5.5. Кинетический вариант определения креатинина

Принцип метода: Метод основан на регистрации скорости образова­ния окрашенного комплекса креатинина с пикратом натрия в щелочной среде. Определение проводится без предварительной депротеинизации образцов по двухточечному измерению изменения оптической плотности раствора с неизвестной концентрацией креатинина и стандарта в точно фиксированные моменты времени (при 25 °С через 30 и 120 с после начала реакции).

Реактивы:

• раствор пикриновой кислоты 0,035 моль/л

• раствор гидроксида натрия, рН 13,5

• стандартный раствор креатинина, 177 мкмоль/л

Приготовление рабочего раствора. В емкости из бурого стекла смешивают растворы пикриновой кислоты и гидроксида натрия в соотношении 1: 1. Поученный раствор может быть использован через 20 мин после приготовления. Рабочий раствор, устойчивый в течение 5 ч, рекомендуется хранить в плотно укупоренной склянке при температуре не выше 25 °С, в случае выполнения измерений при 37 °С порцию рабочего раствора необходимо прогреть до соответствующе температуры.

Ход исследования.

Вначале обрабатывают стандартную пробу, после перемешивания стандарта с рабочим реагентом измеряют абсорбцию при длине волны 490—510 нм против воздуха через 30 с (А1_ст) и повторно через 120 с (А2_Ст). Рассчитывают разницу A1_CT. Аналогичную операцию выполняют с опытной пробой и находят ∆А_0П. Концентрацию креатинина в опытной пробе рассчитывают по следующей формуле:

С_оп (мкмоль/л) = ∆ А_оп × 177

∆ А_оп

При определении креатинина в моче полученный результат умножают на степень разведения.

Нормальное содержание креа­тинина в сыворотке у мужчин составляет 53—110 мкмоль/л; у женщин 44—95 мкмоль/л; в суточном количестве мочи 8,8— 15,9 ммоль/сут.

Ход определения креатинина в сыворотке крови и моче

Реактивы. мл	Опытная проба	Стандартная проба
Рабочий раствор	1,0	1,0
Стандарт	-	0,1
Сыворотка или разведенная моча в 50—100 раз	0,1	-

Клиническое значение.

Увеличение уровня креатинина в плазме (сыворотке) крови обусловлено как усиленным образованием, так и задержкой этого метаболита в организме.

Ретенционная гиперкреатининемия обусловлена нарушением (острым и хроническим) функции почек любого происхождения, в том числе из-за уменьшения фильтрации, поражения воспали­тельным процессом паренхимы почек, обтурации мочевых путей ниже уровня почек.

Продукционная гиперкреатининемия (креатининемия) отмечается при кишечной непроходимости, острой желтой атрофии печени, хлоропривной азотемии (т. е. гиперазотемии вследствие уменьшения содержания осмотически активных ионов хлора), декомпенсации деятельности ССС, пневмонии, лихорадочных состояниях. Возрастание содержания креатинина в плазме (сыворотке) крови может быть вызвано изменением эндокрин­ного баланса: при тяжело протекающем сахарном диабете, акро­мегалии и гигантизме, гипертиреозе, гипофункции надпочечни­ков, а также голодании, усиленной мышечной работе.

Снижение уровня креатинина в плазме (сыворотке) крови коррелирует с уменьшением мышечной массы (мышечные дистрофии и атрофии, параличи, парезы и др.).

В моче помимо эндогенного креатинина содержится экзогенный, поступающий в организм с мясной пищей. Поэтому уровень экскреции креатинина с мочой несколько зависит от характера питания. Увеличение выведения креатинина с мочой отмечается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях (при которых происходит повышенный распад белков протоплазмы), пневмонии, выраженной недостаточности функции печени. Увеличение экскреции креатинина с мочой происходит при ряде эндокринных расстройств (акромегалии, гигантизме, сахарном диабете, острых инфекционных заболеваниях, большой физической нагрузке). Уменьшение выведения с мочой этого компонента остаточного азота наблюдается при длительном обездвиживании больных вследствие мышечной атрофии, хронических параличей, парезов, гипертиреозе, лейкозах, амилоидозе почек, голодании.

Для диагностики поражения почек имеет значение расчет клиренса креатинина либо мочевины. В клинической практике наиболее широко применяется проба Реберга—Тареева, основанная на определении содержания креатинина в сыворотке крови и моче (часовой или суточный креатинина клиренс-тесты). При выполнении пробы мочу собирают за 2 ч (часовой) или 24 ч (суточный клиренс), сыворотку (плазму) получают в середине времени сбора мочи. До и во время проведения теста больной должен получать адекватное количество жидкости, чтобы обеспечить скорость тока мочи около 2 мл/мин. Во время исследования больной должен находиться на полупостельном режиме, исключаются медикаменты, влияющие на диурез.

Проведение 2-х часовой пробы. Обследуемый натощак выпивает 400—500 мл воды или слабого чая и мочится (эту порцию мочи выливают). Время мочеиспускания точно отмечают. Ровно через 2 ч собирают мочу. В середине этого времени пунктируют локтевую вену обследуемого и берут кровь на креатинин. В лаборатории по объему собранной мочи устанавливают минутный диурез, в крови и моче определяют концентрацию креатинина. Клиренс С и реабсорбцию R рассчитывают по формулам:

С (мл/мин) = U × V R (%) = С – V × 100 %

P C

где V — диурез за одну минуту (мл); U — концентрация креатинина в моче (мкмоль/л), Р — концентрация креатинина в крови (мкмоль/л).

Достоверность результатов возрастает при учете площади поверхности тела пациента. С этой целью вели­чину С (клиренс) умножают на поправочный коэффициент, найденный с учетом площади стандартной поверхности (1,73 м²) и площади поверхности тела пациента, рассчитанной по формуле Дюбуа или номограмме.

С окончательный (мл/мин) = C × 1,73 (м)________

поверхность тела (м²)

Для определения поверхности тела (см²) наряду с номограммой используют формулу:

Поверхность тела = 67,2 × масса в кг × рост в см.

Полученные значения делят на 10000 и находят результат в м². Клубочковая фильтрация в норме составляет 80—120 мл/мин, реабсорбция 97—99%.

Тема: Лабораторные исследования активности ферментов.

Ферменты - это белки, которые повышают скорость биохимических реакций, не расходуясь при этом, то есть биологические катализаторы. Практически все реакции в живых организмах катализируются ферментами. Теоретически, эти реакции могли бы протекать без участия ферментов, но их скорость была бы слишком низкой, что бы поддерживать жизнь. Обычно ферменты повышают скорость биохимических реакций в 10⁶ – 10¹² раз. Действие ферментов высоко специфично: каждый из них катализирует только одну или ограниченное количество сходных реакций, поэтому в каждой клетке организма находится от 1000 до 4000 ферментов (в зависимости от типа ткани). Большинство ферментативных реакций происходит внутриклеточно. Примером внеклеточных ферментативных превращений могут служить переваривание пищи в ЖКТ и каскад свертывания крови.

Ферменты существенно различаются по размеру и структуре. Самые маленькие из них представляют собой отдельные цепочки аминокислот (полипептиды), а самые большие являются комплексами, составленными из нескольких белковых субьединиц.

Холофермент – структура белок + кофактор. Кофактор ковалентно связанный с белком – называется простетическая группа, нековалентно – кофермент. В роли кофакторов выступают металлы (цинк, магний, железо, марганец и т.д.) и органические молекулы, часто представленные производными витаминов группы В и пантотеновой кислоты.

Апофермент – белковая часть фермента без кофактора. Апофермент не обладает каталитической активностью.

Изофермент – фермент существующий в двух или более структурно различающихся, но функционально идентичных формах. Изоформы связываются с одним и тем же субстратом и катализируют одну и ту же реакцию.

Свойства ферментов:

1. Ферменты обладают высокой специфичностью действия. Абсолютной специфичностью действия называют способность фермента катализировать превращение только единственного субстрата. Выделяют ферменты с относительной или групповой специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин расщепляет белки животного и растительного происхождения. Существует стереохимическая специфичность, обусловленная наличием оптически изомерных L- и D-форм или геометрических (цис- и транс) изомеров.

2. Ферменты остаются относительно неизмененными после реакции, освобождаются вновь и могут реагировать с новыми молекулами субстрата.

3. Ферменты оказывают свое действие в ничтожно малых концентрациях.

4. Скорость ферментативных реакций зависит от температуры. Оптимальной температурой для действия большинства ферментов теплокровных животных является 37-40°С. При повышении температуры, может наступить тепловая денатурация белка-фермента и быстрое падение скорости реакции. При низких температурах (0° или ниже) ферменты, как правило, не денатурируются, хотя активность их падает почти до нуля.

5. Каждый фермент проявляет максимальную активность в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов. Эта зона называется оптимумом рН.

6. При постоянной концентрации фермента и повышении количества субстрата скорость реакции повышается, достигая определенного максимума, когда дальнейшее повышение количества субстрата уже не влияет на скорость реакции. В таких случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент насыщен полностью.

7. При постоянной концентрации субстрата и повышении количества фермента скорость реакции линейно повышается.

Специфическое вещество, с которым реагирует фермент (E), называется субстратом (S), а в результате ферментативной реакции образуется продукт (P). После связывания каталитический участок фермента приближается к субстрату с образованием нестабильного комплекса фермент – продукт, который быстро диссоциирует на продукт и неизмененный фермент. Фермент может дальше реагировать с молекулами субстрата, высвобождая продукт много раз в секунду. Последовательность событий в самой простой ферментативной реакции следующая:

^{связывание катализ диссоциация}

E + S → ES-комплекс → EP-комплекс → E + P

Ферментный анализ чаще основан на измерении каталитической активности фермента, а не концентрации самого ферментного белка. Поскольку каждая молекула фермента может катализировать реакцию многих молекул субстрата, измерение активности обладает очень высокой чувствительностью. Важное значение для воспроизводимости и точности результатов имеют стандартизация и оптимизация условий тестирования.

Об активности фермента судят по скорости катализируемой реакции при определенной температуре, рН среды, концентрации субстрата, поэтому при определении активности фер­ментов необходимо строго соблюдать одни и те же условия.

Для пределения активности ферментов используют несколько способовизмереня скорости ферментативной реакции.

1. Измерение по конечной точке (с остановкой реакции).

Методзаключается в измерении оптичской плтности на линейном участке кинетической кривой по истечении определенного четко фиксированного отрезка времени t от начала реакции. По истечении указанного отрзка времени в реакционную смесь добавляют реагент, останавливающий ферментативную реакцию, например щелочь или кислоту.

Скрость изменения оптической плотности рассчитывают по формуле: ΔА/мин = (А-А_хол)/t, где А_хол – оптическая плотность холостой пробы на реагент или сыворотку, если последняя вностит значительный вклад в окраску реакционной смеси.

2. Измерение двухточечное.

При этом способе оптическую плотность определяют на линейном участке кинетической кривой дважды, четко фиксируя интервал времени t между измерениями. Скорость измерения оптической плотности рассчитывают по формуле: ΔА/мин = (А₂-А₁)/t. Этот способ используют, например, в современных методах пределения активности α-амилазы на основе блокированных мальтоз и щелочной фосфатазы.

3. Измерение многоточечное (кинетическое).

При этом способе оптическую плотность на линейном участке кинетической кривой определяют 3-5 и более раз, через четко фиксированные интервалы времени t. Скорость изменеия оптической плотности рассчитыавают по формуле: ΔА/мин. Многоточечная кинетика используется тлько для биохимических анализаторов, например, для определени активности АЛТ и АСТ ультрфиолетовыми методами.

Ферментативная реакция чувствительна к изменениям температуры. Обычно фермента­тивную реакцию принято проводить при температуре, лежащей в пределах 25—40 °С, однако при разной температуре оптимальные значения рН, концентрации буфера, субстрата и дру­гих параметров различны. Максимальная активность большинства ферментов в организме человека наблюдается при температуре около 37 °С. Поэтому в целях международной стан­дартизации температуры измерения активности ферментов используется 37 °С.

Действие ферментов можно частично или полностью подавить ингибиторами. По характеру действия ингибиторы делят на:

- необратимые – это соединения, которые могут специфически связывать определенные функционально важные группы активного центра, образуя ковалентные, прочные связи с ферментом (ингибиторы АПФ).

- обратимые – это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и только тормозят его активность, не изменяя его структуру.

Обратимое ингибирование может быть конкурентным. Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание в субстратсвязывающем участке активного центра, т.к. связывается с ферментом похожим способом, как и субстрат. Конкурентное ингибирование можно ослабить или полностью устранить, повысив концентрацию субстрата.

В сыворотке крови выделяют три группы ферментов: клеточные, секреторные и экскреторные.

Клеточные ферменты в зависимости от локализации в тканях делят на две группы:

а) неспецифические ферменты, которые катализируют общие для всех тканей реакции обмена и находятся в большинстве органов и тканей (АЛат, АСаТ, общ. ЛДГ, псевдохолинэстераза);

б) органоспецифические, или индикаторные, ферменты, специфичные только для определенного типа тканей (енолаза - нервная ткань, дегидрогеназа - печень).

Секреторные ферменты (псевдохолинэстераза, липопротеиновая липаза и др.) поступают непосредственно в плазму крови и выполняют в ней специфические функции. Эти ферменты синтезируются в печени и постоянно высвобождаются в плазму. Их активность в сыворотке крови выше, чем в клетках или тканях. В клинической практике они представляют интерес, когда их активность в сыворотке крови становится ниже нормы за счет нарушения функции печени.

Экскреторные ферменты образуются органами пищеварительной системы (поджелудочной железой, слизистой оболочкой кишечника, печенью, эндотелием желчных путей). К ним относятся альфа-амилаза, липаза, щелочная фосфатаза и др. В норме их активность в сыворотке крови низка и постоянна. Однако при патологии, когда блокирован любой из обычных путей экскреции, активность этих ферментов в сыворотке крови значительно увеличивается.

Из 4000 ферментов человеческого организма в повседневной лабораторной практике определяют активность около 25. Почти все они являются внутриклеточными. В норме, относительно небольшое количество ферментов, присутствующих в крови, поступает туда вследствие процесса клеточного обновления (когда клетка погибает, ее содержимое, в том числе и внутриклеточные ферменты, попадают в плазму крови). Пока скорость удаления ферментов из плазмы соответствует медленному высвобождению их из гибнущих клеток в процессе нормального обновления, концентрация ферментов в плазме остается низкой и постоянной.

В норме ферменты с низкой молекулярной массой удаляются в процессе почечной фильтрации и выделяются с мочой. Большинство же ферментов разрушается в ретикулоэндотелиальной системе.

Основные классы и подклассы ферментов

Класс	Реакции	Основные подклассы
Оксидоредуктазы	Окислительно-восстановительные	Дегидрогеназы, оксидазы, редуктазы, гидроксилазы
Трансферазы	Перенос групп	Киназы, трансаминазы
Гидролазы	Гидролиз связей (эфирных, пептидных, гликозидных, связей С-С, Р-N)	Эстеразы, фосфатазы, протеазы,липазы, нуклеазы
Лиазы	Разрыв связей С-С, С-О, С- N, С-S	Альдегидлиазы, дегидратазы, карбоксилазы
Изомеразы	Взаимопревращение изомеров А→изоА	Изомеразы, мутазы
Лигазы	Соединение двух молекул, сопряженное с гидролизом АТР	Карбоксилазы, синтетазы

Известны три типа изменений активности ферментов при патологии: повышение активности ферментов, снижение (по сравнению с нормой) и появление в крови ферментов, в норме не обнаруживаемых.

Ферменты, которые обычно используют как клинический маркер повреждения клеток, являются органоспецифическими лишь до некоторой степени. Это означает, что хотя они находятся в нескольких тканях, их наибольшая концентрация наблюдается только в одной. Поэтому повышение в плазме уровня какого-либо определенного фермента указывает на повреждение клеток той ткани, в которой этот фермент представлен в наибольшем количестве.

Как правило, концентрация ферментов в биологических жидкостях невелика и не может быть определена методами количественного анализа. Поэтому определяют не концентрацию самого фермента, а его активность, о которой судят по количеству субстрата, превращенного ферментом в продукт реакции в единицу времени.

За 1 единицу активности фермента Международный биохимический союз предложил принимать количество молей субстрата, превращенное ферментом за 1 с.

Эта единица называется катал: кат = моль/с.

Так как активность чаще всего исследуют в биологической жидкости, то добавляют еще – в литре: кат/л = моль/(с. л.).

Эта величина слишком большая для секунд, поэтому используют дробные величины: мккат, мкмоль и т.д. (10^-3 – ммоль, 10^-6 – мкмоль, 10^-9 – нмоль): мккат/л = мкмоль/(с.л.)

Активность фермента также выражают международной единицей – Е/Л. Международная единица Е/Л определяет количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин: Е/Л = мкмоль/(мин.л)

Для перевода одних единиц активности ферментов в другие в практической деятельности пользуются следующими формулами:

1мккат/л = 3,6ммоль/(ч.л.) = 60Е/Л

1Е/Л = 0,06ммоль/(ч.л.) = 16,67нмоль/(с.л.)

0,06ммоль/(ч.л.) = 0,28мккат/л

Методы исследования ферментов могут быть подразделены на 2 основные группы:

а)колориметрические методы, основанные на инкубации сыворотки с субстратом в соответствующем буфере в течение определенного времени, по истечении которого ферментативную реакцию останавливают, и образующие продукты определяют при помощи подходящей химической реакции либо замеряют количество оставшегося субстрата;

б)спектрофотометрические методы, с помощью которых непрерывно или периодически в ходе ферментативной реакции определяют потребление субстрата или кофермента либо образование продукта. Эти методы часто называются кинетическими, поскольку измерения каталитической активности зависят от кинетики непрерывной регистрации реакции. Большинство кинетических методов основаны на оптическом тесте Варбурга с применением пиридинкоферментов НАД и НАДН₂ (изменение их концентрации в видимой части спектра пропорционально активности фермента). На этом принципе основано определение активности АЛТ, АСТ, ЛДГ.

Ферменты исследуют в клинической практике для решения различных задач: установле­ния диагноза, проведения дифференциальной диагностики, оценки динамики течения бо­лезни, определения эффективности лечения и степени выздоровления; с прогностической целью. Известны три типа изменений активности ферментов при патологии: гиперфермен-темия — повышение и гипоферментемия — снижение активности ферментов по сравнению с нормой, дисферментемия — появление в крови ферментов, в норме не обнаруживаемых.

1.ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ.

1. Изучить правила подготовки пациента, забора и транспортировки материала для исследования активности ферментов.

2. Освоить методы исследования активности ферментови дать их аналитическую оценку.

2. СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ.

2.1.Тестовый контроль исходного уровня знаний.

2.2.Разбор теоретического материала по теме занятия.

2.3. Лабораторная работа: «Определение активности АЛТ и АСТ, щелочной фосфатазы и α-амилазы».

3. ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ.

3.1. Биологическая функция ферментов. Определение и свойства ферментов.

3.2. Классификация ферментов. Единицы обозначения активности ферментов. Клинико-диагностическое значение определения активности ферментов.

3.3. Методы исследования ферментов.

3.3. Определение активности аминотрансфераз.

3.4. Определение активности фосфатаз.

3.5. Определение активности α-амилазы в сыворотке крови и моче

4.ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ.

4.1. Методы определения активности липазы.

4.2. Методы определения активности холинестеразы.

5. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.