Практична робота

Дослід 1. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Принцип методу. Сполуками, що підвищують активність ферментів – активаторами – є іони багатьох металів, зокрема: Na⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, а також органічні сполуки – проміжні продукти обміну речовин в організмі.

Активатором амілази є хлорид натрію (NaCl), інгібітором – сульфат міді (CuSO₄). Показником впливу цих сполук на активність амілази є ступінь гідролізу крохмалю під дією ферменту в присутності NaCl та CuSO₄.

Матеріальне забезпечення: 1 % р-н крохмалю, 0,1 %-й розчин йоду в 0,2%-му розчині йодиду калію, 5 % р-н CuSO₄, 1 %-й розчин NaCl, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. Слину розводять в 2 рази. Беруть 3 пробірки. В пробірку № 1 наливають 1 мл води, в пробірку № 2 – 0,8 мл води та 0,2 мл 1% -го розчину NaCl, в пробірку № 3 – 0,8 мл води та 0,2 мл 1 %-го розчину CuSO₄. У всі три пробірки додають по 1 мл слини. Вміст перемішують і додають по 2 мл 1 % -го розчину крохмалю, знову перемішують і ставлять в термостат чи на водяну баню при t = 37°C на 15 хв.

Далі у всіх пробірках проводять реакцію з йодом (0,1 %-й розчин йоду в 0,2 %-му розчині йодиду калію). Спостерігають зміну забарвлення.

Результати роботи заносять у таблицю:

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Вода, мл	1	0,8	0,8
NaCl, 1 %-й розчин, мл	---	0,2	---
CuSO4, 5 %-й розчин, мл	---	---	0,2
Слина (розведення 1:2), мл	1	1	1
Крохмаль, 1 %-й розчин, мл	2	2	2
Забарвлення після додавання йоду

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Інгібітори ферментів широко використовуються в медицині в якості лікарських засобів, зокрема ацетилсаліцилова кислота (аспірин) – інгібітор циклооксигенази (простагландинсинтази) використовується як протизапальний препарат, трасилол – інгібітор трипсину та контрикал – інгібітор протеїназ (зокрема калікреїнів) використовуються при панкреатиті, алопуринол – інгібітор ксантиноксидази застосовується при подагрі, тощо.

Дослід 2. Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

При проведенні нервового збудження відбувається зростання концентрації іонів Са²⁺ у нервовому закінченні, що є сигналом для активації виходу ацетилхоліну у синаптичну щілину, взаємодії його з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщепленням ацетилхолінестеразою. Окрім цього, іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що затратилась на титрування є мірою активності ферменту.

Матеріальне забезпечення: 0,5 % розчин CaCl₂, 0,05 % розчин фосфаколу, 5 % розчин CuSO₄, 2 %-й розчин ацетилхоліну, NaOH 0,1 М, розчин фенолфталеїну, сироватка крові, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірок	№ пробірки
	1	2	3
Сироватка крові, мл	0,5	0,5	0,5
0,5 % розчин CaCl2, крапель	---	5	---
0,5 % розчин фосфаколу, крап.	---	---	5
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
2 % розчин ацетилхоліну	1,5	1,5	1,5
Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель	2	2	2
Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування, мл

Зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна ацилхолінестераза (КФ 3.1.1.8), яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін (КФ 3.1.1.7).

У нормі активність холінестерази в сироватці крові становить 44,4 – 94,4 мккат/л (колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду).

Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишківника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібітори ацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки – ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.