- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
Для определения треониндегидратазы (синтезирующего фермента Е. coli) можно использовать клеточные экстракты или лизированные клетки. Способность L-изолейцина аллостерически ингибировать этот фермент можно продемонстрировать в следующем эксперименте.
Пробирки с компонентами, перечисленными в табл. 1, инкубируют при 37°С до 20 мин (в зависимости от активности экстракта). Затем реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 50%-ной (вес/объем) ТХУ. Отбирают часть реакционной смеси (опять же в зависимости от активности фермента) и разбавляют ее водой до 1,0 мл. Добавляют 3,0 мл 0,025%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 0,5 М НС1 и оставляют смесь при комнатной температуре на 15 мин. Добавляют 1 мл 40%-ной КОН, встряхивают и измеряют оптическую плотность в колориметре Клетта - Саммерсона (фильтр 54) или в любом другом спектрофотометре или колориметре при 540 нм.
Таблица 1 – Приготовление проб для демонстрации ингибирования треониндегидратазы L-изолейцином
Компонент |
Количество, мл |
|||
пробирка 1 |
пробирка 2 |
пробирка 3 |
пробирка 4 |
|
Трис·HCl, pH 8,1 M |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
NH4Cl, 1M |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
Пиридоксальфосфат 1М |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
L-Треонин, 0,2 М |
0,2 |
0,2 |
0,2 |
0,0 |
Изолейцин |
0,0 |
0,1а |
0,1а |
0,0 |
Экстракт |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
Вода |
0,4 |
0,3 |
0,3 |
0,6 |
а Концентрация изолейцина в пробирке 2 равна 10 мМ, а в пробирке 3 – 1 мМ. |
||||
Количество микромолей -кетобутирата, образовавшегося в реакционной смеси, определяют по ранее полученной калибровочной кривой. При такой постановке пробы могут содержать разное количество субстрата и эффектора. Результаты откладывают в виде кривой.
1.1.2 Аллостерическая регуляция с помощью энергетического заряда
Аткинсон предположил, что различные ключевые ферменты, участвующие в биоэнергетических и биосинтезирующих процессах, аллостерически регулируются в ответ на энергетический заряд клетки. Энергетический заряд равен сумме молярной фракции АТР и половины молярной фракции ADP (поскольку 2 моля ADP можно преобразовать в 1 моль АТР через аденилаткиназу), деленной на общее количество молей аденилатов:
Энергетический заряд = (АТР + 1/2ADP)/(ATP + ADP + AMP).
Для измерения ответа фермента на изменения энергетического заряда готовят реакционную смесь с постоянным суммарным содержанием аденилатов (АТР + ADP + AMP) при нужных значениях энергетического заряда. Величина этого пула у различных видов клеток обычно варьирует от 2 до 5 мМ. Для получения трехкомпонентной смеси с заданной величиной энергетического заряда к смеси АМР - АТР добавляют молярную фракцию АТР, соответствующую необходимой величине энергетического заряда, а также аденилаткиназу и инкубируют достаточно долго для установления равновесия Используют различные концентрации Mg2+ и субстрата(ов). Присутствие субстрата в различных концентрациях необходимо потому, что наиболее распространенным ответом ферментов на изменение энергетического заряда является, по-видимому, изменение сродства к одному или нескольким субстратам.
Начальную скорость реакции при каждой концентрации субстрата можно отложить на графике в виде функции энергетического заряда. Совокупность таких АТР кривых для каждой концентрации субстрата отражает влияние энергетического заряда на изучаемый фермент.