5. Определение белка по методу Бредфорд

Метод основан на образовании окрашенного в синий цвет комплекса красителя кумасси ярко - голубого G-250 с белком.

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,10 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорд, перемешивают и оставляют при комнатной температуре в течение одинакового времени в интервале от 2 до 60 мин. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 595 нм.

6. Определение белка по методу Седмака

Принцип метода тот же, что и в методе Бредфорд. Метод применим для определения суммарного количества белков и полипептидов с молекулярной массой более 3000 дальтон.

1,5 мл раствора препарата, содержащего 0,010-0,150 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 1,5 мл раствора кумасси ярко - голубого G-250, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение одинакового времени в интервале от 5 мин до 3 ч. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при двух длинах волн: 620 и 465 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата и кумасси ярко - голубого G-250.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,005 до 0,150 мг стандартного образца белка, измеряя оптическую плотность растворов при 620 и 465 нм и откладывая по оси ординат отношение оптических плотностей (D620/D465), по оси абсцисс - соответствующие значения концентрации растворов стандартного образца белка.

7. Определение белка по методу Флореса

Метод основан на образовании окрашенного в синий цвет комплекса белка с красителем бромфеноловым синим.

Комплекс устойчив в течение 8 ч.

0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,08 мг испытуемого белка, помещают в пробирку, прибавляют 0,9 мл раствора бромфенолового синего, выдерживают при комнатной температуре в течение одинакового времени в интервале от 10 мин до 8 ч. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 610 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без препарата.

Калибровочный график строят в пределах концентраций от 0,01 до 0,08 мг стандартного образца белка (почти прямолинейная зависимость), измеряя оптическую плотность растворов при 610 нм.

II.Спектрофотометрический метод определения белка

Спектрофотометрический метод определения белка основан на способности ароматических аминокислот (триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм.

Условно принято считать, что при концентрации белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют растворитель препарата.

Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05 до 2 мг/л.

Определению белка данным методом мешают присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов (более 20%). В этом случае оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух длинах волн - 260 и 280 нм; содержание белка Х (мг/мл) рассчитывают по формуле Калькара:

Х = 1,45 х D280 - 0,74 х D260.