1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
Принципы, лежащие в основе применения ауксотрофных мутантов для изучения различных метаболических путей, в частности путей биосинтеза, хорошо известны, а подробности отбора и использования таких мутантов изложены в лекциях. Рассмотрим последовательность пути биосинтеза:
A
B
C
D
E
где Е - конечный продукт, необходимый для роста культуры.
Любая мутация, влияющая на фермент Е1, Е2, Е3 или Е4, приведет к остановке роста культуры, если только не будет обеспечено поступление соответствующего метаболита из другого источника. Этот мета болит, естественно, должен транспортироваться в клетки. Метаболиты, образующиеся перед поврежденной стадией, при наличии достаточных количеств ростовых субстратов будут накапливаться в высоких концентрациях. Идентификация накапливающихся метаболитов и метаболитов, стимулирующих рост мутантных клеток, наряду с соответствующими исследованиями фермента может дать существенную информацию о последовательности реакций данного пути метаболизма. Такие методики с использованием мутантов с большим успехом применяются при изучении синтеза аминокислот с разветвленной цепью, в том числе ароматических аминокислот.
1.2 Баланс изотопного углерода
1.2.1 Общие замечания
Представьте следующую гипотетическую ситуацию: вы выделяете культуру новой бактерии, о которой не знаете ничего, кроме того, что она растет в комплексной среде неопределенного состава, содержащей глюкозу. Ваша задача - описать в общих чертах пути метаболизма этой бактерии. Как бы вы приступили к решению этой задачи? Прежде всего возникают вопросы: какие биоэнергетические пути использует бактерия; какое количество углерода глюкозы ассимилируется при биосинтезе, если только это вообще имеет место; в какие макромолекулярные компоненты включается углерод? Что бы справиться с поставленной задачей, потребуется ответить на все эти вопросы (как и на многие другие, естественно). Экспериментальное определение радиоизотопного баланса служит серьезным фундаментом, на основе которого можно сделать попытку решить эту задачу. Культуру выращивают в течение времени, достаточного для диссимиляции 30-70% добавляемой глюкозы, меченной 14С (равномерно или специфически в положениях С-1, С-3,4 или С-6). В конце выращивания подводят баланс 14С. Полученные при этом данные служат отправной точкой в определении путей метаболизма.
1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
Концентрацию глюкозы в начале и в конце периода роста культуры определяют с помощью любой стандартной методики. Разность этих величин равна количеству глюкозы, потребленной клетками. Поскольку удельная радиоактивность глюкозы известна, можно вычислить процент суммарной активности культуры в минуту, приходящейся на неиспользованную глюкозу. Следовательно, остальная радиоактивность приходится на СО2, не газообразные конечные продукты и углерод, ассимилированный клетками.
1.2.3 Определение ассимилированного 14с
Готовят различные разведения вышеуказанной культуры, фильтруют их через мембранные фильтры (с размером пор 0,45 мкм), промывают и затем измеряют общую радиоактивность, которая соответствует радиоактивному углероду, включенному в клетки.