- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1 Анализ путей метаболизма
1.1 Общие методы
1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
В процессе катаболизма некоторых субстратов растущими или покоящимися бактериальными клетками в среде могут накапливаться промежуточные продукты, где их легко идентифицировать различными химическими, хроматографическими или радиоизотопными метода ми. Один или несколько промежуточных продуктов будут накапливаться в том случае, если скорость их синтеза превышает скорость диссимиляции в ходе последующих реакций определенного пути метаболизма. Когда происходит исчерпание исходного субстрата, накопление часто сопровождается потреблением.
Например, культуры Е. coli, растущие на богатой среде с глюкозой в качестве основного источника углерода и энергии, накапливают и затем утилизируют пируват. С помощью такого типа исследований получена существенная информация о путях метаболизма, связанных с разложением ароматических веществ.
1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
В исследованиях путей метаболизма широко используются ингибиторы. При добавлении в культуру ингибитора какого-либо этапа пути метаболизма может происходить накопление одного или нескольких метаболитов, образовавшихся до этого этапа, которые благодаря такому накоплению легко идентифицировать. Получаемую при этом информацию можно использовать для установления последовательности реакций. Например, наши знания о химической природе стенок микробных клеток основаны на том наблюдении, что при обработке клеток Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis или Е. coli такими антибиотиками, как пенициллин, бацитрацин или циклосерин, накапливаются различные нуклеотиды, участвующие в биосинтезе клеточных стенок. Если ингибиторы (метаболические яды) оказываются эффективными в подобных исследованиях, очевидно, клетки должны быть проницаемыми для них. При оценке данных, получаемых с использованием ингибиторов, всегда следует проявлять осторожность, поскольку могут существовать неизвестные этапы ингибирования.
1.1.3 Использование аналогов субстрата
Ферменты определенного пути метаболизма могут различаться по субстратной специфичности. Например, может оказаться, что первые три фермента способны взаимодействовать с аналогом природного субстрата, а четвертый - нет. В этом случае будет накапливаться частично метаболизированный аналог, который несложно идентифицировать, благодаря чему легче определить место соответствующих реакций в цепи метаболизма.
1.1.4 Одновременная адаптация
Метод одновременной адаптации основан на следующем логическом построении. Если индуцибельный диссимиляционный путь (например, АBСDцикл трикарбоновых кислот) индуцируется необходимым для роста субстратом А, у клеток развивается способность к диссимиляции метаболитов В, С, D, так же как и А, но не других веществ, не являющихся промежуточными продуктами этого пути метаболизма. Если, например, путь включает окисление всех указанных компонентов, можно ожидать окисления (измеряемого с помощью аппарата Варбурга или кислородного электрода) субстратов А, В, С и D, но не Е, F и G, если только клетки не способны конститутивно утилизировать одно или несколько из последних веществ. Такую способность можно определить с помощью теста на их окисление, используя клетки, выращенные не на субстрате А. Не исключено, однако, что субстраты В, С или D, являясь компонентами пути, не могут проникать в клетки и вследствие этого не будут подвергаться окислению. Для определения этой возможности необходимо использовать клеточные экстракты или пермеабилизованные клетки, обработанные с целью повышения проницаемости.