Лабораторная работа № 3: гель - хроматография

Гель-хроматография (гель-фильтрация) – фракционирование смеси компонентов по размерам молекул при прохождении их через гели с определенной величиной пор, такие как сефадексы, биогели, агарозные гели и т.д.

Принцип метода заключается в том, что при пропускании через колонку с гелем, имеющим сетчатую структуру, раствора, содержащего несколько веществ, наибольшей скоростью продвижения обладают компоненты, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы неподвижной фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь пор геля, продвигаются по колонке медленнее и вымываются позднее.

Разделение веществ может быть описано классическим уравнением хроматографии

V_R = V₀ + KV_S

где V_R – объем элюирования растворенного вещества

V₀ – мертвый ( V_m ) или свободный объем колонки ( объем растворителя между частицами геля, объем подвижной фазы)

V_S – объем растворителя, заключеннного в порах геля

К – коэффициент распределения растворенного вещества, равный отношению концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах.

Можно рассматривать KV_S как объем растворителя в неподвижной фазе доступный для растворенного вещества.

Так как подвижная и неподвижная фазы имеют одинаковый состав, то К вещества, для которого обе фазы одинаково доступны, равен единице. Эта ситуация реализуется для молекул с самыми малыми размерами, которые проникают во все поры и поэтому движутся через колонку наиболее медленно. Их удерживаемый объем равен полному объему растворителя (V_t) в заполненной гелем части колонки

V_R = V₀ + KV_S = V₀ + 1V_S = V_t

Все молекулы, размеры которых больше размера пор геля, не могут попасть в них ( полная эксклюзия) и проходят по каналам между частицами. Они элюируются из колонки одним и тем же удерживаемым объемом, равным объему неподвижной фазы V₀. Коэффициент распределения для этих молекул равен нулю.

Полный объем растворителя в колонке V_t представляет собой сумму объемов подвижной и неподвижной жидких фаз

V_t = V_R = V₀ + V_S

Определение параметров колонки

Сухой сефадекс G-25 суспендируют в 200-кратном объеме дистиллированной воды и оставляют стоять в течение двух суток при комнатной температуре.

В стеклянную колонку в вертикальном положении с заглушкой внизу помещают небольшой кусочек стекловаты слоем толщиной 2-3 мм и слегка утрамбовывают. Медленно заливают суспензию сефадекса, и оставляют стоять колонку до тех пор, пока высота слоя геля не перестанет изменяться.

Вынимают заглушку, позволяют стечь воде до уровня над сефадексом около одного сантиметра и ставят ее на прежнее место. Осторожно под слой воды на поверхность геля с помощью пипетки вносят один миллилитр полунасыщенного водного раствора голубого декстрана и хлорида кобальта.

Вновь вынимают заглушку и после впитывания в гель разделяемой смеси (не допуская ее “высыхания”) начинают элюирование колонки дистиллированной водой, отбирая фракции по одному миллилитру.

Первым из колонки вымывается голубой декстран, объем элюции которого равен объему воды вне пор геля ( V₀ – мертвый или свободный объем колонки). Объем элюции хлорида кобальта равен объему воды находящейся в заполненном гелем пространстве (V_t – полный объем колонки).

Объем растворителя, заключенного в порах геля находят как разность

V_S = V_t – V₀

Объем части колонки, заполненной гелем (V_{колонки}) рассчитывают по формуле

V_{колонки} =  r²  h

Зная эти параметры колонки, можно приблизительно оценить пространство в геле недоступное даже для молекул воды и ионов

V = V_{колонки} - V_t

При наличии сефадексов G 25 и G 100 какой из них Вы бы выбрали для разделения а) обессоливания раствора низкомолекулярного белка с М 20 000, б) разделения белков с молекулярными массами 50 000 и 10 000?