2. Определение содержания витамина а

в жирах рыб и морских млекопитающих

Около 1,5 г жира (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 0,1 г аскорбиновой кислоты, 30 мл свежеприготовленного 10% спиртового раствора едкого кали и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин при температуре кипения смеси. Содержимое колбы тотчас охлаждают, прибавляют 50 мл воды, переносят в делительную воронку вместимостью 250 мл и трижды извлекают эфиром для наркоза: первый раз 50 мл, второй и третий раз по 30 мл. Объединенные эфирные извлечения промывают сначала 30 мл воды, затем 50 мл 4% раствора едкого кали и снова водой от 30 до 40 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (проба с фенолфталеином). Промытые эфирные извлечения медленно фильтруют через бумажный фильтр с 8 г безводного натрия сульфата в колбу для отгона. Фильтр с натрия сульфатом 3 раза промывают эфиром по 10 мл, который фильтруют в ту же колбу. Эфир отгоняют в токе азота на водяной бане при температуре не выше 40 град. С. Остаток растворяют в небольшом объеме хлороформа для наркоза и разбавляют тем же хлороформом так, чтобы в 1 мл раствора содержалось около 30 ME витамина А; 0,4 мл полученного раствора переносят в кювету фотоэлектроколориметра с толщиной слоя 10 мм и быстро прибавляют 4 мл хлороформного раствора сурьмы хлорида, содержащего 2% уксусного ангидрида. Измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны около 620 нм. Показание прибора отмечают не позднее чем через 5 с после прибавления в кювету хлороформного раствора сурьмы хлорида.

По калибровочному графику находят содержание витамина А в международных единицах в 1 мл испытуемого раствора.

Содержание витамина А в 1 г жира в международных единицах (МЕ) (X) вычисляют по формуле:

СV

Х = ----,

а

где С - содержание витамина А в 1 мл раствора, найденное по калибровочному графику, в международных единицах (МЕ); V - разведение в миллилитрах; а - навеска в граммах.

Примечания. 1. Построение калибровочного графика: около 0,1 г (точная навеска) раствора ретинола ацетата в масле активностью 100000 ME в 1 мл для инъекций с учетом фактического содержания витамина А разводят в хлороформе для наркоза таким образом, чтобы получить раствор, содержащий 100 ME витамина А в 1 мл. Затем из него готовят последовательные разведения с содержанием витамина А от 5 до 50 ME в 1 мл с интервалом 5 ME. Из каждого разведения отбирают по 0,4 мл раствора и проводят колориметрическую реакцию так же, как при анализе испытуемого раствора. Для построения калибровочного графика откладывают по оси ординат найденные значения оптической плотности, а по оси абсцисс - соответствующие им количества витамина А в 1 мл раствора в международных единицах.

При смене реактивов (особенно раствора сурьмы хлорида) калибровочный график проверяют, используя для этого свежеприготовленные хлороформные растворы препарата витамина А, применяемого в качестве эталонного раствора.

2. Приготовление хлороформного раствора сурьмы хлорида, содержащего 2% уксусного ангидрида: 230 г сурьмы треххлорной помещают в колбу и растворяют в 1 л хлороформа для наркоза при нагревании на водяной бане при температуре около 40 град. С. Колбу закрывают притертой пробкой и оставляют на ночь. Прозрачную часть раствора сливают в мерный цилиндр вместимостью 1 л, прибавляют 2% (по объему) уксусного ангидрида, переносят в банку оранжевого стекла, перемешивают и закрывают притертой пробкой. Раствор годен для анализа через сутки после приготовления в течение 42 сут.