Занятие № 3

ОКРАСКА ВКЛЮЧЕНИЙ, КАПСУЛ И ЭНДОСПОР, ОКРАСКА ПО ГРАМУ

Цель: Изучить методы окраски спор, капсул и включений бактериальной клетки; изучить ее цитологические свойства на примере окраски по Граму.

Задачи:

1. Обнаружить включения полифосфатов (волютин) в клетках дрожжей.

2. Обнаружить липидные гранулы в клетках дрожжей.

3. Обнаружить гликогеноподобные полисахариды в клетках дрожжей.

4. Обнаружить капсулы бактериальной клетки методом негативного контрастирования (на примере Azotobacter).

5. Произвести дифференциальную окраску спор и цитоплазмы по методу Ожешки.

6. Произвести окраску бактерий по Граму.

Материалы и оборудование. Предметные стекла, бактериологическая пет­ля, спиртовка, фильтровальная бумага, кристаллиза­тор с мостиком для препаратов, промывалка с водой, микроскоп. Водные растворы красителей – фуксина, метиленового синего, генцианвиолета, карболовый фуксин Циля, судан III. Иммерсионное масло, серная кислота 1%, тушь, соляная кислота 0,5%, раствор Люголя. Культуры Вас.subtilis, Вас.mycoides, S.cerevisiae, E.coli.

Основные понятия. Муреин, волютин, нуклеоид, гликоген, капсулы, клеточная стенка, полисахариды, полифосфаты, метахроматические зерна, монотрихи, перетрихи, лофотрихи, бациллярная форма, клостридиальная форма, плектридиальная форма, экзина, интина, метахромозия.

Ход работы

Задание № 1. Обнаружить включения полифосфатов (волютин) в клетках дрожжей. Волютин в клетках грибов и дрожжей локализован в вакуолях, у бактерий и актиномицетов в цитоплазме. Является запасным фосор- и азотсодержащим веществом, производным нуклеиновых кислоты. Характерное свойство – метахромозия, т. е. способность приобретать иной цвет, чем окрашивающие его вещества.

Окраска волютина по методу Омелянского. На предметном стекле готовят тонкий мазок из культуры микроорганизма, высушивают на воздухе, фиксируют на пламени, окрашивают карболовым фуксином 30-40 с и промывают водой. Дифференцируют, погружая его в склянку с 1%-ным раствором серной кислоты на 20-30 с и немедленно промывают водой. Серная кислота обесцвечивает цитоплазму, а зерна волютина остаются окра­шенными фуксином. Препарат докрашивают метиленовым си­ним (1:40) 20-30 с, промывают водой, высушивают на воз­духе и микроскопируют. На пре­парате зерна волютина окрашены в красный цвет, цитоплазма клетки – в голубой (рис. № 1, 2 приложения).

Задание № 2. Обнаружить липидные гранулы в клетках дрожжей. Резервные липиды у дрожжей и мицелиальных грибов представлены нейтральным жирами; у бактерий эту функцию выполняет оксимасляная кислота.

Окраска жировых включений. К капле водной взвеси микроорганизмов на предметном стекле добавляют каплю раствора судана III, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, пользуясь объективом ВИ-40. Судан III растворяется в жиро­вых включениях бактериальной клетки, окрашивая их в оран­жево-красный цвет. Цитоплазма клетки остается бесцветной.

Задание № 3. Обнаружить гликогеноподобные полисахариды в клетках дрожжей. Запасные вещества углеводной природы в клетках бактерий накапливаются в виде гранул. Гранулеза – крахмалоподобное вещество, при взаимодействии с реактивом Люголя окрашивающееся в синий цвет; гликоген – полисахарид окрашивающийся в таких же условиях в красно-коричневый цвет. Гранулеза встречается только в клетках прокариот.

Окраска гликогена и гранулезы. К капле суспензии микроорганизма на предметном стекле добавляют каплю слабого раствора Люголя, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, пользуясь объективом ВИ-40.

Задание № 4. Обнаружить капсулы бактериальной клетки методом негативного контрастирования (у Azotobacter).

Выявление капсул на негативном прижизненном препарате. На хорошо обезжиренное предметное стекло микробиологи­ческой петлей наносят большую каплю черной туши и в нее вносят каплю исследуемой культуры микроорга­низма, распределяют при помощи предметного стекла и высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой. На темном фоне туши выявляются прозрачные зоны капсул вокруг резко очерчен­ных клеток (рис. № 8. приложения).

Задание № 5. Произвести дифференциальную окраску спор и цитоплазмы (у Вас. mycoides).

Метод Ожешки. Высушенный препарат заливают 0,5% соляной кислотой и подогревают 2 минуты до появления паров. Мазок промывают водой, накрывают фильтровальной бумагой и заливают карболовым фуксином Циля. Окрашивают в течение 5 минут при нагревании до появления паров. Промывают водой и дифференцируют в 1% серной кислоте 0,5-1 мин (время определяется опытным путем). Промывают водой и докрашивают в течение 30 с метиленовым синим. Еще раз промыва­ют, подсушивают и микроскопируют. Споры окрашиваются в розовый цвет, цитоплазма – в синий (рис. № 2 приложения).

Задание № 6. Произвести окраску бактерий по Граму. Различие в химическом составе клеточных стенок бактерий сказывается на их способности окрашиваться по Граму. По этому признаку бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные (таб. № 3). Оболочки грамположительных содержат больше полисахаридов, муреина и тейховых кислот; оболочки грамотрицательных имеют многослойную структуру с высоким содержанием липидов (липопротеидов и липосахаридов). Грамположительные микроорганизмы при окрашивании образуют нерастворимое в спирте соединение иода с основным красителем, у грамотрицательных это соединение растворяется в спирте.

Окраска по Граму. На предметное стекло наносят и далее одновременно обрабатывают сразу три мазка: из культуры бактерий заведо­мо грамположительной, из культуры бактерий заведомо грамотрицательной и между ними мазок из культуры исследуемого микроорганизма. Используют молодые односуточные культуры.

Мазки высушивают на воздухе, фиксируют на пламени го­релки и окрашивают 1%-ным водным раствором генцианвиоле­та 1мин. Краситель смывают раство­ром Люголя и заливают мазки этим же раствором на 1 мин. Препарат промывают водой и дифференцируют в склянке с 95%-ным этанолом (0,5-1,0 мин). После дифференциации мазка препарат немедленно тща­тельно промывают водой и докрашивают дополнительным кра­сителем – 0,1%-ным водным раствором фуксина 2-3 мин. Пре­парат окончательно промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с масляной иммерсией. На препарате грамположительные бактерии окрашиваются в сиренево-фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розово-ма­линовый (рис. № 2 приложения).

Таблица № 3. Отношение бактерий к окраске по Граму

Грамположительные	Грамотрицательные
Staphyloccocus aureus	Escherichia coli
Streptococcus	Proteus vulgaris
Bacillus subtilis	Pseudomonas aeruginosa
Sacharomyces	Shigella sp.

Контрольные вопросы и задания

1. Строение оболочки бактериальной клетки. Образование капсул.

2. Отношение бактерий к окраске по Граму. Отличительные особенности грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

3. Клеточная мембрана и внутриклеточные мембранные структуры.

4. Ядерный аппарат, состав, организация и репликация.

5. Рибосомы, газовые вакуоли и другие органеллы бактерий; их значение.

6. Включения бактериальной клетки (полисахариды, полифосфаты, липиды, включения серы).

7. Способы размножения бактерий. Спорообразование у бактерий.

8. Жгутики. Движение бактерий. Таксис.

Вопросы для самостоятельного изучения

1. Наследственные факторы микроорганизмов.

2. Механизмы, вызывающие изменение генетической информации микроорганизмов.