- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
1.2.1 Аденилирование
Глутаминсинтетаза занимает центральное место в метаболизме азота у Е. coli и других бактерий. Это проявляется в том, что и синтез, и каталитическая активность этого фермента контролируются множеством процессов. Его синтез регулируется с помощью репрессии/дерепрессии, а активность - рядом конечных продуктов через сложный путь различных эффекторов, а также с по мощью ковалентной модификации. В этой модификации участвует сложная система активирующих и инактивирующих ферментов, а также различные эффекторы. Инактивацию глутаминсинтетазы путем аденилирования можно продемонстрировать in vitro и in vivo. Последний вариант осуществили в условиях аммиачного «шока» следующим образом.
Дикий штамм Е. coli вырастили в минеральной среде с добавлением 0,4% глюкозы в качестве источника углерода и 0,2% L-глутамина в качестве источника азота до середины фазы экспоненциального роста. Отобрали пробу для анализа, а оставшуюся культуру разделили на две части. Одну часть оставили необработанной, а ко второй добавили 15 мМ. (конечная концентрация) (NH4)2SO4. Инкубацию продолжали 5-10 мин, затем пробы отобрали для обработки бромидом гексадецилтриметиламмония и анализировали на глутаминсинтетазную активность с помощью глутамилтрансферазного теста с использованием целых клеток. Каждую пробу (10 мл) сразу же вносили в колбу, содержащую бромид гексадецилтриметиламмония с конечной концентрацией 90 мкг/мл, встряхивали 1—3 мин при 30°С и готовили для определения активности фермента. Активность фермента определяли в присутствии и в отсутствие 60 мМ MgCl2, как указано в методике, для того чтобы установить степень ковалентной модификации в результате аммиачного «шока». Известно, что и у Е. coli, и у К. aerogenes присутствие NH4+ способствует аденилированию глутаминсинтетазы.
2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
Пригодность микроорганизма для конкретного исследования определяется в основном его генетическими возможностями. Иногда можно изменить генетический потенциал в соответствии с исследовательской задачей. Это делают путем получения и отбора подходящих мутантных штаммов. Отбор таких мутантов - чрезвычайно важная процедура, ставшая одним из основных элементов методического багажа бактериолога.
Даже если генетические возможности микроорганизма позволяют ему продуцировать определенный фермент, при этом еще не гарантируется его синтез (транскрипция и трансляция). Синтез многих ферментов и ферментных систем зависит от присутствия или отсутствия определенных регуляторных компонентов, или «триггеров», образующихся эндогенно или вносимых в культуральную среду. Вещества, стимулирующие транскрипцию, называют индукторами, а сам процесс стимуляции называют индукцией. В тех случаях, когда индукторов нет, говорят о деиндукции. Другие вещества, называемые репрессорами, напротив, предотвращают транскрипцию, а сам процесс предотвращения транскрипции называют репрессией; в отсутствие репрессора происходит дерепрессия. Описаны различные типы репрессии у бактерий: простая репрессия по типу обратной связи, или репрессия конечным продуктом; мультивалентная репрессия, присущая определенным ферментам, участвующим в синтезе аминокислот с разветвленной цепью; координированная репрессия, когда все ферменты, участвующие в биосинтезе, согласованно репрессируются в присутствии высоких концентраций продукта реакции (например, триптофана или гистидина). Описанные ниже эксперименты иллюстрируют некоторые типы регуляции синтеза бактериальных ферментов путем индукции и репрессии.