Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО ДИСЦИПЛИНЕ

«ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ»

для студентов II курса медицинского института

специальностей 31.05.01 «Лечебное дело» и 31.05.02 «Педиатрия»

Петрозаводск

Издательство ПетрГУ

2015

УДК

ББК

В___

Судакова Н.М.

К.б.н., доцент кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии

Галибина Н.А.,

к.б.н., зав. Лаборатории аналитической Института Леса КарНЦ РАН

Печатается по решению редакционно-издательского совета

Петрозаводского государственного университета

Настоящее учебное пособие содержит лабораторный практикум по методам выделения и разделения различных классов соединений, а также их количественному определению по курсу «Введение в лабораторную диагностику», рекомендуемые студентам для выработки практических навыков по установлению структуры основных классов низко- и высокомолекулярных соединений и формированию навыков планирования и выполнения лабораторного эксперимента.

Учебное пособие предназначено для студентов медицинских, биологических специальностей и направлений бакалавриата, магистрантов.

Лабораторная работа № 1: ИдентификациЯ аминокислот методом распределительной хроматографии

Распределительная или жидко-жидкостная хроматография используется для разделения в частности высокополярных соединений, к которым относятся, например, аминокислоты. Разделение в этом методе основано на различном коэффициенте распределения компонентов образца между стационарной и подвижной жидкими фазами. Процессы распределения между жидкими фазами по сравнению с адсорбционными являются более чувствительными к самым незначительным структурным изменениям; поэтому этот метод успешно используется для разделения соединений одного гомологического ряда.

В данной работе разделение смеси аминокислот осуществляется за счет различного распределения (растворимости) между двумя жидкими фазами: стационарной фазой - водой и подвижной фазой - н-бутанол, уксусная кислота, вода в соотношении 4:1:1. Носителем стационарной фазы является силикагель (готовые пластинки ² Silufol² ). Детекция аминокислот на пластинке производится с помощью нингидрина, который дает цветную реакцию с a-аминокислотами.

Для разделения используются водные растворы аминокислот (небольшое количество аминокислот растворяют в 0,5 - 1мл дистиллированной воды в микростаканчике). На пластинку ²Silufol², обработанную паром в точки тонким капилляром наносят приготовленные растворы исследуемого образца и свидетелей (стандарты аминокислот). Диаметр пятна не должен превышать 2мм. Точки нанесения должны отстоять от краев пластинки не менее чем на 1см.

После нанесения пробы пластинки помещают в камеру, в которую за 10 - 15мин до начала хроматографирования следует налить примерно 24 мл смеси н-бутанол - уксусная кислота - вода в сотношении 4:1:1. Для достижения лучшего разделения аминокислот в данной работе используется двухкратное хроматографирование. После того, как фронт подвижной фазы (системы растворителей) поднимется на 10 -12 см, пластинка вынимается из камеры, подсушивается в вытяжном шкафу и хроматографируется повторно в тех же условиях.

Пластинка, вынутая из камеры, вновь высушивается в вытяжном шкафу и опрыскивается 0,2% раствором нингидрина (из пульверизатора).

После опрыскивания пластинка помещается в сушильный шкаф при 110-120°С. Аминокислоты детектируются в виде розовато-лиловых пятен.

Совпадение значений R_f исследуемого образца и свидетеля говорит об их идентичности.

Зарисуйте расположение пятен аминокислот и запишите величины R_f аминокислот.

Какие виды хроматографии используются при выполнении данной работы? Нужные слова подчеркните.

а) жидко-жидкостная, твердо-жидкостная, газожидкостная.

б) адсорбционная , ионообменная, ситовая (гель-хроматография).

в) колоночная, в тонком слое, бумажная.

Лабораторная работа № 2: анализ двухкомпонентных смесей

(на примере аминокислот)

В основе количественного определения состава смесей спектрофотометрическими методами лежит правило аддитивности: поглощение света раствором любой смеси является суммой поглощений отдельных компонентов.

При условии выполнения закона Ламберта-Бугера-Бера

D = ε · c · l (1)

где D – оптическая плотность

ε - коэффициент экстинциии

c - концентрация соединения в растворе (моль/л)

l - толщина слоя (кюветы) раствора в сантиметрах

и известных коэффициентах экстинции для каждого вещества в отдельности измеряемая оптическая плотность смеси при любой длине волны может быть найдена по уравнению:

D = (ε₁ · c₁ + ε₂ · c₂ + ε₃ · c₃ + …) · l (2)

Если в смеси содержится n компонентов, то измерения оптической плотности должны быть проведены при n различных длинах волн и, соответственно, должны быть решены n уравнений. Этот метод особенно широко применяется для анализа двухкомпонентных систем. Две длины волны выбираются таким образом, чтобы при одной из них интенсивности поглощения соединений сильно различались, а при другой оба вещества имели бы достаточно сильное поглощение. Существенно также, чтобы выбранные длины волн находились на участках спектральных кривых с малым наклоном (обычно в точках, близких к максимумам и минимумам полос), поскольку, когда небольшие изменения длины волны сопровождаются большими изменениями оптической плотности, точность определения значительно снижается.

В данной работе предлагается проанализировать смесь двух аминокислот, входящих в состав белков – триптофана (α – амино - β-индолилпропионовая кислота) и тирозина ( α - амино-β-(пара-гидроксифенил) пропионовая кислота).

Эти аминокислоты имеют избирательное поглощение в области 220 – 350 нм.

Тирозин λ при 294 нм (ε²⁹⁴ = 2550 ) в 0.1 М растворе NaOH

Триптофан λ при 281 нм (ε²⁸¹ = 5000 ) в 0.1 М растворе NaOH

Кривые поглощения этих аминокислот пересекаются в точках 294 и 257 нм (изобестические точки), в в которых ε_тир = ε_три. Тогда из уравнения (2) можно легко определить сумму молярных концентраций:

с = с₁ + с₂ = D²⁹⁴ / ε²⁹⁴ = D²⁵⁷ / ε²⁵⁷ ( 3 )

Измерив интенсивность еще при одной длине волны λ, находят содержание каждой аминокислоты в смеси:

C₁ = (D^λ – ε₂^λ · c ) / (ε₁^λ – ε₂^λ ) ( 4 )

Индекс 1 относится к тирозину, 2 – к триптофану.

Порядок выполнения работы

1. Приготовьте растворы аминокислот в 0.1 М растворе NaOH следующих концентраций: триптофан – 2·10^-4 М, тирозин – 3·10^-4 М.

2. Запишите на спектрофотометре индивидуальные спектры тирозина и триптофана в области 220 – 350 нм.

3. Рассчитайте с помощью формулы (1) коэффициент экстинции тирозина при 281 нм.

4. Смешайте исходные растворы триптофана и тирозина в отношении 3: 2, соответственно и запишите на спектрофотометре спектр их смеси.

5. Рассчитайте суммарную концентрацию аминокислот в их смеси по уравнению (3), используя значение оптической плотности раствора аминокислот при 294 нм.

6. Рассчитайте с помощью уравнения (4) концентрацию каждой аминокислоты, используя значение оптической плотности смеси при 281 нм.

7. Зная точное значение концентраций тирозина и триптофана, определите ошибку измерения.