Лабораторная работа № 5: определение неорганического фосфора в крови
Принцип метода:
Неорганический фосфат гидролизуется в кислой среде до фосфорной кислоты, которая образует окрашенный комплекс с молибдат-ванадатом аммония. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации неорганического фосфата.
Ход работы:
Построение калибровочной кривой
В опытные пробирки вносят стандартный раствор фосфора с концентрацией 800 мкг/мл в соответствии с таблицей.
Во все пробы добавляют объем дистиллированной воды согласно таблице 1.
Таблица.
|
№ пробы |
Объем стандартного раствора фосфора, мл |
Объем дистиллированной воды, мл |
Концентрация фосфора, мкг/мл |
E среднее |
|
1 |
0.05 |
2.45 |
4 |
|
|
2 |
0.1 |
2.4 |
8 |
|
|
3 |
0.15 |
2.35 |
12 |
|
|
4 |
0.2 |
2.3 |
16 |
|
|
5 |
0.25 |
2.25 |
20 |
|
|
6 |
0.3 |
2.2 |
24 |
|
|
7 |
0.35 |
2.15 |
28 |
|
|
кровь |
|
|
|
|
Затем в каждую пробирку добавляют по 2,5 мл раствора молибдат-ванадата аммония. Содержимое пробирок тщательно перемешивают.
В контрольную пробу добавляют 2,5 мл раствора молибдат-ванадата аммония и 7.5 мл дистиллированной воды. Раствор перемешивают.
Полученные растворы оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Пробы колориметрируют при длине волны 440 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм против контрольной пробы.
Полученные значения оптических плотностей растворов вносят в таблицу.
Строят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс концентрацию фосфора, а по оси ординат оптические плотности растворов.
Определение фосфора в крови
В центрифужную пробирку вносят 3 мл дистиллированной воды, 1 мл крови и 1 мл 20 %-го раствора трихлоруксусной кислоты; смесь перемешивают и оставляют на 10 минут (для осаждения белков). Пробы центрифугируют 5 минут при 1500 об/мин и 1 мл надосадочной жидкости (супернатанта) отбирают в биохимическую пробирку. Затем добавляют 6.5 мл дистиллированной воды и 2,5 мл раствора молибдат-ванадата аммония. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре.
Пробу колориметрируют при длине волны 440 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм против контрольной пробы. Значение оптической плотности раствора вносят в таблицу в строчку «кровь».
По калибровочной кривой находят концентрацию фосфора в пробе крови (А), а затем проводят расчеты по формуле:
где А – количество фосфора в 1 мл крови, определенное по калибровочной кривой;
А
5
- количество фосфора в 1 мл крови;
100 –коэффициент пересчёта фосфора на 100 мл крови; 1000 – коэффициент для перевода мкг в мг.
В Ы В О Д Ы :
Вопросы к коллоквиумам и примеры вариантов заданий Коллоквиум № 1. Аминокислоты, пептиды и белки
Аминокислоты
Классификация. Основные аминокислоты, входящие в состав белков.
Стереоизомерия. Хиральность. Понятие о поляризованном свете (знак его вращения). Ассиметрический атом углерода. Энантиомеры, диастереомеры, рацематы. Аминокислоты D и L рядов.
Кислотно-основные свойства аминокислот, изоэлектрическая точка.
Химические свойства: образование эфиров, галогенангидридов, N-алкильных и ацильных производных, оснований Шиффа.
Реакции Ван-Слайка (дезаминирование), Серенсена (формольное титрование), образование ДНФ- (метод Сэнджера) и ФТГ-(метод Эдмана) производных. Трансаминирование (переаминирование), декарбоксилирование. Реакции in vitro и in vivo.
Пептиды и белки
Структурная организация пептидов и белков.
Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура.
Кислотный и ферментативный гидролиз белков.
Установление первичной структуры (методы Сэнджера и Эдмана)
Синтез пептидов (активация и защита функциональных групп)
Пространственное строение пептидов и белков. Строение пептидной группы. α-Спираль и β-структура. Глобулярные и фибриллярные белки. Простые и сложные белки.
Типы связей в пептидах и белках: ковалентные (пептидные, изопептидные, дисульфидные и другие), ионные, водородные, гидрофобные. Денатурация (обратимая и необратимая).
Физико-химические методы исследования, аминокислот, пептидов и белков.
Электрофорез.
Поляриметрия.
Хроматография: газовая, жидкостная; бумажная, тонкослойная, колоночная, противоточное распределение; адсорбционная, ионообменная, эксклюзионная (ситовая, гель-хроматография), биоспецифическая (аффинная). Метод пептидных карт.
Спектроскопические методы исследования (электронная и инфракрасная спектроскопия) вторичной, третичной и четвертичной структуры, рентгеноструктурный анализ.
Ультрацентрифугирование.
Электронная микроскопия.
Спектроскопия комбинационного рассеяния.
Ядерный магнитный резонанс.
Масс-спектрометрия.
Фракционное осаждение белков (высаливание, разделение при низких значениях ионной силы, изоэлектрическое осаждение, с помощью органических растворителей, аффинное осаждение).
Диализ.
Синтез пептидов и белков с использованием стадий активации и защиты функциональных групп
Цветные реакции белков
Билет №
Напишите конечные продукты, образующиеся при
а. Взаимодействии валина с раствором соляной кислоты
б. Декарбоксилировании фенилаланина
в. Дезаминировании аланина по типу элиминирования
Напишите реакцию переаминирования/трансаминирования изолейцина с α-кетоглутаровой кислотой
Приведите структуру трипептида Фен-Асп-Гли и определите в нем N-концевую аминокислоту методом Сэнджера.
Укажите типы связей стабилизирующих третичную структуру белка.
Приведите методы исследования вторичной структуры белка.