Основні принципи проведення твердофазного іфа

Практично будь-яка модифікація твердофазного ІФА заснована на таких принципах:

1. Значна кількість різних антигенів (білки, полісахариди, лінополісахарнди) здатні зв'язуватися із полістероловим пластиком. Це стосується й антитіл, що є бі­лки. Важливо при цьому те, що вони зберігають здатність зв'язувати антигени. Саме ця властивість використовується на першому етапі ІФА коли сенсибілізують антигени або антитіла на поверхні твердої фази. В адсорбованому стані антитіла й антигени не змиваються з поверхні твердої фази буфером, що містить деяку неве­лику кількість детергент, тоді як незв'язані реагенти легко відділяються таким розчином. У разі застосування комерційних наборів для ІФА фірми, які готують ці набори, беруть на себе даний етап аналізу і постачають набори з уже сенсибілі­зованими на твердій фазі (наприклад, на поверхні лунок планшета) антигенами або антитілами.

2. Далі в сенсибілізованих лунках планшета інкубують зразки, що дослі­джуються, і стандартні (калібрувальні) реагенти. У цьому випадку на поверхні твердої фази формуються імунні комплекси, що складаються з одного або декіль­кох шарів (залежно від виду аналізу). Компоненти, що не зв'язалися, на кож­ному етапі видаляють промивкою буфером з детергентом.

3. На наступному етапі аналізу з іммобілізованими імунними комплексами реагує штучний кон'югант «антитіло-фермент» або «антиген-фермент». Потрібно зазначити, що фермент і антитіло, що входять до складу кон'юганта, зберігак.гь нативні властивості, тобто фермент здатний взаємодіяти з субстратом і каталізу­вати специфічну хімічну реакцію, а антитіло може взаємодіяти з антигеном. Далі наступна інкубація з розчином субстрату приводить до розвитку кольорової ("се­кції Хід реакції при досягненні необхідної інтенсивності забарвлення зупиняють додаванням реагенту, що зупиняє реакцію, а результат аналізу оцінюється за оп­тичною щільністю розчину субстрату (візуально або за допомогою ІФА-рідеру). В окремих випадках («дот»-аналіз) відбувається фарбування безпосередньо твердої фази, оскільки застосовуються хромогенні типи субстрату, що дають нерозчинні продукти

Наведемо ферменти, субстрати, довжини хвиль, при яких вимірюють опти­чну щільність розчинів із продуктами реакції, які найбільш поширені в ІФА (табл.2)

Таблиця 2

Фермент	Розчинний субстрат	Рекомендована довжина хвилі, 1ІМ	Нерозчинний субстрат
Пероксидаза хрону (ПХ)	Орто- фенілендіаміндигід- рохлорид (ОФД)	492 450	Диамінобензидин (ДАБ)
	Тетраметилбензи- дин 2,2'- Азиноди- (3-зтил) бензотіазо- лінсульфонова кис­лота (АБТС)	650 (405 після зупи­нки реакції)	4-Хлор-1-нафтол (ХНФ)
	5-Аміносаліцилова кислота (АСК)	450	З-Аміно-4- етилкарбазол (АЕК)
Лужна фос­фатаза (ЛФ)	И-П- нітрофенілфосфат лужний (ПНФФ)	402-412	Нафтол Ая-шх фос­фат^ диазоль синій 2С (НАФДС)
			Нафтол Ав-шх фос- фат+диазоль черво­ний ТР (НАФДК)
			5-Бром-4-хлор-3- йодилфосфат (БХНФ)
Р- галактозидаза (3-Г)	Орто-нітрофеиіл-Р- Е)-галактозид (ОНФГ)	420
Уреаза	Бромкрезоловий пу­рпурний (БП)	588
Пеніциліназа	Йод та крохмаль	Візуальний облік розвитку синьо­го забарвлення