- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1.3 Наличие ключевых ферментов
Другой необходимый этап работы, направленный на выявление какого-либо пути метаболизма, заключается в определении тех ферментов, которые отличают один путь от другого, т. е. являются ключевыми ферментами того или иного пути метаболизма. Разработаны методики определения ключевых ферментов, участвующих во многих классических путях диссимиляции углеводов (табл. 2).
Таблица 2 - Ключевые ферменты путей метаболизма
Пути метаболизма |
Ключевые ферменты |
Путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолитический путь) |
Киназы, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза |
Гексозомонофосфатный и пентозофосфатный пути |
Глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа, трансальдолаза, транскетолаза |
Фосфокетолазный путь |
Фосфокетолаза |
Путь Энтнера-Дудорова |
Фосфо-2-кето-3-дезоксиглюконат-альдолаза |
Прямое окисление |
Глюкозо- и глюконатдегидрогеназы |
Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса), глиоксилатный цикл |
Цитрат- синтат, цитрат-оксалацетат лиаза-лиаза, аконитат-гидратаза, α-кетоглутаратдегидрогеназа, липоилредуктазотранссукцинилаза, липоамид-дегидрогеназа (NAD+), сукцинил-СоА-синтетаза, сукцинил-СоА-гидролаза, фумарат-гидратаза, малатдегидрогеназа, изоцитрат-лиаза, малатсинтаза, система пируватдегидрогеназы |
Метаболизм СО3 |
Различные карбоксилазы, декарбоксилазы и др. |
2 МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ И ТРАНСПОРТА
Хотя детали прохождения растворенных веществ через барьеры проницаемости бактериальных клеток на молекулярном уровне по существу неизвестны, все же можно различать процессы двух основных типов - пассивное проникновение и (активный) транспорт.
Проникновение - это пассивный переход растворенного вещества внутрь клетки (поглощение) или из клетки наружу (выделение) путем диффузии, которому может способствовать химическое взаимодействие между растворенным веществом и какой-либо клеточной структурой, например мембраной. Клетка может быть проницаемой или непроницаемой для данного вещества. Проницаемость - это свойство клетки, а не растворенного вещества.
Транспорт - это процесс активного перемещения растворенного вещества в клетку или из клетки, который связан с метаболизмом и в котором могут участвовать энергизованные переносчики. У бактерий наиболее изучены два класса транспортных систем - фосфотрансферазные и так называемые пермеазные системы. Фосфотрансферазная система встречается главным образом у факультативных анаэробов и предназначена для транспорта сахаров, тогда как пермеазные системы для транспорта аминокислот, сахаров, неорганических ионов и предшественников нуклеиновых кис лот имеются почти у всех бактерий.
Кривая, описывающая ход поглощения растворенного вещества во времени, для процессов транспорта качественно не отличается от аналогичной кривой для пассивного проникновения. Однако активное поглощение не прекращается при Свнутр = Свнешн, продолжается - теперь уже в форме так называемого концентрирующего транспорта - до тех пор, пока будет создан значительный градиент концентрации. Максимальное поглощение определяется соотношением между скоростями процессов, направленных внутрь и наружу.