Praktikum_biology_1_kurs

2.Теоретичні відомості: Класифікація паличкоподібних бактерій за морфологічними ознаками. Типи рухливості бактерій. Джгутики, їх будова, розміри, розташування. Актиноміцети: особливості морфології та практичне значення. Порядок операцій приготування мікроскопічних препаратів «висяча крапля» та «відбиток».

3.Практична частина (рисунки).

Висновок до роботи представити у вигляді таблиці морфологічних ознак та практичного значення розглянутих на лабораторному занятті бактерій:

	Рід та вид	Форма	Розміри,	Характер	Забарвлен	Наявність	Рухли-	Практичне
	бактерій	клітин	мкм	з’єднання	ня	капсули	вість	значення
				клітин	за Грамом

Контрольні запитання

1.На які групи поділяються паличкоподібні бактерії за морфологічними ознаками?

2.Наведіть особливості морфології та зазначте практичне значення бактерій: Lactobacillus acidophylus, Bacillus subtilis-mesentericus, Bacillus megatherium, Escherichia coli, Clostridium butyricum, Corynebacterium sp.

3.Які типи рухливості бактерій відомі?

4.Охарактеризуйте джгутики бактерій: їх будову, розміри, розташування.

5.Дайте характеристику актиноміцетів як особливої групи бактерій.

6.Для чого в мікробіологічній практиці використовують препарати «висяча крапля» та «відбиток»? Як приготувати ці препарати?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 4

Методи фарбування мікроорганізмів

Мета роботи: ознайомитись з простими та складними методами фарбування бактерій, опанувати методи діагностичного фарбування, зокрема метод фарбування за Грамом

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; бактеріологічні петлі; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою; фільтрувальний папір; імерсійна олія; набір барвників, досліджувані мікробні культури.

Загальні відомості

4.1. Прості та складні методи забарвлення бактерій

Для виявлення деяких морфологічних особливостей мікроорганізмів, перевірки чистоти культури й інших цілей готують фіксовані зафарбовані препарати, що можуть зберігатися тривалий час. Готування таких препаратів включає наступні етапи: готування мазка, висушування, фіксація і фарбування

31

(див. лаб. роботу № 3).

Фарбування. Для простого фарбування клітин найчастіше користуються одним аніліновим барвником (фуксином, метиленовим синім), для складного - декількома. Фіксований препарат поміщають на рівнобіжні скляні рейки містка, що лежить на стінках скляної ємкості й обливають з піпетки декількома краплями розчину обраного барвника. Варто звертати увагу на те, щоб кінець піпетки не торкався мазка.

Тривалість фарбування – від декількох секунд до 1...3 хв. Необхідно стежити, щоб під час фарбування розчин барвника на мазку не підсихав, і в разі потреби доливати нові порції.

По закінченні фарбування препарат промивають струменем води доти, доки стікаюча вода стане безбарвною. Потім препарат висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальним папером і розглядають з імерсією.

4.2. Фарбування капсул

Найчастіше для виявлення капсул застосовують спосіб негативного контрастування за допомогою рідкої туші (рис. 29).

1.Негативне контрастування можна комбінувати з прижиттєвим фарбуванням клітин. Для цього краплю досліджуваної суспензії бактерій поміщають у краплю розведеного розчину фуксину, потім змішують із краплею туші, накривають покривним склом і мікроскопіюють із сухим об’єктивом.

2.Краплю бактеріальної суспензії вносять у краплю карболового фуксину

ізалишають на 3...5 хв. Додають 1 краплю туші і витримують хвилину. Потім готують мазок, висушують на повітрі і мікроскопіюють з імерсією.

У поле зору загальний фон чорний, бактеріальні клітини – червоні, а капсули – безбарвні.

а

б

в

г

Рис. 29. Негативне контрастування капсульних форм бактерій: а – роду

Corynebacterium, б – роду Clostridium, в – роду Arthrobacter, г – роду Azotobacter

4.3. Фарбування бактерій за Грамом

Неоднакове відношення мікроорганізмів до фарбування за Грамом пов’язано з розбіжностями в структурі і хімічному складі клітинної стінки бактерій.

У грампозитивних бактерій клітинна стінка складається з пептидоглікану муреїну (60...90%), розташованого у кілька шарів; білку (близько 1%) і ліпідів (близько 1%); товщина її складає 15...80 нм. Виявлено полімери особливого типу – тейхоєві кислоти, ковалентно зв’язані з пептидогліканом. Великий вміст

32

пептидоглікану і особливість його розташування у вигляді комірок забезпечує при фарбуванні за Грамом утворення комплексу з генціановим фіолетовим і йодом. Утворений комплекс є стійким до спирту, унаслідок чого бактерії забарвлені в синьо-фіолетовий колір.

Товщина клітинної стінки грамнегативних бактерій 10...15 нм, але структура її значно складніша, ніж у грампозитивних. Основу її складають орієнтовані внутрішні ліпіди (10...20%), що з розташованими на поверхні полісахаридами утворюють ліпополісахаридний шар. На поверхні клітинної стінки мозаїчно розташовані білки і полісахариди. Пептидоглікан являє собою один шар товщиною всього 2...3 нм (близько 5...10%), лежить під ліпополісахаридним шаром і щільно покриває протопласт. Через великий вміст ліпідів і тонкий, не комірчастий моношар мурену клітинна стінка грамнегативних бактерій при фарбуванні за Грамом утворює з генціановим фіолетовим і йодом комплекс, що руйнується при обробці спиртом, унаслідок

чого клітини знебарвлюються.
До	грампозитивних	мікроорганізмів	належать	коки,	бацили

(спороутворювальні палички), актиноміцети, мікобактерії, клостридіальні бактерії (у молодому віці).

До грамнегативних мікроорганізмів належать: бактерії (аспорогенні палички, наприклад E.coli), спірили, сальмонели, псевдомонади, азотобактер, вібріони.

Існують грамваріабельні мікроорганізми, відношення яких до фарбування за Грамом змінюється на певних етапах їх життєвого циклу. Оскільки здатність клітин забарвлюватися за Грамом залежить від віку культури, для фарбування за Грамом використовують клітини молодої культури, найчастіше однодобової.

4.3.1. Техніка фарбування бактерій за Грамом

На одному знежиреному предметному склі готують три мазки з різних культур (рис. 30). У центрі наносять мазок досліджуваного мікроорганізму, ліворуч і праворуч – мазки контрольних мікроорганізмів (грампозитивні – сарцини, стафілококи; грамнегативні – кишкова паличка). Мазки висушують на

	повітрі, фіксують над полум’ям пальника. На		фіксовані мазки накладають
		полоски фільтрувального паперу, зверху
		наливають		розчин		карболового
		генціанвіолету				(генціанового
		фіолетового). Мазки фарбують упродовж
		1...2 хв, слідкуючи за тим, щоб барвник не
	Рис. 30. Розміщення мазків	підсихав.	У	разі	потреби		під час
		фарбування додають нові порції барвника.
	на склі для фарбування за
	Грамом	Далі фільтрувальний папір				з барвником
		видаляють	і,	не	промиваючи		водою,

обробляють його розчином Люголя протягом 1...2 хв до повного почорніння мазка. Зливають розчин Люголя, а потім обробляють 30 с етиловим спиртом для знебарвлення. Для цього занурюють предметне скло 2...3 рази в склянку з спиртом або наливають спирт на мазок. В останньому випадку стекло злегка погойдують, і спирт змінюють 2...3 рази. Потім препарат промивають водою і

33

додатково фарбують водним розчином фуксину протягом 1...2 хв (водний розчин фуксину – фуксин Циля в 10 разів розведений дистильованою водою). Фуксин зливають, препарат знову промивають водою, висушують і мікроскопіюють з імерсією.

При правильному фарбуванні грампозитивні бактерії мають синьофіолетовий колір, грамнегативні – червоний колір фуксину (рис. 31).

	а		б			в

Рис. 31. Препарати бактерій, зафарбовані за Грамом:

а – грам(+) бактерії, б – грам (-) бактерії; в – фіолетові грам(+)та рожеві грам (-) бактерії, зафарбовані у спільному мазку.

4.4. Фарбування спор бактерій

Виявлення спор у бактерій краще проводити в старих культурах. Спори можна виявити при мікроскопіюванні препарату «роздавлена крапля» у світлому полі. Спори заломлюють світло сильніше, ніж інша частина клітини, і видимі в клітині як темніші включення округлої чи овальної форми (рис. 32)

Рис. 32. Спори Paenibacillus alvei, видимі за допомогою фазово-контрастної мікроскопії

Спори можна знайти, застосовуючи особливі методи фарбування.

Метод Циля-Нільсена в модифікації Мюллера. На фіксований у полум’ї й остиглий препарат наносять 5%-й розчин хромової кислоти. Через 5...10хв кислоту змивають водою. Препарат накривають смужкою фільтрувального паперу, рясно змочують папір карболовим фуксином Циля. Підігрівають препарат над полум’ям до появи пари (не до кипіння), відводять його убік і

34

додають нову порцію барвника. Так протягом 7 хв. При цьому важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підсихав. Після охолодження папір знімають, препарат промивають водою й ретельно промокають фільтрувальним папером.

У результаті такої обробки клітини із спорами рівномірно профарбовуються. Далі знебарвлюють цитоплазму клітин (але не спор), обробляючи препарат 1 %-м розчином соляної або сірчаної кислоти 15...30 с. При готуванні препарату спора Bacіllus mycoіdes або B. mesenterіcus рекомендується знебарвлювати цитоплазму 16...18 с (розмірно рахуючи вголос від 21 до 40). При перевищенні цього часу можуть знебарвитися й спори.

Потім препарат промивають водою й фарбують метиленовим синім 2 хв. Якщо всі операції виконані правильно, забарвлення виходить контрастним й спори яскраво-червоного кольору будуть чітко виділятися на блакитному тлі цитоплазми (рис. 33, а).

Метод Пєшкова. На фіксований у полум’ї препарат наливають метиленовий синій Лефлера, доводять його до кипіння й кип’ятять 15...20 с, тримаючи над полум’ям. Мазок промивають водою й дофарбовують протягом 30 с 0,5 %-м водним розчином нейтрального червоного. Знову промивають, підсушують і досліджують препарат з масляною імерсією об’єктива. Спори виходять блакитні або сині, цитоплазма – рожева (рис. 33, б).

а б

Рис. 33. Спори бактерій, зафарбовані за методом Циля-Нільсена в модифікації Мюллера (а) та Пєшкова (б).

Для дослідження спор гарними об’єктами можуть служити культури

Bacіllus mesenterіcus і В. mycoіdes у віці чотирьох діб.

Реактиви для фарбування спор бактерій:

1.Карболовий фуксин Циля

2.Метиленовий синій Лефлера.

3.Метиленовий синій, насичений водний розчин: 2 г барвника й 100 мл дистильованої води.

4.Хромова кислота, 5 %-й розчин.

5.Соляна (або сірчана) кислота, 1 %-й розчин.

35

4.5.Фарбування джгутиків.

Джгутики мікроорганізмів – найтонші утворення (0,02...0,04 мкм), що легко відриваються від клітини при обробці. Це ускладнює дослідження. В основі методів фарбування жгутиков лежить обробка їх протруйниками, у результаті якої вони збільшуються в обсязі.

Підготовка матеріалу. Для підготовки культури рекомендується щодня кілька днів поспіль робити пересівання на свіже рідке поживне середовище. У день перегляду матеріал беруть петлею й переносять у пробірку з 5...6 мл стерильної водопровідної води, нагрітої до 37 °С. Не рекомендується бовтати петлею у воді, бактеріальна маса сама повинна протягом 30...60 хв розійтися в ній.

Перш ніж приступити до роботи, перевіряють рухливість клітин у препараті «висяча крапля». За відсутності рухливості пробірку залишають у термостаті ще на 1,5...2 доби.

Для готування препаратів необхідні зовсім чисті предметні стекла. Їх кип'ятять у розчині біхромату калію в міцній сірчаній кислоті, потім двічі промивають у розчині їдкого натру. Після цього скельця промивають водою й зберігають у ємності з 96 %-м спиртом. Перед готуванням мазка сильно нагрівають ту сторону скла, на яку буде нанесений мазок. Наносять мазок на вже охолоджене скло.

Метод Лефлера. Суспензію бактерій наносять на предметне скло й сушать за кімнатної температури. Допускається фіксація мазка швидким одноразовим проведенням через полум'я. Далі препарат обробляють протруйником 3...5 хв, нагріваючи його до появи пари, або 15...20 хв за комантної температури, потім промивають сильним струменем дистильованої води 30 с і висушують на повітрі.

Фарбують препарат 3...4 хв за легкого нагрівання до появи пари карболовим фуксином Циля або розчином, що містить одну частину насиченого спиртового розчину фуксину й десять частин води. Потім препарат промивають водою, висушують і досліджують під мікроскопом з імерсвєю. Джгутики й клітини бактерій забарвлюються в рожевий колір.

Готування протруйника. 12 г таніну розчиняють при нагріванні в 48 мл води, додають 30 мл насиченого водяного розчину залізного купоросу й 6 мл насиченого розчину фуксину в 96 %-му спирті. Суміш готовлять за кілька днів до вживання, зберігають у склянці із притертою пробкою в темному місці. Перед початком роботи протруйник фільтрують.

Метод Лейфсона. Олівцем для скла на одній половині предметного скла по границі окреслюють прямокутник. Петлею наносять суспензію бактерій на площу прямокутника. Нахиляючи скло, дають можливість стекти надлишку рідини на протилежну сторону скла. Препарат сушать при кімнатній температурі на повітрі.

На мазок наносять точно 1 мл парарозанілінового барвника, стежачи за тим, щоб він не стікав за нанесені на скло лінії. Оскільки в барвнику міститься танінова кислота, попередньої фіксації не потрібно. Фарбування триває 7...15 хв (час визначають у кожному конкретному випадку експериментально). Для

36

уточнення строку фарбування препарат поміщають на чорне тло й освітлюють збоку. Як тільки по всьому мазку випаде осад, надлишковий барвник видаляють слабким струменем дистильованої води, не відмиваючи барвник, що випав в осад. Якщо клітини бактерій не забарвилися в червоний колір, їх дофарбовують метиленовим синім (рис. 34).

Рис. 34. Зафарбовані за методом Лейфсона джгутики у B. cereus.

Готування парарозаніліну. Для цього необхідні три розчини: перший -1,5%-й NaCl у дистильованій воді; другий – 3%-й танінової кислоти в дистильованій воді (розчин повинен бути ясно-жовтим); третій – 0,9 %-й парарозанілінацетату, або 0,3 %-й парарозанілінгідрохлориду в 96 %-му етиловому спирті. Для розчинення потрібно кілька годин навіть при збовтуванні. Замість солі розаніліну можна застосувати основний фуксин у вигляді 1,2%-го розчину в 96%-м етиловому спирті.

Для готування барвника змішують рівні об’єми всіх трьох розчинів і суміш зберігають у щільно закупореній склянці. Барвник зберігає властивості кілька тижнів при 4 °С и місяці й навіть роки при мінус 10...20 °С.

4.6. Фарбування нуклеоїду бактерій

Про наявність нуклеоїда під час цитохімічних досліджень судять за якісною реакцією на дезоксирибонуклеїнову кислоту (ДНК).

Метод Романовського-Гімза. Цим методом у клітинах мікроорганізмів одночасно виявляють ядерні речовини й волютин. Препарат фіксують 5 хв. метиловим спиртом або фіксатором Карнуа. В останньому випадку для видалення слідів оцтової кислоти препарат промивають спиртом і ретельно висушують на повітрі. Зафарбовують, препарат барвником РомановськогоГімза протягом доби, потім обполіскують слабколужною (рН 7,2) водою, висушують і мікроскопіюють. Ядерні речовини забарвлюються в червонофіолетовий колір, цитоплазма – у слабко-рожевий.

Барвники. Барвник Карнуа містить абсолютний спирт, хлороформ, крижану оцтову кислоту в співвідношенні 6:3:1.

Барвник Романовського-Гімза. Промисловість випускає препарат із суміші азура (органічний барвник, отриманий з метиленового синього), еозину і метиленового синього. Безпосередньо перед уживанням до 10 мл дистильованої води, що має нейтральну або слабколужну реакцію (рН 7,2), додають десять крапель барвника.

Реакція Фельгена. Її застосовують для фарбування ДНК. При слабкому кислотному гідролізі ядерних нуклеопротеїдів відбувається відщеплення пуринових і піримідинових основ, що веде до вивільнення дезоксирибози, що входить у ДНК. Під час гідролізу дезоксирибоза переходить у р-

37

гідроксилевуліновий альдегід, що взаємодіє із сірчистою частиною безбарвної фуксинсернистої кислоти, виділяючи фуксин червоного кольору. У результаті ядерні речовини стають забарвленими.

Препарати бактерій обробляють фіксатором Карнуа 5 хв, промивають абсолютним спиртом, гідролізують 7 хв у розчині 1 н. HCl, підігрітої до 60 °С, занурюють на 1...2 хв. у холодну 1 н. HCl і переносять у фуксинсерністу кислоту (реактив Шиффа) на 3...4 год. Препарати послідовно промивають у трьох кюветах із сірчистою водою по 20 хв у кожній, потім обполіскують дистильованою водою, висушують і мікроскопіюють. Ядерна речовина забарвлюється у фіолетовий колір.

4.7. Фарбування включень бактерій

Фарбування волютину (метахроматичних гранул) методом Омелянського. Волютин – поліфосфат, запасна фосфор- і азотовмісна речовина, похідна нуклеїнової кислоти. Характерна його властивість – спорідненість до основних барвників і мета-хромазія, тобто здатність набувати іншого кольору, ніж колір барвника.

Метод фарбування заснований на поганій розчинності волютину в розчинах кислот. На знежирене скло наносять тонкий мазок бактерій, сушать на повітрі, фіксують над полум'ям і фарбують карболовим фуксином Циля. Через 0,5...1 хв. промивають препарат водою, знебарвлюють 20...30 с 1 %-м розчином H2SO4, промивають, промокають фільтрувальним папером, наносять олію й дивляться з імерсійною системою. Видно гранули волютину, забарвлені в червоний колір, на тлі синьої цитоплазми.

Можна забарбовувати фіксовані препарати 10...30 с метиленовим синім Лефлера або 1 %-м розчином толуїдинового синього. Потім препарат промивають водою, промокають фільтрувальним папером і дивляться. У першому випадку (метиленовий синій) гранули мають колір від синіх до фіолетових, у другому – вони червоні на тлі блакитної цитоплазми.

Фарбування глікогену. Глікоген – вуглевод, тваринний крохмаль. Часто він накопичується в клітинах бацил.

На чисте предметне скло наносять невелику краплю суспензії мікроорганізмів й до неї додають таку ж краплю розчину йоду в йодиді калію (7 г йоду й 20 г йодиду калію на 100...300 мл дистильованої води). Зверху поміщають покривне скло, надлишок рідини видаляють фільтрувальним папером. Препарат переглядають із масляною імерсією.

Включення глікогену добре досліджувати в одне-дводобових культурах

Bacіllus mycoіdes.

Фарбування гранульози. Гранульоза – вуглевод, крохмалеподібна речовина. У великих кількостях накопичується в клітинах маслянокислих бактерій – Clostrіdіum butyrіcum перед спороутворенням.

У невелику краплю суспензії маслянокислих бактерій додають таку ж краплю розчину Люголя, накривають покривним склом, видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером і переглядають із масляною імерсією.

38

Об'єктом дослідження може служити накопичувальна культура маслянокислых бактерій. Її одержують у такий спосіб: за три-чотири доби до занять у пробірки поміщають дрібно нарізану неочищену картоплю (1/3 пробірки), на кінчику ножа вносять крейду й доливають доверху водопровідною водою. Пробірки поміщають на водяну баню й при 70°С нагрівають 10 хв, потім охолоджують і ставлять у термостат при 30 °С.

Для готування препарату маслянокислых бактерій беруть піпеткою краплю суспензії із придонного шару.

Фарбування жиру. Жир міститься в клітинах практично всіх видів мікроорганізмів; особливо багато його накопичується при старінні культури.

На предметне скло наносять невелику краплю 40 %-го розчину формаліну. Петлею вносять у неї культуру мікробів. Формалін убиває клітину й робить проникною оболонку. Через 5 хв у цю же краплю додають невелику краплю метиленового синього, а через 10 хв краплю Судану ІІІ – індикатора жироподібних речовин. Краплю, що утворилася, накривають покривним склом, видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером і мікроскопіюють із із масляною імерсією. Цитоплазма клітин забарвлюється в синій колір, включення жиру – у рожево-жовтогарячий.

Об'єкти для дослідження – старі культури Bacіllus mycoіdes, В. megaterium.

Фарбування полі-β-оксимасляної кислоти. Багато гранул, що забарвлюються Суданом ІІІ, або Суданом чорним В (0,3 %-й розчин в 70 %-му розчині етилового спирту), складаються з полі-β-оксимасляної кислоти. Для виявлення полі-β-оксимасляної кислоти готують препарат клітин з 24-годинної культури. Мазок підсушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника, фарбують суданом чорним В 5...15 хв; барвник може при цьому висохнути, але це не має значення. Потім барвник змивають, препарат підсушують фільтрувальним папером і обробляють ксилолом, кілька разів занурюючи в нього стекло. Час знебарвлення не повинен бути більше 1 хв. Додаткове фарбування препарату проводять 0,5 %-м водним розчином сафраніну 5...10 с. Включення полі-β-оксимасляної кислоти виглядають як чорно-сині гранули в рожевій цитоплазмі клітин.

Готування Судану ІІІ. 0,1 г Судану ІІІ розчиняють в 200 мл 96 %-го спирту або концентрованій молочній кислоті.

Завдання на виконання:

1.Зафарбувати за Грамом культури мікроорганізмів Bacillus megaterium або

Sarcina flava та Escherichia coli.

2.Виявити спори у бактерій Bacillus subtilis-mesentericus або Clostridium butyricum за методом Пєшкова

3.Зафарбувати капсулу за методом негативного контрастування або розглянути показовий препарат.

39

Опрацювання результатів

Результати спостережень необхідно занести до протоколу лабораторної роботи 4, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Прості та складні методи фарбування бактерій. Порядок операцій фарбування бактерій за Грамом. Відмінності грам(+) та грам(-) бактерій. Порядок операцій диференційного фарбування спор та капсул бактерій.

3.Практична частина (рисунки) – кольором виділити особливості диференційно забарвлених препаратів.

У висновку до роботи зазначити виявлені під час лабораторної роботи відмінності грам(+) та грам(-) бактерій.

Контрольні запитання

1.Чим відрізняються прості та складні методи фарбування бактерій?

2.Які методи існують для фарбування органел бактеріальної клітини: клітинної оболонки, цитоплазми, нуклеоїду, включень, спор, капсул, джгутиків?

3.У чому полягає відмінність між грам(+) та грам(-) бактеріями?

4.Які етапи має метод фарбування за Грамом.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 5

Морфологічні ознаки дріжджів

Мета роботи: ознайомитись з будовою еукаріотичної клітини на прикладі дріжджової, класифікацією, культуральними ознаками та практичним значенням дріжджів, опанувати методи мікроскопічних досліджень дріжджових культур.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; бактеріологічні петлі; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою; фільтрувальний папір; імерсійна олія; набір барвників, досліджувані мікробні культури.

Загальні відомості

5.1. Будова еукаріотичної клітини на прикладі дріжджової

За сучасними уявленнями дріжджі є збірною систематичною групою одноклітинних мікроорганізмів, до якої відносять представників різних класів грибів. Дріжджі – одноклітинні еукаріотичні мікроорганізми, тобто мають диференційоване ядро. На рис. 35 наведена схема будови дріжджової клітини.

Клітина оточена клітинною стінкою (1), яка є механічним бар'єром, зберігає і надає форму клітці, підтримує внутрішньоклітинний тиск. Структура клітинної стінки багатошарова, пориста, через пори клітинної стінки із зовнішнього середовища проникають низькомолекулярні речовини (вода, солі,

40