Praktikum_biology_1_kurs

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 19

Практичне значення мікроорганізмів (ІІ підсумкове заняття)

Мета роботи: систематизувати одержані знання з морфології, систематики мікроорганізмів та їх практичного значення.

Матеріали та обладнання: мультимедійний проектор, презентації

Загальні відомості

19.1. Мікроорганізми в природі й біотехнології

Співтовариство мікроорганізмів у природних місцях поширення є найважливішим чинником, що визначає цілісність екологічних систем у природі. В особливих умовах мікроорганізми можуть представляти єдину форму життя. У процесі еволюції виробилися різні типи взаємини між мікроорганізмами. Тісний зв'язок між ними (симбіоз) будується на різних характерах залежності партнерів: взаємовигода (мутуалізм), несприятливий вплив на одного з партнерів (паразитизм), рідше – індиферентні відносини один з одним (нейтралізм).

Вивчення мікробного світу розширює рамки наших уявлень щодо меж живої природи й свідчить про активну участь мікроорганізмів у кругообігу речовин на Землі. Використовуючи й утворюючи метан, поглинаючи СО і СО2, трансформуючи всілякі органічні сполуки в різних, у тому числі екстремальних, умовах, мікроорганізми беруть активну участь у циклі перетворення вуглецю. Фіксуючи молекулярний азот, окисляючи аміак і нітрити, здійснюючи денітрифікацію, мікроорганізми забезпечують азотний кругообіг у природі, а здатність окиснювати відновлені сірковмісні сполуки й відновлювати окислені визначає їх роль у кругообігу сірки.

Вплив мікроорганізмів не завжди позитивний: деякі з них викликають важкі захворювання в людини, тварин і рослин. Нерідкі випадки, коли мікроорганізми спричиняють псування сільськогосподарської продукції, руйнування підземних частин будинків, трубопроводів і металевих конструкцій шахт. Вивчення властивостей таких мікроорганізмів дозволяє розробити ефективні способи захисту від ушкоджень, що ними заподіюються. З іншого боку, позитивне значення мікроорганізмів для практики неможливо переоцінити. За допомогою грибів і бактерій готують хліб, вино, пиво, квас, молочнокислі продукти, закваски. За участі мікробів одержують ацетон і бутанол, оцет, лимонну кислоту, деякі вітаміни, ряд ферментів, антибіотики й каротиноїди. Мікроби беруть участь у трансформації стероїдних гормонів та інших сполук. Їх використають для одержання білка й ряду амінокислот. Реалізується ідея використання мікробних ферментів у діагностичних цілях. Застосування мікробних комплексів для перетворення сільськогосподарських відходів у біогаз (суміш метану й вуглекислоти) або етанол відкриває

141

можливість створення принципово нових систем поповнення енергетичних ресурсів. В останні роки мікроорганізми, особливо прокаріоти, широко застосовують як об’єкти генної інженерії для клонування генів і створення векторів.

Потенціал мікроорганізмів у практичному відношенні невичерпний. Поглиблення знань щодо життєдіяльності цих мікроскопічних, але макрозначимих істот відкриває нові напрямки їхнього ефективного використання в біотехнології.

Завдання на виконання

1.Підготувати та презентувати доповідь за темою курсової роботи та мультимедійну презентацію.

2.Підготувати протоколи усіх лабораторних робіт до перевірки.

Опрацювання результатів

За результатами роботи повинно бути складено протокол лабораторної роботи 19, у якому має бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Практичне значення мікроорганізмів.

Увисновку до роботи необхідно зазначити галузі можливого практичного застосування мікроорганізмів, особливу увагу приділивши практичному значенню того виду, який був описаний у курсовій роботі.

Контрольні запитання

1.Яке значення відіграють мікроорганізми у кругообігу речовин в природі? Наведіть конкретні приклади.

2.Наведіть приклади практичного використання мікроорганізмівпрокаріотів.

3.Наведіть приклади практичного використання мікроорганізмівеукаріотів.

4.Яке негативне значення можуть мати мікроорганізми?

142

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Базова

1.Биология: в 3-х т.: пер. с англ. / Д. Тейлор, Н. Грин, У.Стаут; под. ред. Р. Сопера. – 3-е изд. – М.: Мир, 2004.

2.Векірчик, К.М. Практикум з мікробіології: навч. посіб. / К. М. Векірчик.

–К.: Либідь, 2001. – 144 с.

3.Гусев, М.В. Микробиология: Ученик для студ. биол. спеціальностей ВУЗов / М.В.Гусев, Л.А. Минеева. – 4-е изд. стер. – М.: Издательский центр

«Академія», 2003. – 464 с.

4.Лысак, В. В. Микробиология: учеб. пособие / В. В. Лысак. – Минск:

БГУ, 2007. – 426 с.

5.Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию. / Ю.С. Ченцов. – М.: ИКЦ Академкнига, 2004. – 495 с.

Допоміжна

1.Гарибова, Л.В., Основы микологии: морфология и систематика грибов и грибоподобных организмов. / Л. В. Гарибова, С. Н. Лекомцева. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2005. – 220 с.

2.Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н. Б. Градова, Е.С.Бабусенко, И. Б. Горнова, Н. А. Гусарова – М.: ДеЛи принт, 2001. – 131 с.

3.Микробиология: учебник. / А. В.Воробьёв, А. С.Быков, Е. П. Пашков, А. М. Рыбакова. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2003. – 336 с.

4.Римарева, Л.В. Теоретические и практические основы биотехнологии дрожжей / Л.В. Римарева. – М.: ДеЛи принт, 2010. – 252 с.

5.Современная микробиология. Прокариоты: учеб.: пер. с нем. / под ред. Й. Ленгелер, Г. Древс, Г. Шлегель – М: Мир, 2005. – 656 с.

143

ДОДАТОК

Поживні середовища

М’ясний бульйон. Для приготування м’ясо-пептонних середовищ використовують м’ясний бульйон, що одержують так: 500 г дрібно нарізаного свіжого м’яса без кісток, жиру й сухожиль заливають в емальованій каструлі 1 л водопровідної води, нагрітої до 50 °С, і залишають настоюватися 12 год за кімнатної температури або 1 год за 50...55 °С. М’ясо віджимають, екстракт проціджують через марлю із шаром вати, кип’ятять 30 хв для згортання колоїдних білків і фільтрують двічі (перший раз через марлю з ватою, другий – через паперовий фільтр). Фільтрат доливають водою до 1 л, розливають у колби, закривають ватяними короками й стерилізують при 120 °С 20 хв (короки колб закривають зверху ковпачками з паперу).

М’ясний бульйон може бути використаний у будь-який час для приготування відповідних середовищ. Якщо їх готують відразу після одержання бульйону, то попередня стерилізація зайва.

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). Для приготування МПБ до 1 л м’ясного бульйону додають 5...10 г пептону (перший продукт гідролізу білка з високою молекулярною масою) для підвищення калорійності середовища і 5 г повареної солі для створення осмотичної активності. Середовище нагрівають до розчинення пептону, постійно помішуючи.

Потім установлюють нейтральну або слабколужну реакцію середовища (pH середовища 7,6...7,8), доливаючи 20 %-й розчин Na2CO3 до посиніння вологого червоного лакмусового папірця (фенолфталеїн не показує лужну реакцію – у випадку додавання його до середовища в порцеляновій чашці рожеве забарвлення не з’являється).

Після встановлення реакції середовище знову кип’ятять 5...10 хв і білки, що згорнулися від зміни реакції, відфільтровують через паперовий фільтр без освітлення бульйону або освітлюють бульйон білком. В останньому випадку свіжий яєчний білок збивають із подвійною за об’ємом кількістю води й змішують із охолодженим до 50 °С бульйоном. Суміш кип’ятять на слабкому вогні 10 хв, помішуючи, потім фільтрують. Прозорий м’ясо-пептонний бульйон розливають у пробірки, закривають ватяними короками й стерилізують при

120°С 20 хв.

М’ясо-пептонний агар (МПА). Додають до 1 л МПБ 15...20 г дрібно нарізаного агар-агару. Середовище нагрівають до розчинення агар-агару (температура плавлення його 100°С, застигання 40 °С), встановлюють слабколужну реакцію середовища (pH 7,6...7,8) 20 %-м розчином Na2CO3 й через лійки розливають у пробірки (приблизно по 10 мл стовпчиком для розливу в чашки Петрі, по 5 мл – для одержання скошеного, похилого агару).

При розливі необхідно стежити за тим, щоб краю пробірки були сухими, інакше короки будуть прилипати до скла. Пробірки із середовищем стерилізують 20 хв в автоклаві при 120 °С.

144

М’ясо-пептонна желатина (МПЖ). Вносять в 1 л м’ясо-пептонного бульйону 100...150 г желатини. Температура плавлення желатини залежить від її концентрації в середовищі: 10%-а желатина плавиться при 24°С, 15%-а – при 25°С. У літню пору середовища готують, додаючи 15 % желатини.

Після розчинення желатини при обережному нагріванні встановлюють слабколужну реакцію середовища (як для МПБ і МПА), кип’ятять 5 хв, потім охолоджують до 40...50 °С. Одночасно яєчний білок збивають із невеликою кількістю води, вливають його в охолоджене желатинове середовище, добре збовтують і знову нагрівають. Середовище після випадання білків стає прозорим. Його фільтрують через гарячу лійку, розливають у пробірки й стерилізують текучою парою, прогріваючи середовище три рази по 30 хв кожні

24 год.

Картопляний агар. Нарізають скибочками 200 г очищеної й промитої водою картоплі, заливають 1 л водопровідної води, варять 30 хв. Відвар фільтрують через вату й додають воду до першоначального об’єму. До отриманої рідини додають 2 % агар-агару, кип'ятять до його розчинення й установлюють нейтральну реакцію середовища (рН 7). Середовище стерилізують 20 хв при 1 атм)*.

*За системою СІ тиск прийнято виражати в Паскалях (Па): 1 атм = 1,01325 × 105Па ≈ 102 кПа.

Пивне сусло. Зерна ячменя замочують у холодній воді й пророщують при 35 °С. Після того як паростки стануть удвічі більше довжини зерна, останнє висушують до повітряно-сухого стану (можна за умови слабкого підігрівання) і одержують солод. Для приготування сусла солод крупно розмелюють і 250 г його беруть на 1 л води. Для кращого виділення ферменту амілази суміш підігрівають при 57 °С до зникнення реакції на крохмаль (синє забарвлення з йодом). Проби на оцукрювання крохмалю проводять у порцеляновій чашці в краплі рідини.

Сусло проціджують через вату, потім фільтрують через паперовий фільтр. Таке сусло містить 10...20 % цукру. Точний його вміст визначають за щільністю розчину за допомогою сахариметра. Сусло розбавляють водою до концентрації цукру 6...8 % і стерилізують 30 хв при 115 °С і тиску 0,5 атм.

Готове сусло можна одержати на пивоварному заводі.

Сусло-агар (СА). До приготованого пивного сусла додають 2,5...3 % агарагару, кип’ятять до розплавлювання, фільтрують через вату й стерилізують таким же способом, як пивне.

Дріжджова вода: 50...100 г сухих дріжджів розмішують в 1 л води, кип’ятять 10 хв, фільтрують через паперовий фільтр і стерилізують текучою парою по 30 хв щодня протягом трьох діб.

Дріжджовий автолізат: 200 г пресованих дріжджів розводять в 1 л води, додають 2 г Na2HPO4, 1 н. розчин NaOH (до рН 6,1) і 5 мл хлороформу; витримують при 37°С дві доби, доводять до рН 7,4, кип’ятять 30 хв, фільтрують через фумажный фільтр, розливають у посуд і стерилізують 30 хв при 115 °С.

145

Дріжджовий екстракт: 1 кг пресованих дріжджів розводять в 1 л води, суміш кип’ятять 1 год, тричі фільтрують через паперовий фільтр і стерилізують

30 хв при 115 °С.

Бобовий відвар. Заливають 50 г квасолі (краще білої) 1 л водопровідної води й варять до готовності так, щоб боби не розварилися. Отриманий відвар фільтрують через вату, додають до нього 10 г цукру й доводять водою до первинного об’єму. Встановлюють слабколужну реакцію середовища, розливають у колби й стерилізують 30 хв в автоклаві при тиску пари 1,5 атм.

Середовище Чапека для вирощування та (або) ідентифікації мікроміцетів, (г): сахароза – 30,0 або глюкоза – 20,0; NaNO3 – 2,0; К2НРО4 – 1,0; MgSO4×7H2O

– 0,5; КС1 – 0,5; FeSO4×7H2O – 0,1; вода дистильована – 1000 мл.

Середовище Сабуро (глюкозо-пептонне середовище) для вирощування та

(або) ідентифікації дріжджів (г): глюкоза – 40; пептон – 10; агар – 20; вода водопровідна – 1000 мл. Для збагачення факторами росту додають дріжджовий екстракт в кількості 2…5 г на 1 л середовища.

Барвники та реактиви

Фуксин основний, спиртовий розчин, насичений

Фуксин основний, кристалічний – 10 г Етиловий спирт, 96%-й – 90 мл.

Фуксин основний, карболовий (фуксин Циля)

Фуксин основний, спиртовий розчин, насичений – 10 мл Карболова кислота, 5%-на – 90 мл

Для приготування 5%-ної карболової кислоти необхідно 5 г фенолу розчинити в 95 мл дистильованої води

Фуксин Пфейффера (синоніми: фуксин розбавлений, Фуксин основний – водний розчин)

Фуксин основний, карболовий (фуксин Ціля) – 10 мл Дистильована вода – 90 мл.

Кристалічний фіолетовий, водний розчин, 1%-й

Кристалічний фіолетовий, кристали – 1 г Дистильована вода – 100 мл.

Кристалічний фіолетовий, спиртовий розчин, 2%-й

Кристалічний фіолетовий, кристали – 2 г Етиловий спирт, 96%-й –98 мл

Цей розчин використовують для приготування папірців за методом Синьова.

146

Папірці за методом Синьова

Фільтрувальний папір, нарізаний смужками, занурюють на 1-2 хв в 2%-й спиртовий розчин кристалічного фіолетового. Папірці висушують, розрізають на шматочки 2 × 4 см і зберігають у банках з темного скла із притертими пробками.

Метиленовий синій, спиртовий розчин, насичений

Метиленовий синій, кристали – 10 г Етиловий спирт – 90 мл.

Метиленовий синій (1:40)

Метиленовий синій, спиртовий розчин, насичений – 1 мл Дистильована вода – 40 мл.

Малахітовий зелений, спиртово-водний розчин

Малахітовий зелений, кристали – 10 г Етиловий спирт – 20 мл Дистильована вода – 1 500 мл.

Барвники для виявлення ліпідів

Судан ІІІ – 0,5 г; молочна кислота концентрована – 100 мл.

Судан чорний В – 0,3 г; етиловий спирт 70°-вий гарячий – 100 мл. Розчин витримують протягом декількох годин при 60°С у закупореній

склянці, потім охолоджують і фільтрують.

Туш

Рідку канцелярську туш перед використанням центрифугують протягом 10 хв. при 3 000 об/хв.

Розчин Люголя

Йод кристалічний – 7 г Йодид калію – 20 г Дистильована вода – 100 мл.

У фарфоровій ступці розтирають йод кристалічний і йодид калію, порціями додають воду до повного розчинення кристалічного йоду й йодиду калію. Розчин зберігають у темній склянці.

Фізіологічний розчин

Готують 0,85% -вий розчин NaCl у дистильованій воді. За необхідності стерилізують 30 хв при 1 атм.

147