3. Решение расчётных задач

Расчётные задачи выбираются и решаются из числа приведённых в ПРИЛОЖЕНИИ 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИМЕРЫ РАСЧЁТНЫХ ЗАДАЧ

РАСЧЁТ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПЕПТИДОВ ПРИ ТРАНСЛЯЦИИ мРНК.

Задача. Предскажите аминокислотную последовательность пептидов, синтезируемых в рибосомах в присутствии следующих матриц, считая, что считывание начинается с первого триплета на левом конце.

а) GGUCAGUCGCUCCUGAUU

б) UUGGAUGCGCCAUAAUUUGCU

в) CAUGAUGCCUGUUGCUAC

г) AUGGACGAA

Решение. a) Gly—Gin—Ser—Leu—Leu—He;

б) Leu—Asp—Ala—Pro;

в) His—Asp— Ala—Cys—Cys—Tyr;

г) Met—Asp—Glu у эукариот;

fMet—Asp—Glu у прокариот.

РАСЧЁТ ЧИСЛА РАЗНЫХ мРНК, КОТОРЫЕ МОГУТ КОДИРОВАТЬ ОДИН ПОЛИПЕПТИД

Задача. Сколько разных мРНК может кодировать одну аминокислотную последовательность?. В качестве дополнительной иллюстрации к рассмотренному в предыдущей задаче вопросу напишите все возможные последовательности мРНК, которые способны кодировать простой трипептид Leu-Met-Туr.

Решение. UUAAUGUAU, UUGAUGUAU, CUUAUGUAU, CUCAUGUAU, CUAAU-GUAU, CUGAUGUAU, UUAAUGUAC, UUGAUGUAC, CUUAUGUAC, CUCAU-GUAC, CUAAUGUAC, CUGAUGUAC.

РАСЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ ТРАНСКРИБИРОВАНИЯ ЦЕПИ ДНК

Задача. Транскрибируемая цепь двухцепочечной ДНК содержит последовательность

(5') CTTAACACCCCTGACTTCGCGCCGTCG

а) Какая последовательность мРНК может транскрибироваться с этой цепи?

б) Какая аминокислотная последовательность могла бы кодироваться этой последовательностью при считывании с 5'-конца?

в) Предположим, что другая цепь этой ДНК тоже транскрибируется, а полученная мРНК транслируется. Совпадает ли полученная аминокислотная последовательность с последовательностью, которую вы привели в ответе на вопрос б)? Объясните биологическое значение ваших ответов на вопросы б) и в).

Решение. а) (5') CGACGGCGCGAAGUCAGGG-GUGUUAAG (3').

б) Arg—Arg—Arg—Glu—Val—Arg— Gly—Vab-Lys.

в) Нет, так как комплементарные антипараллельные цепи в двухцепочечной ДНК имеют разные последовательности оснований в направлении 5'3'. РНК транскрибируется только с одной определенной цепи двухцепочечной ДНК. Поэтому РНК-полимераза должна узнавать нужную цепь и связываться с ней.

РАСЧЁТ СОСТАВА АНТИКОДОНОВ, ИСХОДЯ ИЗ КОДОНОВ

Задача. Большинству аминокислот соответствует больше чем один кодон, больше чем одна тРНК и больше чем один антикодон. Напишите все возможные антикодоны для четырех глициновых кодовое:

(5') GGU (3'), GGC, GGA и GGG.

а) На основании вашего ответа скажите, какие из положений антикодона определяют в первую очередь его специфичность в случае глицина?

б) Какие из кодон - антикодоновых пар содержат «качающуюся» пару оснований?

в) В какой из кодон - антикодоновых пар все три пары оснований образованы за счет прочных уотсон - криковских водородных связей?

г) Использование какой из кодон - антикодоновых пар в биологическом синтезе белка наименее вероятно? Почему?

Решение. Глициновые Узнаются антикодонами

кодоны

(5')GGU (5')ACC и (5')GCC

GGC GCC ICC

GGA UCC ICC

GGG CCC UCC

а) На 5'-конце и в середине антикодона.

б) «Качающиеся» пары оснований будут образовывать со своими кодонами анти-кодоны (5')GCC, ICC и UCC.

в) В парах, в образовании которых принимают участие антикодоны (5')ACG, GCC, UCC и CCC.

г) Наименее вероятно использование пар, в которых участвуют антикодоны, указанные в п.

в), поскольку тРНК, содержащие эти антикодоны, из-за прочного связывания всех трех антикодоно-вых оснований будут освобождаться из комплекса с более низкой скоростью, чем другие тРНК для Gly.

РАСЧЁТ ВЕСА И ОБЪЁМА ОСАДКА ПОСЛЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ

Объем осадка бактериальных клеток можно легко определить с помощью стандартного пикнометра или мерной колбы. Пусть, например, нужно измерить объем клеточного осадка весом около 3 г. Тогда осадок можно смешать с водой и перенести в 50 мл тарированный пикнометрический сосуд или мерную колбу, а затем довести до нужного объема водой. Допустим, что вес суспензии, определенный с по мощью аналитических весов, равен 50,110 г (вес смеси и пикнометра минус вес пикнометра), а откалиброванный объем пикнометра равен точно 50,000 мл при 25°С (температура взвешивания). Предположим также, что вес осадка, найденный с помощью аналитических весов, составляет ровно 3,000 г. Тогда вес воды, добавленной к осадку, должен быть равен (50,110-3,000) г, т. е. 47,110 г. При 25°С такой вес воды занял бы объем 47,249 мл, что можно определить по плотности воды при этой температуре, указанной в стандартных химических справочниках. Следовательно, объем осадка равен 50,000-47,249, или 2,751 мл. Тогда плотность составит 3,000 г/2,751 мл, или 1,090 г/мл. При известной плотности и стандартных условиях центрифугирования можно легко вычислить объем осадка по его весу.

РАСЧЁТ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОК

Наиболее распространенный, по крайней мере в бактериологии, показатель проницаемости - это величина занимаемого пространства S, которую можно вычислить по формуле:

где V_s - объем раствора, добавленного к осадку, У_р - объем осадка (часто вместо этой величины используют W_p - вес влажного осадка), С₀ - начальная концентрация растворенного вещества и C_f - его конечная концентрация.

Значения S отражают долю объема клеточного осадка, в которую проникает растворенное вещество.

Однако нас интересует доля действительного объема самих клеток, а не осадка, т. е. значение R. Его вычисляют по формуле:

R = (S_sol - S_dex)/(1 - S_dex)

где S_sol - объем, занимаемый исследуемым растворенным веществом, a S_dex - объем «декстранового», или межклеточного, пространства.

Нулевая величина R означает, что клетки непроницаемы для растворенного вещества. Величины R от 0 до 1 означают различную степень проницаемости. R>1 означает, что растворенное вещество концентрируется в клетках.

При использовании веса осадка как меры его объема обозначения S и R часто сопровождают индексом w. Кроме того, часто желательно бывает отнести полученный результат к единице веса клеток или объема клеточной воды, например указать клеточный объем, проницаемый для сахарозы, на 1 г сухого веса клеток или на 1 мл клеточной воды.

Определение объема клеток. Из найденных значений занимаемого объема (S) можно извлечь полезную цитологическую информацию, например получить наиболее точные данные о средней величине клеток той или иной бактерии. Разность между объемом осадка и межклеточным объемом равна объему клеток. Если осадок ресуспендировать в воде до определенного объема (скажем, 50 мл) в мерной колбе, то можно определить число клеток с помощью камеры Петрова-Хауссера, а затем вычислить средний объем клетки. Этот метод можно также использовать для определения объема протопласта в клетке.

Определение содержания воды в клетке. Ресуспендированные клетки можно также использовать для определения их сухого веса, что позволяет вы числить сухой вес отдельной клетки. Количество клеточной воды равно разности между сырым и сухим весом клетки. Поскольку вес или объем межклеточной воды известен, можно определить количество клеточной воды по количеству воды в осадке.

Иногда удобно определять содержание воды в клетках непосредственно по значению R для таких растворенных веществ, как ²Н₂, ¹⁴С-мочевина или ¹⁴С-глице-рин, которые легко проникают в покоящиеся клетки, но не концентрируются в них. Иногда для определения количества клеточной воды используют и воду, меченную тритием, но необходимо помнить, что тритий может быстро обмениваться на обычный водород различных клеточных полимеров и мономеров, особенно содержащих ионизируемые компоненты.

РАСЧЁТ ХАРАКТЕРИСТИК ТРАНСПОРТНОГО ПРОЦЕССА

Поглощение или выход веществ обычно выражают в пересчете на единицу веса или объема клеток или объема клеточной воды. Результаты исследования транспортных процессов можно также относить к одной клетке, что позволяет сравнивать способность различных клеток к транспорту. Чаще всего пользуются пересчетом на клеточную воду.

Полезно также определить соотношение концентраций испытуемого растворенного вещества внутри клетки и в суспендирующей среде, чтобы выяснить, имел ли место концентрирующий транспорт.

Рис. 1. Графическая оценка вклада диффузии в общее поглощение растворенного вещества бактериальными клетками.

Поглощение, обусловленное транспортом, равно разности между общим и пассивным поглощением. Его можно измерять либо скоростью процесса, либо общим количеством поглощенного вещества

При использовании растворенных веществ с радиоактивной меткой весьма желательно переводить результаты счета импульсов в молярные единицы.

Транспортные процессы обычно рассматривают как подклассы реакций, катализируемых ферментами, по этому здесь применимы принципы и методы изучения ферментативной кинетики. Например, график двойных обратных координат Лайнуивера - Бэрка, отражающий зависимость величины, обратной скорости транспорта, от величины, обратной концентрации растворенного вещества, часто представляют собой прямые линии, позволяющие вычислить значения К_м (константы Михаэлиса) и V_max (максимальной скорости). Можно также построить кривые Эдди-Хофсти, отражающие отношение скорости транспорта к скорости, деленной на концентрацию субстрата. Затруднения, возникающие при исследовании кинетики ферментов, встречаются и при изучении транспорта.

Нередко у клеток имеется не одна транспортная система для данного растворенного вещества. Например, многие бактерии обладают высокоаффинной транс портной системой, весьма специфичной для какой-то одной ароматической аминокислоты, а также намного менее специфичной низкоаффинной системой.

Многие растворенные вещества могут проникать в клетки как пассивно, путем диффузии, так и в результате активного транспорта. При высоких концентрациях субстрата диффузионные процессы обычно не приводят к насыщению; их вклад можно оценить по графику типа представленного на рис. 1. Если клетки интактны, процесс диффузии может включать диффузию растворенного вещества в воду клеточной стенки, которая у таких организмов, как Micrococcus lysodeikticus (М. luteus), может составлять около 50% объема клетки.

РАСЧЁТ ВЕЛИЧИНЫ ПРОТОНОДВИЖУЩЕЙ СИЛЫ

Протонодвижущую силу определяют по формуле:

где р - протонодвижущая сила, _ - мембранный потенциал, R - газовая постоянная, Т - температура по Кельвину, F- число Фарадея и рН - разность рН внутри и вне клетки. При температуре около 25°С величина 2,3 RT/F (часто обозначаемая z) составляет ~59 мВ. Таким образом, для определения р необходимо независимо определить _ и рН.

Методы определения _ обычно включают в себя оценку распределения какого-либо иона, который свободно проходит через клеточную мембрану. Например, можно использовать для вычисления _ распределение хлорид-иона. Величина _ в этом случае равна: