Занятие № 11 превращение микроорганизмами соединений углерода

Цель: Изучить особенности различных видов брожения и морфологию их возбудителей.

Задачи:

1. Изучить механизм брожения пектиновых веществ и морфологию его возбудителей.

2. Изучить особенности превращения целлюлозы в аэробных условиях и морфологию его возбудителей.

3. Изучить особенности брожения целлюлозы в анаэробных условиях и морфологию его возбудителей.

Материалы и оборудование. Накопительные культуры микроорганизмов, осуществляющих брожение пектиновых веществ, разложение клетчатки, микроскопы, оборудование для окрашивания препаратов.

Основные понятия. Маслянокислое брожение, пектин, пектиназа, целлюлоза, целлюлаза.

Ход работы

Задание № 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в брожении пектиновых веществ, сделать рисунок. Для выделения пектиноразрушающих бактерий используют льняную или крапивную питательную среду. Из стеблей готовят снопики длиной 5-7 см, помещают в пробирки, заливают водопроводной водой и кипятят 10-15 мин. Кипячением удаляют экстрактивные вещества, которые мо­гут служить источником углерода для сопутствующих маслянокислых бактерий. Воду сливают, снопики заливают новой пор­цией воды, пробирки плотно закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин. Когда пробирки остынут, среду заражают кусочком свежей соломы льна. Зараженные пробир­ки помещают в термостат при температуре 35°С. Через 3-5 суток начинается процесс пектинового брожения, жидкость мутнеет и пенится.

Микроскопирование. Для изучения морфологии бактерий пектинового броже­ния готовят прижизненные пре­параты. Снопик вынимают из пробирки, отжимают каплю жидкости на пред­метное стекло, готовят фиксированные и прижизненные препараты (в растворе Люголя). На препа­рате видны клетки Clostridium pectinovorum и Clostridium fel­sineum, вегетативные и спорулирующие, окрашенные иодом на гранулезу в темно-синий цвет (рис. № 9 приложения).

Задание № 2. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки (анаэробные условия), сделать рисунок. Для получения накопительной культуры анаэробных форм целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Имшенецкого. В круглую плоскодонную колбу вносят около 1-2 г фильтровальной бу­маги или вату, и заливают до­верху средой следующего состава (в г/л): KNH₄HPO₄ – 1,0; КН₂РО₄ – 0,5; К₂НРО₄ – 0,5; СаС1₂ – 0,03; пептон – 5; MgSO₄ – 0,4; СаСО₃ – 2,0; NaCl – 0,5; MnSО₄ и FeSO₄ следы; рН среды 7,0-7,4. Среду заражают небольшим количеством почвы, закры­вают колбу корковой пробкой с отверстием для выхода газов и ставят в термостат при 30-35°С. Элективные условия в данном случае определяются при­сутствием целлюлозы – источника углерода, который может потребляться только специфичными целлюлозоразлагающими бактериями, имеющими фермент целлюлазу, а также анаэроб­ными условиями. Пептон, введенный в среду в небольшом количестве, сильно стимулирует процесс брожения. Через 7-10 сут начинается брожение целлюлозы, которое длится 2-3 недели. Фильтровальная бумага по мере сбражива­ния слегка ослизняется, желтеет и постепенно разрушается.

Микроскопирование. Микроскопируют кусочек бумаги. В анаэробных условиях процесс разложения клетчатки осуществляется бактериями рода Clostridium. Cl. omelianskii (рис. № 9 приложения) имеет вид длинных палочковидных клеток до 8 мкм, в старых культурах длина около 10-15 мкм, располо­жены одиночно или соединены в нити. Споры шаровидные, формируются на конце клетки, клетка принимает форму барабанной палочки. Выделяется из почвы и воды. Оптимальная температура роста 30-35°С.

Задание № 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки (аэробные условия), сделать рисунок. Для выделения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Гетчинсона. Состав среды (г/л): К₂НРО₄ – 1,0; NaCl – 0,1; СаСl₂ – 0,1; FeCl₃ – 0,01; MgSO₄ – 0,3; NaNO₃ – 2,5; рН среды 7,2-7,3. Стерильную питательную среду разливают в конические колбы слоем 1,5-2,0 см, среду заражают комочком почвы и на поверхность среды опускают складчатый фильтр конусом вверх. Колбы за­крывают ватными пробками и помещают в термостат при тем­пературе 25-30°С на 10-14 суток. На границе питательной среды и воздуха создаются оптимальные условия питания и аэробного дыхания клетчаткоразрушающих бактерий. В этой зоне наиболее интенсивно идет процесс разрушения фильтро­вальной бумаги. Через 8-10 суток на фильтре появляются желто-оранжевые пятна колоний клетчаткоразрушающих бактерий. Бумага разлагается, и фильтр постепенно оседает на дно.

Микроскопирование. Из разрушенных масс клетчатки в колбе микробиологи­ческой петлей готовят мазок в капле жидкости. Чаще всего на препарате обнаруживаются представители порядков Мухоbacteriales и Cytophagales группы скользящих бактерий (рис. № 10 приложения). Род Cytophaga представлен длинными палочковидными клетками с заостренными концами, несколько изогнутыми (2-10 мкм). Колонии желтого, оран­жевого, коричнево-бурого цвета, гладкие, слизистые.

Род Сellvibrlo представлен мелкими, слегка изогнутыми подвижными палочками (2-4 мкм). Колонии охряножелтые слизистые. Рол Cellfalcicula имеет вид коротких толстых изогнутых палочек с заостренными концами (2,0*0,7 мкм).

Род Sorangium в молодой культуре имеет вид толстых слегка изогнутых палочковидных клеток с закруглен­ными концами (2-5 мкм). При старении культуры образуются плодовые тела, состоящие из микроцист. Палочковидные клетки укорачиваются, покрываются толстой оболочкой, приобретая неправильные очертания. Колонии ярко-оранжевого, фиолетового цвета.

Род Polyangium представлен почти прямыми палочковидны­ми клетками с закругленными концами (3,5-8 мкм). При ста­рении формируются овальные микроцисты, которые соединяют­ся и плодовые тела грушевидной формы. Плодовые тела желто­го, оранжевого цвета, сидят непосредственно на субстрате.

Помимо бактерий, в аэробном разрушении клетчатки участвуют плесневые грибы Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Trichoderma и некоторые актиномицеты.

Контрольные вопросы см. занятие № 10.