2.1.2. Определение параметров Wm и Km из экспериментальных данных

Из данных по стационарной кинетике величины W_mиK_mопределяются на основе линеаризации уравнения Михаэлиса:

1. Метод двойных обратных координат

(2.10)

2. Метод Скэтчарда (Иди-Хофсти)

(2.11)

2.1.3. Метод графов при анализе кинетических схем

Граф–совокупность точек (вершин) и соединяющих их линий (дуг, ветвей, ребер).

Кинетический граф строят следующим образом. Каждую часть модели изображают точкой (вершиной графа). Те части, между которыми происходит обмен веществ, соединяют линией (дугой графа); стрелки показывают направление транспорта вещества. Перенос химического вещества или соответствующего фрагмента Xиз “источника”iв “сток”j, изображенный на графе стрелкойij, характеризуется определенной скоростьюv_ij(X) (количество веществаX, переходящим изiвjза единицу времени):

(2.12)

Часто скорость переноса вещества можно представить в виде формулы:

(2.13)

где - коэффициент переноса, не зависящий от. Это число характеризуетвес(величину)ветви. Общее изменение количества веществаXв произвольной частиiможно представить в виде суммы прихода и ухода вещества:

(2.14)

Система линейных дифференциальных уравнений (2.14) для данного графа может быть записана в матричном виде и решена методами линейной алгебры (через нахождение собственных значений и собственных векторов соответствующей матрицы).

2.1.4. Определение концентрации активных центров

Максимальная скорость реакции определяется произведением каталитической константы и абсолютной концентрации активных центров:

(2.15)

Для определения концентрации активных центров известно несколько подходов, например:

1. определение по содержанию белка, если известно, что молекула фермента содержит только один активный центр и в растворе присутствует только один фермент:

(2.16)

где P – концентрация белка,m– молярная масса белка;

2) путем необратимого ингибирования:

(2.17)

2.1.5. Лимитирующие стадии

Большинство экспериментальных кинетических исследований ферментов выполнено в режиме стационарной кинетики. Максимальная скорость ферментативной реакции характеризует самый медленный кинетический процесс, протекающий в активном центре катализатора. Поэтому изучение лимитирующих процессов представляют наибольший интерес.

Существует несколько подходов для идентификация лимитирующих стадий реакции, некоторые из них представлены ниже:

1. Использование субстратов с различной структурой и различной реакционной способностью. Если заметно различающиеся субстраты характеризуются одним и тем же значениемk_кат– вероятно реакция идет через образование промежуточного соединения, структура которого является общей для всех исследуемых субстратов, и превращение этого интермедианта лимитирует скорость каталитического процесса.

2. Нестационарная кинетика. Этот подход является общим для идентификации механизма реакции.

2.2. Типичные зависимости начальной стационарной скорости реакции от концентрации субстрата

На рис. 2.1 показаны известные зависимости начальной стационарной скорости от концентрации субстрата: “классическая” кривая Михаэлиса (a) и кривая с экстремумом (b) или с ускорением (c) на начальном этапе. Механизмы, приводящие к “немихаэлисовским” зависимостям скорости реакции, связаны с взаимодействием фермента с несколькими молекулами субстрата. Отклонения могут быть вызваны ингибированием или активацией реакции избытком субстрата, а также аллостерическими эффектами.

Рис. 1.2.Известные зависимости начальной стационарной скорости от концентрации субстрата.