52

ЗМІСТ

«Сендвіч» - варіант ІФА для визначення антигенів 38

У У У У 39

.У...У .У»».У> 1 39

Визначення пухлинних маркерів 42

Системи посилення сигналу ІФА 45

Імуножроматої рафічннй аналіз 46

Імуної існлімічннй аналіз 48

2. Варіанти, засновані на гальмуванні. У цьому випадку на першому етапі аналізу антитіла, що досліджуються, або антигени приєднуються до міченого вільного реагенту (кон'юганта). Завдяки цьому на наступному етапі спостерігається га­льмування зв'язування міченого реагенту з компліментарним іммобілізованим лігандом. Інтенсивність розвитку хромогенної реакції у даних варіантах аналізу (як і в попередніх) зворотно пропорційна концентрації молекул, що досліджу­ються. Чутливість цих методів визначається такими ж чинниками, що і в пер­шому варіанті.

3. Варіанти, засновані на прямій імунометрії. У цій групі методів використову­ється здатність іммобілізованого на твердій фазі реагенту (антитіла або антиге­ни) виборчо зв'язуватися з компліментарними молекулами із зразка, що дослі­джується. Кількість молекул (а відповідно і концентрація цієї речовини в зра­зку), що зв'язалися, оцінюється за скріпленням компліментарного міченого реа­генту. Тим часом на поверхні твердої фази утворюється потрійний шар моле­кул, що компліментарно зв'язані. У цьому випадку інтенсивність сигналу, що індукується міткою, прямо пропорційна кількості компонента, що досліджуєть­ся, який приєднався до іммобілізованого реагенту. У подібних системах іммо­білізований і мічений реагенти повинні бути наявні в надмірній кількості від­носно речовини, що аналізується. Такі методи дуже чутливі, але й тут чутли­вість обмежується специфічною активністю ферменту, інтенсивністю сигналу й чутливістю реєструючих пристроїв. Системи посилення сигналу, з метою пода­льшого підвищення чутливості, частіше застосовуються з подібними методами, ніж із засобами, що засновані на гальмуванні або конкуренції.

Принципові схеми двох методичних варіантів ІФА, що широко застосову­ються, будуть представлені нижче.

«Сендвіч» - варіант іфа для визначення антигенів

Даний варіант ІФА набув поширення завдяки методичній простоті, високій чутливості і специфічності. За допомогою даного аналізу визначають наявність інфекційних антигенів у сироватці крові або плазмі, сечі, мазках або зскрібках. За його допомогою можна визначати концентрації ряду біомакромолекул у крові, наприклад гормонів, пухлинних маркерів (див. наступний розділ) та ін. (рис. 14). За допомогою подібних систем у клінічній практиці проводять, наприклад, аналіз:

1. поверхневого антигене вірусу гепатиту В - НЬзА^ (Нераііііз В 8шїасе Апіідеп). Цей антиген з'являється в сироватці перед проявом клінічних та лабораторних ознак хвороби печінки і при неускладненому гепатиті В та утримується протя­гом 2-8 тижнів. У 5-10% випадків НЬзАв зникає із сироватки ще перед вияв­ленням клінічних ознак хвороби;

2. ИЬеАв - антигену (Нераіііії В е-апіівеп). На відміну віл антигенів НВя та НВс, які маюіь визначену морфологічну структуру, антиген НВс - це розчинний по- ліпепіил. НЬеАд виявляється в сироватці через кілька діб після появи НЬвАв, причому тривалісіь його циркуляції іут коротиш, ніж НЬзА$.

* ***

У У У У

У У - антитіла

БОА

.У...У .У»».У> 1

Р р - антиген, що

досліджуспл»

- мічені ферментом щшпіп проїм того ж антигену

Рис. 14. "Сендвіч" ІФА визначення антигенів

НЬеАв е непрямий доказ реплікації вірусу в гепатоцитах (висока кореляція із вмістом вірусу в крові, рівнем вірусно! ДНК та ДНК-полімерази) і свідчить про високу інфекційність хворого. Уважають, що збереження НВе-ангигенемії понад 10-12 тижнів прогностично несприятливе і свідчить про можливість переходу гос­трого процесу в хронічний;

3. альфа-фетопротеїну (АФП) - застосовують для виявлення і моніторингу течії та ефективності терапії первинної карциноми, терміном, виявлення порушення розвитку плоду та ін. АФП - це глікопротеїн з молекулярною масою 70 Ша, який має 30% структурної гомології з альбуміном. Даний білок фізіологічно продукується в значних кількостях у жовтковому мішку, після його зникнення - печінкою плоду. Рівень АФП у сироватці крові вагітних фізіологічно підвище­ний. Але надмірне зростання вмісту АФП між 14-18 тижнями вагітності вка­зує на наявність порушення розетку нервової трубки плоду. Низький рівень АФП у цей період свідчить про синдром Дауна. Новонароджені мають підви­щений вміст АФП;

4. цілого ряду гормонів людини (пролакгину, тирео'щних гормонів, хоріонічного гонадотропіну людини (ЬСО), ФСГ, ЛГ та ін.).

Даний варіант ІФА може бути модифікований в «дот»-ІФА або в «метод ін­дикаторних смужок». Згідно зі схемою даного аналізу моноклональні антитіла або ж високоафінні поліклональні антитіла проти антигену, що визначається, сорбо- вані на поверхні твердої фази (наприклад, на поверхні лунок планшета) інкубу- ють із зразками, що досліджуються, негативним контролем і калібрувальними розведеннями антигену. Після промивки лунок буфером з детергентом (напри­клад, твіном-20), у них уносять розчин, що містить мічені ферментом антитіла проти того ж антигену. Після інкубації і чергової промивки в лунки планшета вносять хромогенний субстрат. Оптична щільність розчину субстрату змінюється пропорційно кількості пов'язаних з ферментом антитіл, а відповідно й кількості ан­тигену в зразках. Умова дії даного варіанта ІФА - наявність на молекулах анти­генів декількох епітопів для взаємодії антитіл. У разі наявності декількох ідентич­них епітопів на молекулі можливе застосування однакових моноклональних анти­тіл для сенсибілізації на поверхні твердої фази та для кон'юганта.