Praktikum_biology_1_kurs

14.3. Практичне використання впливу абіотичних та біотичних факторів на живі клітини

Пригнічення життєвих процесів у живих клітинах за умови впливу певних абіотичних факторів широко використовується на практиці. Наприклад, більшість методів збереження і консервування харчової сировини та продуктів засноване саме на цьому. Пригнічуючий вплив низьких температур лежить в основі таких методів консервування, як охолодження або заморожування, високих температур – термічної стерилізації або пастеризації, створення високого осмотичного тиску у середовищі – сушіння, в’ялення, засолювання, тощо.

Молочнокислі бактерії і дріжджові гриби зберігають життєздатність після висушування протягом кількох років. Ця властивість мікробів широко використовується, наприклад, для отримання сухих заквасок, які застосовуються для виготовлення різних кисломолочних продуктів тощо, а також для зберігання музейних мікробів. Для цього культури піддаються заморожуванню в умовах вакууму (ліофілізації).

Явище мікробного антагонізму знайшло широке використання у медичній та ветеринарній практиці, а також сільському господарстві. З успіхом використовуються як живі мікроорганізми так і очищені антибіотичні речовини, що ними синтезуються.

Препарати, основою яких є живі культури-антагоністи, отримали назву – пробіотики. Вони з успіхом використовуються для лікування гострих кишкових інфекцій (шигельозів, сальмонельозів, кандидозів тощо), дисбактеріозів, вагінозів та інших. Причому, слід відмітити, що використання живих форм мікроорганізмів практично не має побічних ефектів (алергій, порушень нормального складу мікробіоценозу макроорганізму, втрати лікувальних властивостей).

У сільському господарстві живі культури мікроорганізмів використовують для покращення приросту біомаси тварин, для профілактики інфекційних захворювань, для кращого зберігання кормів, для боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами.

Антибіотиками називають речовини, які мають антимікробні властивості. Ці речовини в основному продукуються мікробами-антагоністами, але можуть бути рослинного чи тваринного походження. В наш час відомо більш як 6000 назв антибіотиків. Але широке застосування мають близько 150. Безсумнівно, антибіотики є найефективнішим засобом для лікування складних інфекційних захворювань, але безконтрольне та не завжди обґрунтоване їх використання призводить до негативних наслідків, а саме: появі антибіотикостійких штамів (необхідності постійного пошуку нових більш ефективних антибіотиків); складним порушенням у нормальному складі мікробіоценозу макроорганізму, необхідності доліковування негативних наслідків антибіотикотерапії. Тому в наш час пошук нових високоефективних антибіотиків є досить актуальним. Цей пошук ведеться у двох напрямках. По-перше, шляхом хімічної модифікації вже існуючих антибіотиків. По-друге, пошуком у природі нових мікробівантагоністів.

111

Рис. 87. Плазмоліз рослинної клітини: А - клітина в стані тургору; Б - кутовий; В - увігнутий; Г - опуклий; Д - судомний; Е - ковпачковий.

1 - оболонка, 2 - вакуоль, 3 - цитоплазма, 4 - ядро, 5 - нитки Гехта.

Завдання на виконання

1. Провести дослідження впливу осмотичного тиску на живі клітини (на прикладі клітин елодеї Elodea canadensіs)

а. Розглянути клітини листа елодеї, що перебувають у стані тургору й замалювати. Послідовність роботи. Цілий лист елодеї (Elodea canadensіs) покласти на предметне скло в краплю води, накрити його покривним склом. На препараті знайти тонку ділянку, де добре видні клітини. Препарат розглянути за малого й великого збільшеннях мікроскопа. Звернути увагу на те, що цитоплазма притиснута до клітинних стінок. Клітини перебувають у стані повного насичення водою - стан тургору. Замалювати окрему клітину, позначивши основні компоненти (рис. 87, А).

б. Спостерігати за явищем плазмолізу в клітинах листа елодеї. Визначити форми плазмолізу. Зробити рисунки. Послідовність роботи. Знявши препарат (із попереднього завдання) зі столика мікроскопа, впритул до покривного скла нанести на предметне скло краплю 6...8% розчину селітри (KNO3) –концентрованішого за розчин речовин, що міститься у вакуолях. З іншого боку на предметне скло впритул до покривного скла покласти смужку фільтрувального паперу, яку потрібно тримати доти, доки розчин селітри не ввійде під покривне скло, замінивши воду. Через 5...10 хвилин звернути увагу на відрив цитоплазми від оболонки клітин, тобто плазмоліз. Колпачковий плазмоліз наступає через 15 і більше хвилин. Замалювати форми плазмолізу (кутовий, увігнутий

опуклий, судомний, колпачковий) (рис. 87, Б-Е). Пояснити явище плазмолізу і його значення в житті рослин.

в. Спостерігати за явищем деплазмолізу в клітинах елодеї, тобто повернути в первісний стан

плазмолізовану клітину. Послідовність роботи. Варто замінити розчин селітри водою, відтягнувши розчин фільтрувальним папером. Відзначити повернення

112

цитоплазми до оболонки клітини, тобто в її нормальний стан. Деплазмоліз відбувається повільніше, ніж плазмоліз. Пояснити явище деплазмолізу.

2. Почати визначення впливу температури середовища на бактерії. Для цього провести висів тестових бактеріальних культур після їх витримуванні на водяній бані та у морозильній камері. Чашки з посівами загорнути у папір, підписати, зазначивши: назву дослідження, дату посіву, шифр академічної групи, прізвища виконавців. Далі чашки з посівами, перевернути догори дном, поставити у термостат на 30°С.

3. Почати визначення впливу рН середовища на бактерії Для цього зробити посів тестових культур бактерій у пробірки з МПБ рН 3, 7, 10. Посів бактерій зі змивів чистої культури робити бактеріологічною петлею, дотримуючись правил асептики. Бактеріологічну петлю перед кожним посівом стерилізувати в полум'ї спиртівки. Пробірки з засіяними середовищами помістити в термостат із температурою 25°С.

4. Здійснити мікроскопічний аналіз симбіотично існуючих організмів: а) кефірного грибка б) чайного грибка в) лишайника

г) бульбочкових мікроорганізмів на коренях бобових. Результати замалювати й описати.

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 14, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Поняття про абіотичні та біотичні фактори. Вплив абіотичних факторів середовища (температури, осмотичного тиску, вологості та кислотності (рН) середовища на живі клітини. Вплив біотичних факторів середовища на живі клітини: сприятливі та несприятливі. Практичне використання абіотичних та біотичних факторів впливу на живі клітини.

3.Практична частина – виконати рисунки одержаних мікроскопічних препаратів у лабораторному зошиті, супроводити їх поясненнями; записати у лабораторному зошиті послідовність операцій, необхідних для дослідження впливу температури та рівня кислотності на мікробні клітини. Назви посіяних тестових культур мікроорганізмів занести до таблиць, результати до яких будуть одержані та внесені на наступному занятті:

	Вплив температури на мікробні клітини
Тест-культура	Вплив нагрівання до 100°С		Вплив охолодження до -10°С
	Час експозиції,	Оцінка росту	Час експозиції,	Оцінка росту
	хв.		хв.

113

Вплив кислотності (рН) середовища на мікробні клітини

Тест-культура		Оцінка росту
	рН=3	рН=7	рН=10

У висновку до роботи необхідно зазначити, вплив яких абіотичних та біотичних факторів на живі клітини було змодельовано на лабораторному занятті та які результати одержано.

Контрольні запитання

1.Які фактори середовища належать до абіотичних?

2.Які фактори середовища належать до біотичних?

3.Охарактеризуйте вплив абіотичних факторів середовища (температури, осмотичного тиску, вологості та кислотності (рН) середовища) на живі клітини.

4.Дайте характеристику сприятливих біотичних факторів середовища.

5.Дайте характеристику несприятливих біотичних факторів середовища.

6.Охарактеризуйте галузі практичного використання абіотичних та біотичних факторів впливу на живі клітини.

7.Як здійснити аналіз термостійкості та холодовитривалості клітин мікроорганізмів?

8.Як здійснити аналіз впливу кислотності середовища на мікробні клітини?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 15

Мікробіологічні методи аналізу об’єктів навколишнього середовища (початок)

Мета роботи: ознайомитись з характеристикою мікрофлори грунту, епіфітною мікрофлорою та їх практичним значенням, опанувати методи дослідження мікрофлори грунту та поверхні рослин.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покривні скельця; крапельниці з дистильованою водою; набір барвників. Крім того на кожну бригаду: 1 чашка Петрі з МПА, 1 чашка Петрі з сусло-агаром, стерильні ступка, товкачик, піпетки; колба з 90 мл стерильної водопровідної води; 3 пробірки з 9 мл стерильної водопровідної води, 1 стерильна пуста пробірка, скляна воронка, паперовий фільтр, стерильне предметне скло у паперовій обгортці.

Загальні відомості

Виявлення і кількісний облік мікроорганізмів в об'єктах навколишнього середовища (природних і техногенних середовищах) необхідні для санітарно-

114

гігієнічних і екологічних досліджень, для моделювання природних систем і розроблення основ керування природними процесами.

15.1. Мікробіологічні методи дослідження ґрунту

Численні популяції, що населяють ґрунт, і групи популяцій різноманітних організмів, що розрізняються за екологічними функціями і таксономічним положенням, поєднуються загальним поняттям «ґрунтова біота».

Ґрунт є середовищем поширення великої кількості різноманітних мікроорганізмів. У 1 г ґрунту міститься від 1 до 10 млрд. клітин мікроорганізмів.

У ґрунті активно протікають процеси розкладання органічних природних речовин за участі широкої розмаїтості сапрофітних мікроорганізмів.

Для виявлення, вивчення й обліку чисельності ґрунтових мікроорганізмів використовують прямі методи мікроскопіювання і методи посіву з розведенням ґрунтової суспензії на щільні і рідкі середовища.

Бактеріологічне дослідження ґрунту включає:

1.Визначення загальної кількості сапрофітних мікроорганізмів.

2.Визначення кількості мікроорганізмів різних фізіологічних груп (азотфіксаторів, амоніфікаторів, нітрифікаторів тощо.).

3.Визначення мікробів-антагоністів і встановлення їх активності.

4.Визначення санітарно-показникових мікроорганізмів – Escherichia coli

та Streptococcus faecalis.

При короткому санітарно-бактеріологічному аналізі встановлюють загальну кількість мікробів (ЗМЧ), кількість бактерій групи кишкових паличок (титр БГКП), титри ентерококів, Clostridium perfringens (перфрінгенс-титр) і термофільних мікроорганізмів. Оцінку ступеня забруднення грунту проводять шляхом визначення загального мікробного числа й кількісного аналізу основних індикаторних мікроорганізмів (табл. 6).

Санітарно-мікробіологічна оцінка грунту				Таблиця 6
				Кількість
Характеристика	ЗМЧ	Титр БГКП	Перфрінгенс-	термофільних
грунту			титр	бактерій в 1 г
Чистий	<5×105	1,0 і більше	0,01 і більше	102-103
Помірно	<5×106	0,9-0,01	0,009-0,0001	103-105
забруднений
Сильно забруднений	>5×106	0,009	і 0,00009 і менше	105-107
		менше

Примітка: для визначенні титру БГКП по 1 см3 різних розведень грунту засівають у 9 см3 глюкозо-пептонного або лактозо-пептонного середовища. В разі розкладу вказаних цукрів до кислоти й газу висів роблять на середовище Ендо, темно-червоні колонії, що виросли, мікроскопіюють, ставлять пробу на оксидазу й вираховують титр БГКП.

Титр ентерококів визначають шляхом посіву відповідних розведень на середовище Каліни або ДИФ-3; перфрінгенс-титр вираховують посівом розведень суспензії на середовище Вільсона-Блера; кількість грибів на середовище Сабуро, актиноміцетів - на крохмально-аміачний агар. Для визначення титру термофільних бактерій різні розведення

115

суспензії грунту вносять у чашки Петрі, заливають розтопленим і охолодженим МПА. Посіви інкубують 24 год при 60°С, підраховують кількість вирослих колоній і роблять перерахунок на 1 г грунту.

Для прямого мікроскопічного вивчення ґрунту застосовується метод Виноградського в різних модифікаціях. Суть його полягає в тім, що ґрунтову суспензію, нанесену на предметне скло, фіксують і зафарбовують карболовим еритрозином. Забарвлені клітини прораховують під мікроскопом.

Незважаючи на те, що прямі мікроскопічні методи дозволяють виявити і врахувати значно більшу кількість мікроорганізмів (кількість бактерій, що враховуються прямими методами, у 1000 разів перевищує те, що враховується методом посіву), метод посіву залишається одним з розповсюджених у практиці дослідження ґрунтових мікроорганізмів, унаслідок того, що дозволяє не тільки враховувати кількість, але і груповий (а часто і видовий) склад мікрофлори, а також дозволяє з ізольованих колоній, що виросли на чашках, виділяти мікроорганізми в чисті культури для подальшого дослідження та ідентифікації.

15.1.1. Відбір і підготовка ґрунтового зразка для мікробіологічного аналізу. При доборі зразків ґрунту враховують надзвичайну макро-, мезо- і мікрогетерогенність як мікробіологічних показників ґрунту, так і інших його властивостей. З дослідної площадки відбирають 3...10 зразків і аналізують їх окремо. Це дозволяє одержати статистично достовірні результати про середню кількість мікроорганізмів, а також статистично обробити отримані дані.

Зразки ґрунтів для проведення мікробіологічних досліджень відбирають у стерильні пергаментні пакети, поліетиленові пакети чи скляний посуд з ватяними пробками тощо. За відсутності можливості аналізувати зразки безпосередньо після збору, їх протягом декількох годин висушують на повітрі, оберігаючи від прямих сонячних променів.

У процесі підготовки ґрунту до мікробіологічного аналізу необхідно провести наступні операції: зруйнувати ґрунтові агрегати; десорбувати мікроорганізми з поверхні ґрунтових часток і з органомінерального гелю і провести дезагрегацію мікроколоній мікроорганізмів.

Для руйнування ґрунтових агрегатів найчастіше використовують метод розтирання ґрунту, зволоженого до пастоподібного стану, впродовж 5 хв у стерильній фарфоровій чашці гумовим товкачиком або пальцем у гумовій рукавичці. Використовується також метод обробки ґрунтової суспензії на електричній мішалці чи на ультразвуковій установці.

Перед посівом вологий або сухий ґрунт висипають на годинникове скло, протерте спиртом, і звільняють від сторонніх включень.

Техніка посіву

Наважку підготовленого ґрунту в 1 г переносять у колбу з 100 мл стерильної водопровідної води. Готують розведення ґрунтової суспензії, для чого 1 мл суспензії з колби послідовно переносять у ряд пробірок з 9 мл стерильної водопровідної води (рис. 88).

116

Посів на щільні середовища робиться з різних розведень. Розведення для висіву підбирають таким чином, щоб на чашці розвивалося 50...200 колоній. З кожного зразка беруть не менш 3-х повторних наважок і кожну висівають не менше, ніж на 3 чашки.

На поверхню застиглого і підсушеного середовища наносять краплю ґрунтової суспензії певного розведення і за допомогою стерильного скляного шпателя розподіляють її по всій поверхні. Засіяні чашки через 3...5 хв. Після посіву перевертають догори дном і поміщають у термостат.

Терміни обліку мікроорганізмів залежать від складу поживного середовища і групи мікроорганізмів, що враховуються. На МПА на 2...3 добу інкубації враховують спорові і неспорові форми бактерій. На середовищі Чапека на 5...7-му добу враховують колонії актиноміцетів, на сусло-агарі на 5...7-му добу – колонії грибів і дріжджів.

Рис. 88.Схема розведень ґрунтової суспензії для проведення мікробіологічного аналізу

Підрахунок кількості колоній на чашці проводять зазвичай з дна чашки, на просвіт. На місці підрахованої колонії маркером ставиться крапка. Підрахувавши кількість колоній на всіх паралельних чашках, обчислюють їх середню кількість на одній чашці і потім роблять розрахунки для визначення вмісту мікроорганізмів у 1 г ґрунту за формулою 1.6.

Результати обробляють статистично, розраховують помилку середнього арифметичного, середнє квадратичне відхилення, коефіцієнт варіації.

15.1.2. Виявлення ценозу мікроорганізмів ґрунту за методом М.Г.Холодного (“скло заростання”)

Вивчення ценозу мікроорганізмів ґрунту дає можливість виявити, з одного боку, наявність різних груп цих мікроорганізмів у тому чи іншому ґрунті, їх взаєморозташування та розподілення на глибині закладання скла, а з іншого боку здійснити географічне вивчення наявності бактерій у ґрунті та простежити

117

апір

кло

Рис. 89. Схема закладання скла за методом М.Г.Холодного

вплив тих чи інших факторів на розвиток ценозу. Метод є дуже простим у виконанні і одночасно – досить мобільним – може бути використаний для проведення необмеженої кількості досліджень у будь-який час.

Крім методу М.Г.Холодного для вивчення мікрофлори ґрунтів використовують методи, розроблені Б.В.Перфільєвим та Д.Р.Габе, С.М. Виноградським, Є.З.Теппер та ін.

Проведення досліду за методом М.Г.Холодного.

На рівній поверхні ґрунту за допомогою шпателя роблять розріз, глибина якого залежить від ґрунтового горизонту, що вивчається (рис. 89). Відмите, знежирене та простелилізоване предметне скло виймають з паперу, в який воно було загорнуте, щільно прикладають до стінки розрізу (як показано на рис. 89). При цьому стерильний клаптик паперу прикладають до тієї сторони скла, яка не торкається ґрунту. Скло закладається не менше, ніж як на 2 см від поверхні ґрунту. Після закладання скла розріз засипають таким чином, щоб скло не

відійшло від стінки. Місце, де закладене скло, маркірують. Скло може витримуватися від тиждня до кількох місяців. Після витримування скла у ґрунті (на наступному лабораторному занятті) його викопують з ґрунту так, щоб не пошкодити стінку, до якої було притулене скло. Потім скло відхиляють від стінки і виймають. Неробочу поверхню скла протирають, у разі необхідності, фільтрувальним папером, а робочу висушують на повітрі та фіксують у полум’ї спиртівки. Після фіксації скло занурюють у воду робочою поверхнею униз, не доводячи до дна. При цьому великі грудочки ґрунту, відмокаючи, будуть

падати на дно, а дрібні залишаться на склі. Після промивання на робочу поверхню скла наносять карболовий еритрозин і витримують з барвником 5...30 хв. (у деяких випадках – до 24 год). Забарвлені препарати вивчають за допомогою мікроскопа з імерсійною системою. У ході мікроскопії відмічають характер мікрофлори, щільність заростання та домінуючі форми.

Завдання на виконання

1. Закінчити роботу із визначення впливу температури та кислотності середовища на живі клітини. Оцінити ріст тестових культур мікроорганізмів, результати оціювання занести до таблиць у протокол минулої роботи та прокоментувати у висновку.

2. Ознайомитись із прямими та непрямими методами аналізу мікрофлори грунту. Закласти на дільниці університету скло обростання для виявлення ценозу мікроорганізмів ґрунту за методом М.Г.Холодного. Розпочати аналіз мікрофлори грунту методом граничних розведень: зробити висіви розведень грунтової суспензії для виявлення загального мікробного числа (ЗМЧ) на МПА та індексу БГКП на середовище ЕНДО.

118

3.Ознайомитись з методами виділення культур мікроорганізмів з природних місць розповсюдження (метод відбитків, виділення дріжджів та бактерій із зразків ґрунту).

4.Чашки з посівами загорнути у папір, підписати, зазначивши: назву дослідження, дату посіву, шифр академічної групи, прізвища виконавців. Далі

чашки з посівами, перевернути догори дном, поставити у термостат на 30°С (з середовищем Ендо – на 37°С).

Опрацювання результатів

За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 15, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Мікробіологічні методи дослідження ґрунту: прямі і непрямі. Мета та особливості проведення санітарно-бактеріологічного аналізу грунту. Нормовані санітарно-бактеріологічні показники грунту. Відбір і підготовка ґрунтового зразка для мікробіологічного аналізу. Техніка посіву. Виявлення ценозу мікроорганізмів ґрунту за методом М.Г.Холодного (“скло заростання”).

3.Практична частина – виконати рисунки одержаних мікроскопічних препаратів у лабораторному зошиті, супроводити їх поясненнями; намалювати схему послідовності операцій мікробіологічного аналізу грунту методом граничних розведень. Накреслити таблицю дослідження мікробіологічних показників грунту, результати до якої будуть одержані та внесені на наступному занятті:

Аналіз мікрофлори грунту

Об’єкт	Ступінь	Кількість колоній на чашці			ЗМЧ у 1г	Примітки
дослідження	розведення		Петрі		ґрунту
		бактерії	гриби	загальна

У висновку до роботи необхідно зазначити значення санітарнобактеріологічного аналізу грунту та порівняти одержані мікробіологічні показники з нормованими значеннями.

Контрольні запитання

1.Порівняйте прямі і непрямі методи аналізу мікрофлори грунту.

2.У чому полягає суть аналізу мікрофлори грунту за методом М.Г.Холодного?

3.З якою метою проводиться санітарно-бактеріологічний аналіз грунту?

4.Які мікроорганізми є санітарно показовими пр аналізі грунту?

5.Охарактеризуйте послідовність операцй з відбору та підготовки ґрунтового зразка для мікробіологічного аналізу.

119

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 16

Мікробіологічні методи аналізу об’єктів навколишнього середовища (продовження)

Мета роботи: ознайомитись з характеристикою мікрофлори води та повітря, їх практичним значенням; опанувати способи відбору проб та методи дослідження мікрофлори води та повітря.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покривні скельця; крапельниці з дистильованою водою; набір барвників. Крім того на кожну бригаду: 2 чашки Петрі з МПА, 1 чашка Петрі з сусло-агаром, 1 чашка Петрі з середовищем Ендо, 3 пробірки з 9 мл стерильної водопровідної води, 1 стерильна пуста пробірка, факел.

Загальні відомості

16.1. Мікробіологічні методи дослідження води

Водні екосистеми є середовищем поширення мікроорганізмів. Первинними продуцентами служать одноклітинні водорості. У харчовий ланцюг входять бактерії і найпростіші. Мікрофлора води найчастіше відображає мікробний пейзаж ґрунту біля водойми, постійно змінюється й оновлюється, що пов'язано з надходженням різних бактерій зі зливовими, стічними, талими водами, з пилом, з організму риб, що живуть у водоймі, рослин, що гниють. Мікрофлора

впрісних і солоних водоймах різна.

Упрісних водоймах (озерах, річках) найчастіше виявляються коки

(Micrococcus roseus тощо) і паличкоподібні бактерії (Pseudomonas fluorescens).

Анаеробів у воді мало; в основному вони розмножуються у мулі на дні водойм, беручи участь у біохімічних процесах очищення. Сапрофітні мікроорганізми виконують роль сміттярів, розщеплюючи органічні відходи, роблячи, їх придатними для метаболічних процесів інших живих істот. Кількість сапрофітів у воді коливається від декількох одиниць до декількох мільйонів. Донні осади (мул) багатші бактеріями, ніж поверхневі шари у водоймах.

Мікрофлора морів і океанів не так багата і представлена галофільними (солелюбними) мікроорганізмами.

Вода артезіанських свердловин майже не містить мікроорганізмів, що зумовлено фільтрувальною властивістю ґрунту.

Зі зливовими, талими і стічними водами в ріки й озера попадають мікроорганізми – представники нормальної флори кишечника людини і тварин, наприклад, кишкова паличка, ентерококи, різні клостридії. Разом з ними можуть потрапити і патогенні мікроорганізми (брюшнотифозні, дизентерійні бактерії, холерні вібріони, віруси поліомієліту, гепатиту тощо). Ці мікроорганізми здатні зберігати життєздатність у воді від декількох днів до тижнів. Саме тому водний шлях передачі є одним з можливих факторів поширення кишкових інфекцій.

120