2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества

Клетки можно элюировать с фильтра, ресуспендировать до известного объема и определять содержание в них изучаемого вещества химическим или радиометрическим способом.

При использовании радиоактивных растворенных веществ чаще всего фильтры высушивают и помещают прямо в сцинтилляционную жидкость для счета импульсов. Можно также определить количество растворенного вещества, включенного в основные биополимеры, обработав клетки на фильтре охлажденным раствором ТХУК и промыв затем водой перед высушиванием. Удобно пользоваться фильтрами, растворяющимися в сцинтилляционной жидкости или в растворителе, смешивающемся с этой жидкостью. Подробно об этом можно прочитать в проспектах фирм или статьях по сцинтилляционному счету.

2.2.2. Общие замечания

Главное преимущество использования разбавленных клеточных суспензий — легкость получения данных по кинетике. Кроме того, в таких суспензиях легче контролировать рО₂, рН, ионную силу и т. п., а также поддерживать почти постоянную концентрацию растворенного вещества в суспендирующей среде. Однако этот подход не лишен недостатков. К ним относятся трудности, связанные с выходом растворенного вещества из клеток во время первичного суспендирования или промывания; необходимость определить поглощение или потери растворенного вещества путем измерения его внутриклеточной, а не внеклеточной концентрации; и наконец, то, что в разбавленных суспензиях клетки могут быть весьма чувствительны к изменениям условий среды.

2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма

2.3.1. Определение протонодвижущей силы

Протонодвижущую силу считают одним из основных средств преобразования и переноса энергии в биологических системах. Ее определяют по формуле:

где р - протонодвижущая сила, _ - мембранный потенциал, R - газовая постоянная, Т - температура по Кельвину, F- число Фарадея и рН - разность рН внутри и вне клетки. При температуре около 25°С величина 2,3 RT/F (часто обозначаемая z) составляет ~59 мВ. Таким образом, для определения р необходимо независимо определить _ и рН.

Методы определения _ обычно включают в себя оценку распределения какого-либо иона, который свободно проходит через клеточную мембрану. Например, можно использовать для вычисления _ распределение хлорид-иона. Величина _ в этом случае равна:

2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],

где (С1_внешн) и (С1_внутр) - концентрации хлорид-иона вне и внутри клетки.

В последние годы разработаны методики определения внутриклеточного рН у бактерий с помощью ядерного магнитного резонанса. Можно также определять рН_i, используя флуоресцентные красители, такие, как пирамин. Зная рН_i, легко определить рН₀ с помощью стеклянного электрода и затем вычислить ∆рН.

2.3.2 Осмотически чувствительные клетки

Поглощение клеткой растворенного вещества приводит к снижению активности воды внутри клетки и по следующему притоку воды извне, в результате чего клетка набухает. Биологические мембраны хорошо пропускают воду, и набухание происходит чрезвычайно быстро. Например, методом остановленной струи установлено, что осмотический выход воды из клеток Е. coli, помещенных в 0,4 М раствор MgCl₂, завершается при 37°С за 50 мс.