати певним вимогам:

∙бути поживними, тобто вони повинні задовольняти всі необхідні харчові потреби мікроорганізмів;

∙містити необхідну кількість води;

∙мати певні значення pH та Eh;

∙бути ізотонічними;

∙бути стерильними;

∙бути прозорими (за можливістю).

10.2. Класифікація поживних середовищ

Середовища, які використовуються у мікробіологічній практиці, класифікуються за походженням (складом), консистенцією та призначенням.

10.2.1.Класифікація поживних середовищ за походженням (складом).

За походженням поживні середовища поділяють на натуральні (природні) і штучні. До натуральних середовищ відносять овочі, фрукти, рештки тварин чи рослин, молоко, води морів та річок, відвари тваринного та рослинного походження, ґрунт та ін. На натуральних середовищах добре розвивається більшість груп мікроорганізмів, оскільки вони містять всі компоненти, які необхідні для їх росту та розвитку. Штучні поживні середовища виготовляють

улабораторних умовах за певною рецептурою (наприклад, м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), м’ясо-пептонний агар (МПА), середовище Чапека, середовище Ешбі, середовище Ендо та ін. – рецептура та способи приготування найпоширеніших у лабораторній практиці поживних середовищ наведено у додатку). В межах штучних поживних середовищ виділяють синтетичні поживні середовища, до складу яких входять хімічно чисті речовини, взяті у певних концентраціях; та напівсинтетичні – виготовлені на основі натуральних середовищ із додаванням, деяких хімічних сполук.

10.2.2.Класифікація поживних середовищ за консистенцією. За консистенцією середовища поділяють на рідкі, щільні та напіврідкі. Для виготовлення рідких поживних середовищ поживні субстрати розчиняють у воді (наприклад, МПБ, пептонна вода, середовище Гісса).

10.2.3.Класифікація поживних середовищ за призначенням. За призначенням поживні середовища поділяють на:

∙універсальні (загальновживані) середовища, на яких ростуть і розвиваються представники різних груп мікроорганізмів (наприклад, МПА, МПБ, пептонна вода). Вони використовуються для культивування мікроорганізмів та накопичення біомаси;

∙середовища спеціального призначення, серед яких виділяють:

76

o елективні середовища, які забезпечують розвиток певних груп мікроорганізмів (наприклад, середовища, які не містять зв’язаних форм азоту – для виділення азотфіксуючих бактерій);

o селективні середовища призначені для селекції мікроорганізмів за певною ознакою (наприклад, стійкість до антибіотика);

o диференційно-діагностичні (індикаторні) поживні середовища – дають можливість швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших або виявити деякі їх особливості. Наприклад, середовище Ендо, яке дозволяє виявити наявність клітин Escherichia coli у природних субстратах, оскільки лише E. coli на цьому середовищі утворює колонії рожевого або червоного кольору з металевим блиском (рис.68).

Рис. 68. Колонії Escherichia coli на середовищі Ендо.

10.3. Способи ущільнення поживних середовищ

Щільні середовища готують на основі рідких, шляхом внесення ущільнювача. Як ущільнювач часто використовують агар-агар або інколи желятин (табл. 2). У виключних випадках, коли мікроорганізми не можуть рости за присутності органічних речовин (облігатні літотрофи), як ущільнювач для поживних середовищ використовують силікагель. Напіврідкі середовища отримують при внесенні половинної концентрації ущільнювача.

Таблиця 2

Характеристики речовин, які використовуються для ущільнення поживних середовищ

Показник	Ущільнювач
	Агар-агар	Желятин
Матеріал для одержання	морські водорості	шкіра, кістки, хрящі
(походження)
Основні компоненти	полісахариди	білки
Температура плавлення	не менше 80°С	10% розчину 32°С
Температура ущільнення	30...40°С	22...25°С
Дія протеаз	не діють	діють
Конденсаційна вода	виділяється	не виділяється
Робоча концентрація	1,0...3,3%	10...20%

77

Агар-агар – складний гетерополісахарид, до складу якого входить агароза й агаропектин. Агар-агар отримують із деяких морських водоростей і випускають у вигляді пластинок або порошку. У воді він утворює гель, який плавиться за 100°С і ущільнюється за температури 40°С. Для ущільнення вносять у середовище 1,5...2,0% агар-агару.

10.4. Стерилізація поживних середовищ

Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний) – це знищення всіх видів мікроорганізмів (вегетативних клітин та форм спокою (спор, цист…)) у середовищах або на предметах, що піддаються стерилізації. Для стерилізації використовують різні методи, які можна поділити на дві основні групи – фізичні та хімічні.

Фізичні методи стерилізації передбачають застосування:

1.Дії високих температур:

∙фламбування (прожарювання) у полум’ї газового пальника чи спиртівки;

∙кип’ятіння;

∙сухим жаром у сухожарових шафах;

∙автоклавування.

2.Стерилізації фільтруванням.

3.Опромінення ультрафіолетовими променями.

Хімічні методи стерилізації передбачають використання бактерицидних газів та розчинів деяких хімічних речовин (спирт, сулема…).

10.4.1.Фізичні методи стерилізації.

Дія високих температур:

Фламбуванням (прожарюванням) у полум’ї газового пальника (спмртівки) стерилізують, безпосередньо перед використанням, бактеріологічні петлі, мікробіологічні голки та дрібні металеві предмети. При цьому необхідно пам’ятати, що найвища температура спостерігається у верхній та периферійних частинах полум’я пальника (рис. 69).

Рис. 69. Значення температури (у °C) в різних ділянках полум’я пальника

78

Кип’ятінням стерилізують дрібні металеві та скляні інструменти. Початком стерилізації вважають момент закипання води у стерилізаторі.

Стерилізацію сухим жаром проводять у спеціальних сухожарових шафах

(рис. 70).

Рис. 70. Зовнішній вигляд сучасної сухожарової шафи.

Таким чином стерилізують, в основному, лабораторний посуд, який складають у спеціальні бікси або загортають у папір. При встановленні на сухожарових шафах температури, слід пам’ятати, що папір та ватно-марлеві короки обвуглюються при температурі понад 180°С.

Стерилізація автоклавуванням – це найнадійніший та найпоширеніший спосіб стерилізації. ЇЇ проводять за допомогою спеціальних пристроїв – автоклавів (рис. 71). В автоклавах стерилізують посуд, поживні середовища та проводять знешкодження відпрацьованого мікробного матеріалу.

Автоклави можуть бути різноманітні за формою, розмірами, робочим тиском, конструкцією, але всі вони виконують одну і ту ж функцію – стерилізацію, і принцип їх роботи – практично однаковий. У верхній двостінний металевий резервуар, який герметично закривається, складають матеріал, який підлягає стерилізації. Нижній резервуар представляє собою котел, який заповнюється водою. Необхідний рівень води відмічено на спеціальній водомірній трубці автоклава (рівнемірі). Верхній та нижній резервуари з’єднані між собою трубкою, по якій піднімається пара під час закипання води у котлі. Пара збирається у верхньому резервуарі і, оскільки він герметично закритий, в ньому створюється надлишок тиску. Для того щоб надлишковий тиск не перевищував дозволеної межі, верхній резервуар оснащено спеціальним паровивідним клапаном. Автоклав обов’язково має два манометри, на одному – встановлюється необхідний для стерилізації тиск, інший – показує поточний тиск у стерилізаційній камері. Як тільки стрілка манометра доходить встановленої позначки, автоматично відкривається паровипускний клапан і надлишок пари виходить із стерилізаційної камери.

79

			б
	а

в

Рис. 71. Схема будови (а) та сучасний вигляд вертикального лабораторного(б) і горизонтального промислового (в) автоклаву: 1 – лійка, через яку автоклав заправляють водою; 2 – запобіжний клапан; 3 – манометр; 4 – кришка; 5 – водопарова камера; 6 – кран для випуску повітря; 7- отвір, через який пара надходить у стерилізаційну камеру; 8 – стерилізаційна камера; 9 – підставка для розміщення матеріалів, що стерилізуються.

В мікробіологічній практиці стерилізація в автоклаві здійснюється при температурі в межах від 112 °С до 134 °С, тобто від 0,5 до 2,0 атм. Температура нижче 112 °С не є надійною, а вище 134 °С – не є необхідною. Показнику манометра, у фізичних атмосферах, відповідає певна температура (табл. 3).

Таблиця 3

Температура насиченої пари за різного тиску

	Тиск:		Температура, °С
нормальний,		надлишковий,
атм		атм
1,0		–	110
1,0		0,5	112
1,0		0,75	116
1,0		1,0	121
1,0		1,5	126
1,0		2,0	134
1,0		2,5	138

80